Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Elektrofysiologiske metoder for måling av fotopigmentnivåer i Drosophila fotoreceptorer

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63514
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Summary

Vi presenterer en protokoll for elektrofysiologisk karakterisering av bistabile fotopigmenter: (i) utnyttelse av ladningsforskyvningene i fotopigmentmolekylene etter fotonabsorpsjon og deres enorme mengde i fotoreseptorene, og (ii) utnyttelse av absorpsjonsspektraforskjellene i rhodopsin og metarhodopsin fotopigmenttilstander. Disse protokollene er nyttige for å skjerme for mutasjoner som påvirker bistabile fotopigmentsystemer.

Abstract

Drosophila G-proteinkoblet fotopigment rhodopsin (R) består av et protein (opsin) og en kromofor. Aktiveringsprosessen av rhodopsin initieres ved fotonabsorpsjonsinduserende isomerisering av kromoforen, fremmer konformasjonsendringer av opsinet og resulterer i en andre mørkstabil fotopigmenttilstand (metarhodopsin, M). Undersøkelse av dette bistabile fotopigmentet ved hjelp av tilfeldig mutagenese krever enkle og robuste metoder for screening av mutantfluer. Derfor er det utviklet flere metoder for å måle reduksjoner i funksjonelle fotopigmentnivåer. En slik metode utnytter ladningsforskyvningene i fotopigmentet etter fotonabsorpsjon og de enorme mengdene fotopigmentmolekyler uttrykt i fotoreceptorene. Dette elektriske signalet, kalt det tidlige reseptorpotensialet (eller tidlig reseptorstrøm), måles ved hjelp av en rekke elektrofysiologiske metoder (f.eks. Elektroretinogram og helcelleopptak) og er lineært proporsjonal med funksjonelle fotopigmentnivåer. Fordelene ved denne metoden er det høye signal-til-støy-forholdet, direkte lineær måling av fotopigmentnivåer og uavhengighet av fototransduksjonsmekanismer nedstrøms til rhodopsin- eller metarhodopsinaktivering. En ekstra elektrofysiologisk metode kalt langvarig depolariserende etterpotensiell (PDA) utnytter bistabiliteten til Drosophila fotopigment og absorpsjonsspektrale forskjeller i fly R og M pigmenttilstander. PDA er indusert av intenst blått lys, som konverterer mettende mengder rhodopsin til metarhodopsin, noe som resulterer i svikt i lysresponsterminering i lengre tid i mørket, men det kan avsluttes ved metarhodopsin til rhodopsinkonvertering ved bruk av intens oransje lys. Siden PDA er et robust signal som krever massiv fotopigmentkonvertering, fører selv små defekter i biogenesen til fotopigmentet til lett oppdaget unormal PDA. Faktisk førte defekte PDA-mutanter til identifisering av nye signalproteiner som er viktige for fototransduksjon.

Introduction

Det lysaktiverte rhodopsinet (R), som er en G-proteinkoblet reseptor (GPCR), består av et 7 transmembranprotein (opsin) og en kromofor. I Drosophila melanogaster (fruktflue) induserer fotonabsorpsjon isomerisering av 11-cis-3-OH-retinal kromofor til all-trans-3-OH-retinal1, og fremmer konformasjonsendringen av rhodopsin til metarhodopsin (M, figur 1A). I motsetning til vertebrat rhodopsin, dissocierer den dominerende fraksjonen av invertebrat kromofor ikke fra opsin, noe som resulterer i den fysiologisk aktive mørkestabile pigmenttilstanden M. I sin tur induserer ytterligere fotonabsorering av all-trans-3-OH-retinal kromofor isomerisering av kromoforen 2,3, og genererer R-pigmenttilstanden med 11-cis-3-OH-retinal kromofor. R-tilstanden er et mørkt, stabilt og fysiologisk ikke-aktivt fotopigment. I tillegg til den ekstremt raske fotonregenereringsruten til kromoforen4, i likhet med virveldyrfotopigmenter, finnes en alternativ enzymatisk langsom rute for kromoforregenerering hos hvirvelløse dyr, hvor noen av stadiene utføres i retinale celler som omgir fotoreceptorene celler 5,6.

