Summary
Apresentamos um protocolo para caracterizar eletrofisilogicamente fotopigmentações bie estáveis: (i) explorando os deslocamentos de carga dentro das moléculas de fotopigment após a absorção de fótons e sua enorme quantidade nos fotorreceptores, e (ii) explorando as diferenças de absorção-espectros dos estados de fotopigmento de rhodopsina e metarhodopsina. Esses protocolos são úteis para rastrear mutações que afetam sistemas de fotopigment biestabilidade.
Abstract
O drosophila G-protein-acoplado rhodopsin (R) é composto de uma proteína (opsina) e um cromoforeiro. O processo de ativação da rodopsina é iniciado pela isomerização indutora de absorção de fótons do cromoóforo, promovendo alterações conformais da opsina e resultando em um segundo estado de fotopigmento escuro-estável (metarhodopsina, M). A investigação deste fotopigment bi-estável usando mutagênese aleatória requer métodos simples e robustos para a triagem de moscas mutantes. Portanto, vários métodos para medir reduções nos níveis funcionais de fotopigment foram projetados. Um desses métodos explora os deslocamentos de carga dentro do fotopigment após a absorção de fótons e as enormes quantidades de moléculas de fotopigment expressas nos fotorreceptores. Este sinal elétrico, chamado de potencial receptor precoce (ou corrente de receptor precoce), é medido por uma variedade de métodos eletrofisiológicos (por exemplo, eletroretinograma e gravações de células inteiras) e é linearmente proporcional aos níveis de fotopigment funcional. As vantagens deste método são a alta relação sinal-ruído, a medição linear direta dos níveis de fotopigment e a independência dos mecanismos de fototransdução rio abaixo para a ativação de rodopsina ou metarhodopsina. Um método eletrofisiológico adicional chamado despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora a bi-estabilidade da fotopigment de Drosophila e as diferenças espectrais de absorção dos estados de pigmento R e M. O PDA é induzido por intensa luz azul, convertendo quantidades saturadas de rodopsina em metarhodopsina, resultando na falha da terminação de resposta à luz por um longo tempo na escuridão, mas pode ser terminada por metarhodopsina à conversão de rodopsina usando luz laranja intensa. Uma vez que o PDA é um sinal robusto que requer conversão maciça de fotopigment, mesmo pequenos defeitos na biogênese do fotopigamento levam a PDA anormal prontamente detectada. De fato, mutantes PDA defeituosos levaram à identificação de novas proteínas de sinalização importantes para a fototransdução.
Introduction
A rodopsina ativada pela luz (R), que é um receptor acoplado à proteína G (GPCR), é composta por uma proteína transmembrana 7 (opsina) e um cromoforo. Em Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), a absorção de fótons induz a isomerização do cromo de 11-cis-3-OH-retinal ao todo trans-3-OH-retinal 1, promovendo a mudança conformacional da rhodopsina para metarhodopsina (M, Figura 1A). Ao contrário da rodopsina vertebrado, a fração predominante do cromoforoto invertebrado não se dissocia da opsina, resultando no estado de pigmento fisiologicamente ativo e estável M. Por sua vez, a absorção adicional de fótons pelo cromoforo de retina totalmente trans-3-OH induz isomerização do cromoforo 2,3, gerando o estado de pigmento R com o cromotorgico 11-cis-3-OH-retinal. O estado R é um fotopigment escuro, estável e fisiologicamente não ativo. Além da rota de regeneração de fótons extremamente rápida do cromoforo4, assim como os fotopigmentos de vertebrados, existe uma rota lenta enzimática alternativa para a regeneração do cromóforo em invertebrados, em que alguns dos estágios são realizados em células da retina ao redor das células fotorreceptores 5,6.
A drosophila implica grandes vantagens como organismo modelo para estudar fotorreceptores invertebrados. Em particular, a acessibilidade da preparação e a capacidade de aplicar genética molecular tornaram o Drosophila um poderoso sistema modelo7. Assim, foram estabelecidos diversos métodos experimentais in vivo e ex vivo para o estudo da fototransdução em geral e em níveis de fotopigment, em particular. O método in vivo mais simples explora a resposta de tensão extracelularmente relativamente grande à luz do olho drosophila. Assim, a estimulação da luz evoca uma resposta de tensão elétrica em todo o olho que pode ser medida usando o registro de eletroretinograma extracelular (ERG), que é ~3 ordens de magnitude maior que a resposta ERG à luz dos olhos vertebrados 8,9. A resposta Drosophila ERG é robusta e facilmente obtida, o que o torna um método conveniente para identificar anormalidades na resposta à luz devido a mutações. A resposta do ERG à luz surge principalmente dos fotorreceptores, células pigmentantes (glia) e neurônios secundários da lâmina (ver Figura 1B). Os principais componentes do ERG são (i) a resposta de tensão extracelular dos fotoreceptores, (ii) os transitórios "on" e "off" no início e no fim do estímulo de luz que surgem dos neurônios lamina (Figura 2A, inset, ON, OFF), (iii) a resposta lenta das células glia (Figura 2A, inset, setas) e (iv) o breve e transitório, resposta resultante do deslocamento da carga durante a ativação do fotopigment que precede o ON transitório10 (Figura 2C [inset], D, E). Esta breve resposta é composta de duas fases (M1 e M2, Figura 2C [inset]) e só pode ser induzida por estimulação de luz extremamente forte, que ativa simultaneamente milhões de moléculas de fotopigment. Não é observada sob estimulação azul (Figura 2D, traço azul) nem em mutantes com níveis de fotopigment altamente reduzidos (Figura 2E, traço vermelho), mas sua amplitude é levemente aumentada em um mutante que abolia a atividade do PLC (Figura 2E, traço laranja). A fase M1 é um ERP típico da mosca decorrente da ativação de M nos fotorreceptores. A fase M1, que tem uma polaridade positiva (intracelularmente), libera um neurotransmissor da maneira normal em uma sinapse invertida de sinais e ativa os neurônios de lâmina, que respondem à despolarização do fotoreceptor gerando a fase M2 sintáticamente amplificada. Assim, ambas as fases M1 e M2 refletem a ativação M10,11.