Drosophila medfører store fordeler som modellorganisme for å studere virvelløse fotoreceptorer. Spesielt har tilgjengeligheten av preparatet og evnen til å anvende molekylær genetikk gjort Drosophila til et kraftig modellsystem7. Derfor er det etablert flere in vivo og ex vivo eksperimentelle metoder for å studere fototransduksjon generelt og fotopigmentnivåer spesielt. Den enkleste in vivo-metoden utnytter den relativt store ekstracellulært registrerte spenningsresponsen på lys fra Drosophila-øyet. Følgelig fremkaller lysstimulering en elektrisk spenningsrespons i hele øyet som kan måles ved hjelp av ekstracellulær elektroretinogram (ERG) opptak, som er ~ 3 størrelsesordener større enn ERG-responsen på lys av vertebrate øyne 8,9. Drosophila ERG-responsen er robust og lett oppnådd, noe som gjør den til en praktisk metode for å identifisere abnormiteter i lysrespons på grunn av mutasjoner. ERG-responsen på lys oppstår hovedsakelig fra fotoreseptorene, pigmentceller (glia) og sekundære nevroner i lamina (se figur 1B). Hovedkomponentene i ERG er (i) den ekstracellulære spenningsresponsen til fotoreseptorene, (ii) "på" og "av" transientene i begynnelsen og slutten av lysstimuleringen som oppstår fra lamina-nevronene (figur 2A, innfelt, ON, OFF), (iii) den langsomme responsen til gliacellene (figur 2A, innfelt, piler) og (iv) den korte og forbigående responsen, som følge av ladningsforskyvning under fotopigmentaktivering som går foran ON-transient10 (figur 2C [innfelt], D, E). Denne korte responsen består av to faser (M1 og M2, figur 2C [innfelt]) og kan bare induseres ved ekstremt sterk lysstimulering, som samtidig aktiverer millioner av fotopigmentmolekyler. Det er verken observert under blå stimulering (figur 2D, blått spor) eller hos mutanter med sterkt reduserte fotopigmentnivåer (figur 2E, rødt spor), men amplituden er mildt forbedret i en mutant som avskaffer PLC-aktivitet (figur 2E, oransje spor). M1-fasen er en typisk ERP av fluen som oppstår ved aktivering av M i fotoreceptorene. M1-fasen, som har en positiv polaritet (intracellulært), frigjør en nevrotransmitter på vanlig måte i en tegn-inverterende synapse og aktiverer lamina-nevronene, som reagerer på fotoreseptordepolariseringen ved å generere den synaptisk forsterkede M2-fasen. Dermed reflekterer både M1- og M2-faser M-aktivering10,11.

Depolariseringen av fotoreseptoren genererer hornhinnen-positiv "på" transient, som oppstår fra den tegninverterende synapsen mellom fotoreseptoraksonet og monopolære nevroner i lamina10,11 (figur 1B). Den langsomme stigningen og nedbrytningen av ERG oppstår fra depolariseringen av pigmentcellene (figur 2A, innfelt, piler) hovedsakelig på grunn av K + utstrømning fra fotoreseptorcellene12 via det transiente reseptorpotensialet (TRP) og TRP-lignende (TRPL) kanaler 13,14,15. Disse langsomme kinetiske komponentene maskerer og forvrenger i stor grad bølgeformen til fotoreseptorresponsen sammenlignet med intracellulære eller helcelleopptak av fotoreseptorresponsen på lys 9,10. I tillegg, ved svært sterke belysninger, kan en ekstra forbigående respons, som går foran og delvis smelter sammen med "på" transienten, observeres (figur 2C [innfelt], D, E). Dette signalet stammer direkte fra den massive aktiveringen av fotopigmentet10.

Flere lysregimeprotokoller ved bruk av nøytral tetthet (ND) og fargefiltre, samt sterke lysende blink, er utviklet for å undersøke øyet generelt og fototransduksjonskaskaden spesielt. Disse protokollene har også blitt brukt til å undersøke egenskapene til fotopigmentet.

Intensitetsresponsprotokollen måler toppamplituden til ERG-spenningsresponsen til hele øyet til økende lysintensiteter (figur 2A, B). Denne protokollen hjelper til med å oppdage endringer i følsomheten til fotoreseptorcellene til lys9.

Den langvarige depolariserende afterpotensielle (PDA) protokollen utnytter forskjellene i absorpsjonsspektrene til rhodopsin og metarhodopsin som i Drosophila tillater en massiv fotopigmentkonvertering av R til sin fysiologisk aktive og mørkestabile mellomliggende M-tilstand2. I ERG-spenningsresponsen er det gitt en relativt kort puls av mettet lys, og den resulterende spenningsresponsen registreres. Under denne tilstanden nås et tak (reverseringspotensial) av depolariseringssignalet fordi aktivering av en brøkdel av en prosent av den enorme mengden rhodopsinmolekyler (~ 1 x 108) er tilstrekkelig til å nå taket. Tilstedeværelsen av fototransduksjonskomponentene i stor overflod sikrer at dette taket nås selv i mutanter med en betydelig reduksjon i konsentrasjonen eller subtil funksjonsfeil i fototransduksjonskomponentene. Denne situasjonen utelukker isoleringen av disse mutantene. Pak og medarbeidere introduserte PDA-screening7 som søker en pålitelig og avslørende test for å isolere visuelle mutanter. I Drosophila er PDA-responsen forårsaket av genetisk fjerning av det røde screeningpigmentet, som tillater fotopigmentkonvertering, og anvendelse av blått lys, som fortrinnsvis absorberes av rhodopsin (figur 3A) og dermed resulterer i en stor nettokonvertering av R til M-fotopigmenttilstanden. Fototransduksjonsterminering forstyrres på fotopigmentnivå ved en stor nettokonvertering av R til M, noe som igjen resulterer i vedvarende eksitasjon lenge etter at lyset er slått av (figur 2C, figur 4A [topp]). I løpet av PDA-perioden er fotoreceptorene mindre følsomme for etterfølgende testlys og er delvis desensibiliserte (inaktiverte). PDA oppdager selv små defekter i rhodopsinbiogenese og tester fotoreseptorcellens maksimale kapasitet for å opprettholde eksitasjon i en lengre periode. Siden det strengt avhenger av tilstedeværelsen av høye konsentrasjoner av rhodopsin, scorer det lett for mangelfull påfylling av fototransduksjonskomponentene. Bemerkelsesverdig nok har PDA-skjermen gitt mange nye og svært viktige visuelle mutanter (gjennomgått i Pak et al.7). Dermed er PDA-mutantene isolert av Pak et al.7 fortsatt ekstremt nyttige for å analysere Drosophila visuelle system.

PDA induseres i Drosophila ved å mette blått lys, noe som resulterer i kontinuerlig depolarisering lenge etter lysforskyvning (figur 4A [topp]). Etter metning av PDA-induserende blått lys forblir de perifere fotoreseptorene (R1-6) kontinuerlig aktive i mørket ved maksimal kapasitet og når metning. Ytterligere mettende blålys under PDA gir ingen ekstra respons i R1-6-celler i mange sekunder, men induserer et svar i R7-8-celler som legges over PDA. De overliggende responsene forklares av de forskjellige absorpsjonsspektrene til fotopigmentene uttrykt i disse cellene (R7-8)16. PDA kan undertrykkes ved fotokonvertering av M tilbake til R med mettet oransje lys (figur 4A [øverst]). PDAs evne til å bringe fotoreseptorcellene til sin maksimale aktive kapasitet, en situasjon som ikke kan oppnås ved intenst hvitt lys, forklarer hvorfor det har vært et viktig verktøy for å skjerme for visuelle mutanter av Drosophila. Dette skyldes at det tillater påvisning av selv mindre defekter i proteiner involvert i biogenesen av normale fotopigmentnivåer 17,18. To grupper av PDA defekte mutanter har blitt isolert: verken inaktivering eller etterpotensielle (nina) mutanter og inaktivering, men ikke etterpotensielle (ina) mutanter. Fenotypen til førstnevnte er mangel på en PDA og den tilhørende inaktiveringen som følge av en stor reduksjon i fotopigmentnivåene (figur 4A [midten]). Fenotypen til sistnevnte viser inaktivering, men ingen mørk depolarisering etter blått lys på grunn av en fortsatt ukjent mekanisme i mutanten med normale rhodopsinnivåer, men mangler proteiner som interagerer med TRP-kanalene (figur 4A [nederst]).

PDA stammer fra forskjellen i mengden fotopigment i forhold til arrestin (ARR2), som binder og avslutter M-aktivitet 19,20,21 (figur 1A). I Drosophila fotoreceptorer er mengden av fotopigmentet omtrent fem ganger større enn mengden ARR219. Dermed er ARR2-nivåene utilstrekkelige til å inaktivere alle M-molekylene som genereres av en stor netto fotokonvertering av R til M, og etterlater et overskudd av M konstant aktivt i mørket 17,19,20,22,23. Denne mekanismen forklarer eliminering av PDA-responsen ved mutasjoner eller ved karotenoid deprivasjon24,25, noe som forårsaker en reduksjon i fotopigmentnivået, men påvirker ikke arrestinnivået. Videre redegjør denne forklaringen også for fenotypene av null ARR2 (arr23) mutant allel21, hvor PDA kunne oppnås ved ~10 ganger dimmer blå lysintensiteter 19,20,21 (figur 4B,C). PDA er ikke et unikt trekk ved fluefotoreceptorer, og det vises i alle testede arter som har mørk stabil M med et absorpsjonsspektrum som er forskjellig fra R-tilstanden, noe som muliggjør tilstrekkelig fotokonvertering av fotopigmentet fra R til M-tilstanden. En grundig undersøkt art der PDA-fenomenologien ble oppdaget, er rur (Balanus) fotoreseptor, der absorpsjonsspekteret til R-tilstanden er i en lengre bølgelengde enn M-tilstanden2 (figur 3B). Følgelig, i motsetning til situasjonen i fluen, i rur, induserer oransje-rødt lys en PDA, mens blått lys undertrykker PDA2.

Den tidlige reseptorpotensialprotokollen (ERP) utnytter ladningsforskyvningen som oppstår under R- eller M-aktivering. Det visuelle pigmentet er en integrert del av overflatemembranen i signalkammeret til både vertebrat og hvirvelløse membraner3. Følgelig er aktiveringsprosessen der fotopigmentmolekylene endres fra en mellomtilstand til den neste ledsaget av en ladningsforskyvning 4,26. Ettersom fotopigmentmolekylene er elektrisk justert parallelt med membrankapasitansen4, genererer en rask synkronisert konformasjonsendring en rask polarisasjonsendring av overflatemembranen, som i fluer forekommer i signalrommet som består av en stabel på ~ 30.000-50.000 mikrovilli kalt rhabdomere. Denne polariseringen utlades deretter passivt gjennom membrankapasitansen i cellelegemet til cellemembranen er like polarisert. ERP er det ekstracellulære opptaket av ladningsforskyvningen. Den intracellulært registrerte ERP manifesterer den ekstracellulære ERP integrert av tidskonstanten til cellemembranen 4,27,28. Strømmen aktivert av den visuelle pigmentladningsforskyvningen kunne også måles i helcellespenningklemmeopptak29,30 (figur 5A-D), med den største fordelen (i tidlig reseptorstrøm (ERC) opptak) for å minimere effekten av membrankapasitans på signalets kinetikk.