A despolarização do fotoreceptor gera o transitório "on" córnea-positivo, decorrente da sinapse invertida entre o axônio fotorreceptor e os neurônios monopolares da lamina10,11 (Figura 1B). O lento aumento e decadência do ERG surge da despolarização das células pigmentadas (Figura 2A, inset, setas) principalmente devido ao Efflux K+ das células fotorreceptoras12 através dos canais receptores transitórios (TRP) e TRP-like (TRPL) 13,14,15. Esses componentes cinéticos lentos mascaram e distorcem em grande parte a forma de onda da resposta do fotorreceptor quando comparada às gravações intracelulares ou células inteiras da resposta do fotorreceptor à luz 9,10. Além disso, em iluminação muito forte, pode ser observada uma resposta transitória adicional, que precede e se funde parcialmente com o transitório "on", (Figura 2C [inset],D,E). Este sinal se origina diretamente da ativação maciça do fotopigmento10.
Vários protocolos de regime de luz utilizando densidade neutra (ND) e filtros de cores, bem como fortes flashes iluminados, foram desenvolvidos para investigar o olho em geral e a cascata de fototransdução em particular. Esses protocolos também têm sido usados para investigar as propriedades do fotopigment.
O protocolo de intensidade-resposta mede o pico de amplitude da resposta de tensão ERG de todo o olho ao aumento das intensidades de luz (Figura 2A,B). Este protocolo auxilia na detecção de alterações na sensibilidade das células fotorreceptoras à luz9.
O protocolo de despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora as diferenças nos espectros de absorção de rhodopsin e metarhodopsina que permite, em Drosophila, uma conversão maciça de fotopigment de R para seu estado intermediário fisiologicamente ativo e estável escuroM 2. Na resposta de tensão ERG, é dado um pulso relativamente curto de luz saturada, e a resposta de tensão resultante é registrada. Sob essa condição, um teto (potencial de reversão) é atingido pelo sinal de despolarização porque a ativação de uma fração de por cento da enorme quantidade de moléculas de rodopsina (~1 x 108) é suficiente para atingir o teto. A presença dos componentes de fototransdução em grande abundância garante que este teto seja atingido mesmo em mutantes com uma redução significativa na concentração ou defeito sutil dos componentes de fototransdução. Esta situação impede o isolamento desses mutantes. Pak et al. introduziram a triagem PDA7 buscando um teste confiável e revelador para isolar mutantes visuais. Em Drosophila, a resposta do PDA é provocada pela remoção genética do pigmento de triagem vermelho, que permite a conversão de fotopigment, e a aplicação da luz azul, que é preferencialmente absorvida por rodopsina (Figura 3A) e, assim, resulta em uma grande conversão líquida do R para o estado de fotopigmentação M. A terminação de fototransdução é interrompida ao nível do fotopigment por uma grande conversão líquida de R para M, o que, por sua vez, resulta em excitação sustentada muito depois que a luz é desligada (Figura 2C, Figura 4A [topo]). Durante o período PDA, os fotorreceptores são menos sensíveis às luzes de teste subsequentes e são parcialmente dessensibilizados (inativados). O PDA detecta mesmo pequenos defeitos na biógnese de rodopsina e testa a capacidade máxima da célula fotorreceptora para manter a excitação por um longo período. Uma vez que depende estritamente da presença de altas concentrações de rodopsina, ele pontua facilmente para reposição deficiente dos componentes de fototransdução. Notavelmente, a tela do PDA rendeu muitos mutantes visuais novos e muito importantes (revisados em Pak et al.7). Assim, os mutantes do PDA isolados por Pak et al.7 ainda são extremamente úteis para analisar o sistema visual Drosophila .