Protokolldelen beskriver hvordan man utfører ERG-målinger fra Drosophila eye9 og ERC-målinger ved helcelleopptak fra Drosophila isolert ommatidia31,32. Vi beskriver også spesifikke protokoller som brukes til å undersøke fototransduksjon generelt og fotopigmenter spesielt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Måling av intensitetsresponsforholdet, langvarig depolariserende etterpotensiell (PDA) og det tidlige reseptorpotensialet (ERP) ved bruk av elektroretinogrammet

  1. Egnede oppdrettsforhold for D. melanogaster forberedelse
    1. Raise D. melanogaster fluer i flasker som inneholder standard gul mais inneholder mat i en inkubator holdt ved en temperatur på 24 ° C og i en 12 timers mørk / lys syklus
    2. Hold flueflaskene i mørket minst 24 timer før eksperimentet.
  2. Generelt oppsett
    1. Forbered opptakspipetter ved å trekke 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) fiberfylte borosilikatglasskapillærer (figur 6L, O). Pipettens motstand skal være 5-10 MΩ; enhver egnet avtrekker kan brukes.
    2. Dekk to sølvtråder med AgCl2, og sett inn 0,25 mm sølvtråd i 3 M KCl-løsningen koblet til en skreddersydd 5 V strømforsyning.
    3. Sett hver belagt sølvtråd inn i elektrodeholderne (figur 6N).
    4. Fyll glasskapillæren med filtrert Ringers oppløsning (se tabell 1) med en sprøyte med avlang spiss (figur 6M).
    5. Sett trådelektroden inn i glasskapillæren. Forsikre deg om at løsningen i kapillæren er i kontakt med sølvtråden.
    6. Sett elektrodeholderne (figur 7P, N) inn i de to elektrodemikromanipulatorene (figur 7G).
  3. Prosedyre for å forberede flyet for elektriske opptak
    MERK: For å holde fluen under mørke tilpassede forhold, bruk bare svak rødlysbelysning under de følgende trinnene.
    1. Bedøv fluene i flasken med CO2-gass ved hjelp av fluesvillesystemet (figur 6A, B) og hell dem i sovebeholderen.
    2. Velg en flue og hold den forsiktig ved vingen ved hjelp av en skarp pinsett. Dekk resten av fluene med en petriskål.
    3. Plasser fluen på flueholderen i riktig retning - liggende på siden, med ryggen mot hånden (figur 6P).
    4. Slå PÅ strømforsyningen til loddejernet. Sett gjeldende til ~ 2,25 A. Denne strømmen skal varme opp 0,25 mm platina-iridiumfilamentet til ~55-56 °C (se Tilleggsfil).
    5. Plasser en dråpe voks med lav smeltetemperatur (~55-56 °C) på loddejernet (figur 6F).
    6. Bruk pinsett til å løfte flua fra vingene og fest vingene til flueholderen (figur 6I) ved hjelp av loddejernet.
    7. Bruk loddejernet til å koble fluens rygg til stativoverflaten med voks (figur 6P).
    8. Senk tuppen av loddejernet på sammenføyningspunktet på bena og smelt voksen for å dekke alle bena sammen (figur 6P).
    9. Plasser en liten dråpe voks mellom hodet og ryggen i nakkeområdet (figur 6P).
      MERK: Vær spesielt forsiktig for å unngå overoppheting av fluehodet. Forsikre deg om at fluen er ordentlig festet og ikke kan bevege seg under eksperimentet; mindre bevegelser kan skape artefakter i opptakene. Sørg for at luftrørsåpningene (pusteinntakene) i thorax og mage ikke er dekket med voks.
    10. Plasser flueholderen (figur 7Q) i et mørkt Faraday-bur på en magnetblokk (figur 7I) og sørg for at fluen er ~5 mm fra enden av lysføringen (figur 7L).
    11. Plasser opptakselektroden (figur 7P) over fluens øye og jordelektroden (figur 7N) over fluens øvre rygg ved hjelp av mikromanipulatorene.
    12. Sett jordelektroden inn på baksiden av fluen ved hjelp av mikromanipulatorene.
    13. Sett opptakselektroden inn i den ytre periferien av fluens øye, helst ved hjelp av mikromanipulatorene.
      MERK: Etter å ha satt elektroden inn i øyet, vil en liten dimple bli observert; trekk elektroden oppover uten å fjerne den fra øyet til smilehullet forsvinner. Elektrodene kan også nedsenkes i små dråper elektrodegelé påført på torso og øye.
  4. Intensitet-respons-protokoll
    1. Plasser et oransje filter (590 kantfilter) foran høytrykks Xenon-lampen. Bruk et stort filter (seks størrelsesordener) som demper nøytral tetthet (ND).
    2. Vent 60 s i mørket og gi en 5 s lyspuls.
    3. Bytt ut ND-filteret med et mindre dempende ND-filter i en størrelsesorden trinn.
    4. Vent 60 s i mørket og gi en ny 5 s lyspuls.
    5. Gjenta trinn 1.4.1.-1.4.4, og øk gradvis lysintensiteten ved hjelp av mindre dempende ND-filtre (den siste pulsen skal genereres uten noe ND-filter i det hele tatt). Sørg for å bruke serien med ND-filtre i riktig retning, fra stor demping og når lav demping.
  5. PDA-protokoll (denne protokollen kan bare utføres på hvitøyede fluer)
    1. Gi en 5 s lyspuls med maksimal intensitet ved hjelp av et oransje filter (590 kantfilter, for å konvertere maksimal fotopigment til R-tilstand).
    2. Bytt ut det oransje filteret med et bredbåndsblått (BP450/40 nm) filter og gi tre 5 s lyspulser med maksimal intensitet.
      MERK: Det er også mulig å gi en lang kontinuerlig maksimal intensitet blå lyspuls til en steady-state spenningsrespons er nådd.
    3. Vent 60 s i mørket, bytt ut det blå filteret med det forrige oransje filteret, og gi to 5 s lyspulser med 60 s intervaller.
  6. ERP /M-potensialprotokoll for måling av fotolikevektsspekteret til M (denne protokollen kan bare utføres på hvitøyede fluer10,25)
    1. Gi en kontinuerlig blå (bandpass (BP) 450/40 nm) lyspuls til den når en steady-state spenningsrespons, som konverterer den maksimale mengden fotopigment fra R-tilstanden til M-tilstanden til R1-6-celler.
    2. Gi et kort (<3 ms) intenst lysglimt med en bølgelengde mellom 350-700 nm (det kjente absorpsjonsspekteret til R1-6-celler fotopigment) ved bruk av smale (~ 20 nm) båndpassfiltre og mål toppamplituden til M1-fasen av M-potensialresponsen (som reflekterer metarhodopsinabsorpsjonen ved denne spesifikke bølgelengden ved fotolikevekt10,25).
      MERK: For synkron aktivering av et stort basseng med fotopigmentmolekyler, er det nødvendig med et kort, intenst lysglimt slik at fotoninnholdet blir pakket på kort tid. M-potensialet består av to komponenter: M1 (hornhinnenesevativ fase), som gjenspeiler ladningsforskyvningen av metarhodopsinet i fotoreseptoren, og M2 (hornhindepositiv fase11,33), som gjenspeiler den forsterkede M1-responsen til fotoreseptorene i lamina 9,10,11 . Hver av disse komponentene kan identifiseres og måles. Det er imidlertid å foretrekke å måle M1-potensialet siden det er en direkte lineær manifestasjon av M-nivåene. Hvis M2 brukes, må du kontrollere at amplituden er i det lineære området ved å bruke mild karotenoid deprivasjon 24,25.
    3. Gi en kontinuerlig blå (BP450/40 nm) lyspuls igjen, etterfulgt av et kort (<1 ms) intenst lysglimt med en annen bølgelengde.
    4. Gjenta denne protokollen til hele absorpsjonsspekteret til M ved fotolikevekt er dekket.

2. ERC-protokoll for måling av handlingsspekteret til R og M-tilstandene til R1-6-celler ved bruk av helcellespenningsklemmeopptak

MERK: For en detaljert protokoll for bruk av helcellespenningsklemmeopptak, se Katz et al.34. M-potensialet bruker ERG til å måle aktiveringen av M-tilstanden bare fordi bidraget fra R-tilstanden undertrykkes av membrankapasitansen. Derimot måler ERC aktiveringen av både R-tilstander (positiv ERC) og M (negativ ERC) fordi spenningsklemmeopptak fjerner effekten av membrankapasitans (se innledning).

  1. Konverter fotopigmentet til ønsket tilstand (R eller M). For konvertering av R til M må du først tilpasse fluene med en kort (<1 ms) adaptiv blå (BP450/40 nm) blits. For konvertering av M til R, gi en kort adaptiv oransje (OG590 kantfilter) blits.
  2. Gi et kort lysglimt (<1 ms) med en bølgelengde mellom 350-700 nm og mål den maksimale negative eller positive amplituden til ERC-responsen, som reflekterer M/R-absorpsjonen ved denne spesifikke bølgelengden.
    MERK: For synkron aktivering av et stort basseng med fotopigmentmolekyler, er det nødvendig med et kort, intenst lysglimt for å pakke fotoninnholdet på kort tid. Den maksimale fotopigmentkonverteringen fra R til M ved blå blits kan nå ~ 80% av de totale fotopigmentmolekylene på grunn av overlappingen i absorpsjonsspekteret til R og M (figur 3A). Derfor, ved bølgelengder under ~ 550 nm, har ERC to komponenter: en negativ fase som reflekterer responsen til metarhodopsinet, og en positiv fase som reflekterer responsen til det gjenværende rhodopsinet. ERC avhenger lineært av lysintensiteten (figur 5D). Følgelig, for å utlede den spektrale følsomheten til R- og M-tilstander, må hver fase av ERC normaliseres ved de forskjellige bølgelengdene for lik energi29.
  3. Gjenta trinn 2.1.-2.2. ved hjelp av blinker av forskjellige bølgelengder.
  4. Plot den normaliserte positive og negative ERC som en funksjon av bølgelengden.
    MERK: Det sterke lysglimtet induserer en massiv strøm gjennom de lysfølsomme kanalene som fører til metabolsk stress på fotoreseptoren, noe som igjen forårsaker lysuavhengig kanalåpning. ERC er lagt over denne konstitutive strømmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 eksemplifiserer robustheten og brukervennligheten ved bruk av ERG-teknikken. Den er robust fordi den registreres i den nesten intakte fluen ved en enkel teknikk for ekstracellulære spenningsopptak som krever et enkelt elektrofysiologisk oppsett. Robustheten manifesteres ved å oppnå opptak av lysresponser med relativt store amplituder (i millivoltområdet) selv når mutasjoner sterkt reduserer eller forvrenger lysresponsen. Derfor kan selv en uerfaren eksperimenterer bruke det svært enkle eksperimentelle oppsettet og lære å oppnå meningsfulle resultater om noen dager. Hovedmålet med teknikken designet for å måle fotopigmentnivåer oppnås ved ekstremt forenklede metoder for PDA (figur 2C) og ERP (figur 2C-E). Alternativet, nemlig mikrospektrofotometri, krever kostbart optisk utstyr og betydelig trening og dyktighet (figur 3B). ERC (figur 5A-D), selv om den er teknisk utfordrende, er mindre følsom for cellebevaring; det er preget av et høyt signal-til-støy-forhold og eliminering av membrankapasitans.