O PDA é induzido em Drosophila pela saturação da luz azul, resultando em despolarização contínua muito tempo após o deslocamento da luz (Figura 4A [topo]). Após saturar a luz azul indutora de PDA, os fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecem continuamente ativos no escuro em sua capacidade máxima, atingindo a saturação. Luzes azuis saturadas adicionais durante o PDA não produzem nenhuma resposta adicional em células R1-6 por muitos segundos, mas induzem uma resposta em células R7-8 que é sobreposta ao PDA. As respostas sobrepostas são explicadas pelos diferentes espectros de absorção dos fotopigmentamentos expressos nessas células (R7-8)16. O PDA pode ser suprimido pela fotoconversão de M de volta para R com luz laranja saturada (Figura 4A [topo]). A capacidade do PDA de trazer as células fotorreceptoras à sua capacidade ativa máxima, uma situação que não pode ser alcançada pela luz branca intensa, explica por que tem sido uma ferramenta importante para a triagem de mutantes visuais de Drosophila. Isso porque permite a detecção de pequenos defeitos em proteínas envolvidas na biogênese dos níveis normais de fotopigment17,18. Dois grupos de mutantes defeituosos do PDA foram isolados: nem inativação nem pós-potencial (nina) mutantes e inativação, mas não após mutantes (ina) ina. O fenótipo do primeiro é a falta de um PDA e a inativação associada decorrente de uma grande redução nos níveis de fotopigment (Figura 4A [meio]). O fenótipo deste último mostra inativação, mas sem despolarização escura após a luz azul devido a um mecanismo ainda desconhecido no mutante com níveis normais de rodopsina, mas sem proteínas interagindo com os canais TRP (Figura 4A [inferior]).
O PDA decorre da diferença na quantidade de fotopigment em relação à prisão (ARR2), que vincula e encerra a atividade M 19,20,21 (Figura 1A). Em fotorreceptores de Drosophila, a quantidade do fotopigment é cerca de cinco vezes maior que a quantidade de ARR219. Assim, os níveis de ARR2 são insuficientes para inativar todas as moléculas M geradas por uma grande fotoconversão líquida de R a M, deixando um excesso de M constantemente ativo no escuro 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica a eliminação da resposta do PDA por mutações ou por privação decarotenoides 24,25, causando uma redução no nível de fotopigment, mas não afeta os níveis de detenção. Além disso, essa explicação também explica os fenótipos do alelo mutante ARR2 (arr23)21, no qual o PDA poderia ser alcançado em intensidades de luz azul 19,20,21 (Figura 4B,C). O PDA não é uma característica única de fotorreceptores de mosca, e aparece em todas as espécies testadas que tem M estável escuro com um espectro de absorção diferente do estado R, permitindo fotoconversão suficiente do fotopigment do R para o estado M. Uma espécie minuciosamente investigada em que a fenomenologia do PDA foi descoberta é o fotoreceptor de craca (Balanus), no qual o espectro de absorção do estado R está em um comprimento de onda mais longo do que o estado M2 (Figura 3B). Assim, ao contrário da situação na mosca, na craca, a luz laranja-vermelha induz um PDA, enquanto a luz azul suprime o PDA2.
O protocolo de potencial receptor (ERP) inicial explora o deslocamento de carga que ocorre durante a ativação de R ou M. O pigmento visual é parte integrante da membrana superficial do compartimento de sinalização das membranas vertebrados e invertebrados3. Assim, o processo de ativação em que as moléculas de fotopigmento mudam de um estado intermediário para o outro é acompanhado por um deslocamentode carga 4,26. Como as moléculas de fotopigmentão estão eletricamente alinhadas em paralelo com a capacitância da membrana4, uma rápida mudança conformacional sincronizada gera uma rápida mudança de polarização da membrana superficial, que, em moscas, ocorre no compartimento de sinalização composto por uma pilha de ~30.000-50.000 microvilli chamado rabdomi. Essa polarização então descarrega passivamente através da capacitância da membrana do corpo celular até que a membrana celular esteja igualmente polarizada. O ERP é a gravação extracelular do deslocamento da carga. O ERP registrado intracelularmente manifesta o ERP extracelular integrado pela constante de tempo da membranacelular 4,27,28. A corrente ativada pelo deslocamento da carga de pigmento visual também poderia ser medida em gravações de tensão-grampo de tensão de células inteiras29,30 (Figura 5A-D), com a maior vantagem (nas gravações de corrente receptora precoce (ERC) de minimizar o efeito da capacitância da membrana na cinética do sinal.
A seção de protocolo descreve como realizar medições de ERG a partir de medições de olho Drosophila 9 e ERC por gravações de células inteiras de Drosophila isolada ommatidia31,32. Também descrevemos protocolos específicos que são usados para investigar a fototransdução em geral e fotopigments em particular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medindo a relação de resposta à intensidade, despolarização prolongada após o potencial (PDA) e o potencial do receptor precoce (ERP) usando o eletroretinograma
- Condições adequadas de criação para a preparação de D. melanogaster
- Raise D. melanogaster voa em garrafas contendo milho amarelo padrão contendo alimentos em uma incubadora mantida a uma temperatura de 24 °C e em um ciclo escuro/claro de 12 horas
- Mantenha as garrafas de mosca no escuro pelo menos 24 horas antes do experimento.
- Configuração geral
- Prepare as pipetas de gravação puxando 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) capilares de vidro borossilicato recheados de fibra (Figura 6L, O). A resistência das pipetas deve ser de 5-