Figure 1
Figur 1: Den fotokjemiske syklusen: aktivering og deaktivering av fotopigmentet. (A) Mettende blå belysning (bølget blå pil) fotokonverterer rhodopsin (R) til metarhodopsin (M). Multippel fosforylering av M ved rhodopsinkinase og påfølgende binding av arrestin 2 (ARR2) inaktiverer M. Oransje lys (bølget rød pil) fotokonverterer ikke-fosforylert M tilbake til R. Den ikke-fosforylerte M aktiverer heterotrimerisk G-protein (Gqαβγ), noe som forårsaker dissosiasjon av Gqα fra Gqβγ og utveksling av bundet BNP med cytoplasmatisk GTP. Gqα-GTP aktiverer deretter fosfolipase C (PLC), som hydrolyserer PIP2 til diacylglycerol (DAG) og inositoltrisfosfat (IP3), og aktiverer dermed TRP / TRPL-kanalene på en fortsatt uklar måte. Ca2+ kalmodulinavhengig kinase (CaMKII) fosforylerer M pp-ARR2-komplekset og gjennomgår clathrinavhengig endocytose og nedbrytning. Belysning med oransje lys (bølget rød pil) fotokonverterer M pp-ARR2-kompleks til fosforylert R (Rpp), og frigjør ARR2 til cytosolen. Fosforylert R (Rpp) gjennomgår defosforylering av rhodopsinfosfatase (rdgC), og produserer R klar for en annen syklus av fotopigmentet. (B) Dybdeprofil for ERG av hvitøyet flue til en 1 s hvit stimulus (senterkolonne) eller en hvit strobeblink (høyre kolonne). Stimuli indikeres av barer eller prikker under sporene. Sporene er ordnet vertikalt i dybderekkefølge, med toppsporet registrert ~ 10 μm under hornhinnen, med hver etterfølgende registrering 25 μm dypere enn den forrige. Til venstre er en kamera lucida tegning av en tilsvarende seksjon gjennom et annet øye, som indikerer netthinne, kjellermembran (BM), laminær skall, laminære patroner (seksjonert skrått) og medullar skall. Dette tallet er modifisert fra Stephenson og Pak11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Elektroretinogramopptak (ERG) av lysresponser av hvitøyet villtype (w1118) og mutant Drosophila som viser intensitet-respons-forholdet, langvarig depolariserende etterpotensiell (PDA) og metarhodopsinpotensial (M-potensial). (A) Intensitet-respons-forholdet til en WT (w1118) flue oppnådd av en serie oransje lys (OG590 kantfilter, den totale energien som ble sendt ut fra kanten av lysguiden ved hjelp av det oransje filteret var 4 mW ) med økende lysintensitet angitt i -log skala. Innfellingen viser det angitte svaret på en raskere tidsskala. Innfelt: Hovedkomponentene i ERG er den ekstracellulære spenningsresponsen til fotoreseptoren (reseptorpotensialet), "på" og "av" transientene (ON, OFF-respons) i begynnelsen og slutten av lysstimuleringen, og den langsomme responsen til gliacellene (pilene). (B) Den gjennomsnittlige toppamplituden til ERG-responsene er plottet som en funksjon av relativ lysintensitet. (C) ERP av en WT (w1118) flue ble oppnådd ved bruk av mettende blå (BP450/4 nm, den totale energien som ble sendt ut fra kanten av lysstyringen ved hjelp av det blå filteret var 1 mW) lys som i utgangspunktet induserer en PDA. ERP (innfelt) ble oppnådd ved en følgende intens (~ 70 J, 2 ms varighet) grønn flash (pil, bredbånd 550 nm interferensfilter), som undertrykte PDA. Innfelt: De forskjellige komponentene i ERP inkluderer hornhinnenes negative M1-potensial og det positive M2-potensialet, som angitt. En rest på forbigående ("ON" respons) er også indikert. (D-E) Fotopigmentkonvertering er nødvendig for induksjon av M-potensialet: (D) M-potensialet ble oppnådd av et grønt (bredbånd 550 nm interferensfilter) blits etter blå tilpasning, men ikke ved en blå (BP450/4 nm) blits etter blå tilpasning i WT (w1118) flue. (E) Protokollen til D ble gjentatt i WT (w1118 , svart spor) og to mutantfluer (PLC null mutant, norpAP24, oransje spor og hypomorf rhodopsin mutant, ninaEP318, rødt spor). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Absorpsjonsspektra av fly- og rurfotopigmenter. (A) Relative absorpsjonsspektra av flue rhodopsin (R) og metarhodopsin (M) beregnet ut fra fotometriske målinger av differansespekteret og fotolikevektsspekteret. Dette tallet er modifisert fra Selinger og Minke35. (B) To Dartnall-nomogrammer med toppbølgelengder ved 492 nm og 532 nm, med et forhold mellom toppabsorpsjonen på henholdsvis 1,63:1. Forskjellen mellom disse kurvene gir best passform til differansespekteret målt fra ocelli av rur Balanus eborneus, oppnådd ved overføringsmålinger i området 400-650 nm etter metning av monokromatisk blå (442 nm) og oransje (596 nm) tilpasning. Dette tallet er modifisert fra Minke og Kirschfeld36. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: PDA-fenotypen til mutantene nina, ina og Arr2. (A) Protokollen for induksjon og undertrykkelse av PDA i Drosophila. PDA-induksjonsprotokollen består av en innledende belysning ved bruk av oransje lyspuls med maksimal intensitet (590 kantfilter, den totale energien som ble sendt ut fra kanten av lysguiden ved hjelp av det oransje filteret var 4 mW, oransje bar) etterfulgt av påføring av tre pulser med maksimal intensitet blått lys (2. og 3. pulser er for verifisering av å nå maksimal PDA, BP450/40 nm filter, den totale energien som ble sendt ut fra kanten av lysguiden ved hjelp av det blå filteret var 1 mW, tre blå stolper). PDA-undertrykkelse ble oppnådd ved bruk av oransje lyspuls etterfulgt av påføring av et ekstra oransje lys (to oransje søyler). PDA-induksjons- og suppresjonsprotokollen ble gjentatt i hvitøyet mutant av strukturgenet R1-6 fotopigment, ninaEP318 7 (midten). PDA-induksjons- og suppresjonsprotokollen ble også gjentatt i den hvitøyde nullmutanten av den øyespesifikke proteinkinase C (PKC32) inaCP209 (nederst). (B) En sammenligning mellom mengden blått lys som kreves for induksjon av en PDA mellom hvitøyet WT (W1118) og null Arr2 mutant (Arr23). Et tog med vekslende oransje (mettende 590 kantfiltre) og blå (BP450/40 nm) lyspulser med økende lysintensitet (ND i relativ loggskala). Ved blått lys med -log 1 intensitet induseres en PDA (øverst). Paradigmet til toppsporet ble gjentatt i Arr2 3-mutanten som viste at PDA ble indusert ved det blå lyset av ~ 10 ganger dimmerlys (-log 2) intensitet (nederst). (C) Et tog med svake (-log 2) blå lyspulser med konstant intensitet klarte ikke å indusere en PDA i W1118 fly (venstre), mens det samme toget med svake blå lys induserte en PDA ved 1st lyspuls i Arr23 mutanten (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5 Patch-clamp helcelleopptak av lysresponser av isolert ommatidi, registrert fra hvitøyet WT (w1118), som viser generering av tidlig reseptorstrøm (ERC) og dens intensitet-respons-forhold. (A) Patch-clamp helcelleopptak fra isolert ommatidium av WT fly (w1118) av bifasisk ERC respons med sub-mikrosekund latens. Lysstimuleringen består av en intens (~ 220 J, 0,8 ms varighet) blålysblink (bredbåndsfilter med toppabsorpsjon ved 425 nm, pil) stimulering påført etter sterk tilpasning til gulgrønn (bredbåndsfilter med toppabsorpsjon ved 546 nm lys, svart spor). Ved lysstart observeres en raskt negativ elektrisk artefakt. Den negative fasen oppstår ved aktivering av M, og den positive fasen oppstår ved aktivering av R. Aktiveringen av den lysinduserte strømmen (LIC) manifesteres av den forsinkede negative fasen som oppstår ved åpningen av de lysfølsomme kanalene. NinaEI17 nullmutanten viste manglende ERC-respons på samme lysglimt påført isolert ommatidium (rødt spor). (B) ERC-måling av Rh1-fotopigmenter registrert fra samme celle som (A). Det svarte sporet viser monofasisk negativ respons (M-tilstand) på oransje blitsstimulering av WT (w1118) fly etter sterk tilpasning til blått lys. (C) Prøve av bifasiske ERC-spor målt fra en enkelt fotoreseptorcelle av transgen Drosophila (opn4;ninaEI17) som ektopisk uttrykker mus melanopsin fotopigment (opn4) i R1-6 flyfotoreseptorer som svar på økende intensitet av hvite blitslys (i en relativ -log I skala; ND indikerer filtre med nøytral tetthet). Blitsstart er indikert med pilen. (D) Økningen i lysintensitet ble manifestert av en lineær økning i ERC-amplituden til opn4;ninaEI17. Et plott av den gjennomsnittlige toppamplituden til den negative fasen av ERC-responser (log scale) som en funksjon av relativ lysintensitet (I/Imaks, også i loggskala). Den kontinuerlige rette linjen representerer en lineær regresjonskurve som passer best til de eksperimentelle punktene (R2 = 0,99, feilfelt er SEM, n = 5). Dette tallet er modifisert fra Yasin et al.29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Verktøy og utstyr som kreves for fluefiksering og registrering av pipettepreparering. (B) Fly sleeper system pedal; (C) Kald lyskilde; (D) Stereoskopisk mikroskop; (E) Voks filament varmeapparat; (F) Loddejern; (G) Voks filament varmeapparat pedal; (H) Grov pinsett; (I) Magnetisk fluestativ; (J) Voks med lav smeltetemperatur; (K) Delikate våtservietter; (L) Vertikal pipettetrekker; (M) Sprøyte med langstrakt spiss; (N) Elektrodeholdere; (O) Borosilikatglasskapillærer; (P) Fast flue. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Oversikt over ERG-oppsettet. (b) Datamaskin; (C) A/D-omformer; (D) Forsterker; (E) Stereoskopisk mikroskop; (F) Mikromanipulator (mekanisk bot); (G) Mikroelektrode forforsterkersystem med hodetrinn; (H) Anti-vibrasjonstabell; (I) På / Av magnetblokk; (J) Mikromanipulator (mekanisk grov); (K) Faraday bur; (L) Lysguide fra Xenon lyskilde; (M) Lysstyring fra blitslyssystem; (N) Jordet elektrodeholder; (O) Lysdetektor; (P) Opptak av elektrodeholder; (Q) Magnetisk fluestativ; (R) Xenon lampe strømforsyning; (S) Farge- og ND-filtre står; (T) Optisk benk; (U) Blitslampe system; (V) Lukker driver; (W) Strømforsyning til lampen; (X) Xenon blitslyssystem Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ringers løsning
Reagent Konsentrasjon (mM)
NaCl 130
KCl 2
MgCl2 5
CaCl2 2
HEPES 10
pH-titrering til 7,15 ved bruk av NaOH og HCl

Tabell 1: Sammensetning av Ringers løsning.

Tilleggsfil 1: Kretsdiagram over vokssmeltregulatoren. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den største fordelen med å bruke Drosophila fotoreseptorpreparatet er dets tilgjengelighet, enkelheten og nøyaktigheten av lysstimulering, og viktigst av alt, evnen til å anvende kraften i molekylær genetikk7. Omfattende genetiske studier har etablert Drosophila som et ekstremt nyttig modellsystem for genetisk disseksjon av komplekse biologiske prosesser7. Den relativt enkle strukturen til Drosophila-genomet (bestående av bare fire kromosomer, inkludert X- og Y-kjønnskromosomene, to større autosomale elementer, kromosomene 2 og 3 og det lille prikk fjerde kromosomet), enkel vekst og rask generasjonstid (~ 2 uker ved 24 ° C) gjør Drosophila egnet for screening av et stort antall mutageniserte individuelle fluer. Videre blir isolering og vedlikehold av enhver isolert mutasjon mulig på grunn av genereringen av balanserkromosomer, som inneholder dominerende markører og flere inversjoner, som forhindrer rekombinasjon med de innfødte kromosomene. De tilgjengelige molekylære verktøyene har gjort det mulig å studere in vitro modifiserte genprodukter i deres opprinnelige cellulære miljø37. Denne kraftige metoden har produsert en mengde mutante fluer med defekter i nye proteiner som ellers ville vært vanskelig å forutsi7.

Den største fordelen med å bruke ERG for målinger av fotopigmentnivåer og lysfølsomhet er dens enkelhet og brukervennlighet og store signal-til-støy-forhold. Ulempen med å bruke ERG er dens heterogene cellulære opprinnelse, som forvrenger bølgeformen av lysresponsen som oppstår fra fotoreceptorene9. Den største fordelen med spenningsklemme helcelleopptak er muligheten til å utlede konduktansendring ved å måle forholdet mellom strømspenning (I-V). Åpning og lukking av TRP- og TRPL-kanalene under og etter belysning gjenspeiles av dennemålingen 13. I tillegg oppnås et høyt signal-til-støy-forhold på grunn av den lave motstanden til opptakspipetten (~ 10 MΩ) og måling av strømmer, noe som muliggjør pålitelige målinger av kvantehumper (enkeltfotonresponser), noe som er nyttig for kalibrering av den effektive lysintensiteten38. En stor ulempe med patch-clamp helcelleopptak er at mens ERG-opptak kan opprettholdes i flere timer selv under ekstreme lysintensiteter, er det vanskelig å utføre pålitelige patch-clamp helcelleopptak i mer enn 15-30 minutter, og svak lysstimulering er nødvendig for langvarige opptak. For å oppnå helcelleopptak er det nødvendig med direkte kontakt mellom opptakspipetten og fotoreseptormembranen. Direkte kontakt oppnås ved å fjerne pigmentcellene (gliacellene som omgir ommatidia34) (figur 1B). Fjerning av pigmentceller forårsaker metabolsk stress fordi fotoreseptorcellen ikke kan syntetisere metabolittene som kreves for produksjon av adenosintrifosfat (ATP), noe som forstyrrer metabolsk forsyning39. Siden TRP- og TRPL-kanaler er sårbare for anoksi og lett åpnes spontant i mørket på grunn av ATP-uttømming, medfører bruk av isolert ommatidi store vanskeligheter40,12. Hele prosedyren må gjøres under svakt rødt lys fordi lysresponsen induserer et stort forbruk av ATP34.

De fleste mutasjonene i fototransduksjonskaskaden induserer en reduksjon i lysfølsomheten. Denne reduksjonen i lysfølsomhet kan lett oppdages av en skjerm basert på måling av forholdet mellom intensitet og respons. Intensitetsresponsparadigmer oppnås ved gjentatte lysstimuleringer med økende intensitet på logaritmisk skala. Økende (og ikke avtagende) intensitet av oransje lys er nødvendig for å forhindre tilpasning til lys. ERG (M-potensial) og PDA er svært enkle metoder for å måle fotopigmentnivåer. Alternativet, nemlig mikrospektrofotometri36, krever dyrt optisk utstyr og betydelig trening og dyktighet.

For å konkludere, ERG er et enkelt å bruke, men relativt unøyaktig verktøy. Helcelleopptak31 er nøyaktig for å måle fotopigmentnivåer ved hjelp av ERC, og det er viktig for å kompensere for unøyaktigheten og begrensningene til ERG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra Israel Science Foundation (ISF), og USA-Israel Binational Science Foundation (BSF). Vi takker Mr. Anatoly Shapochnikov for konstruksjonen av voksfilamentvarmeren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Tags

Nevrovitenskap utgave 184
Elektrofysiologiske metoder for måling av fotopigmentnivåer i <em>Drosophila</em> fotoreceptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B.… More

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter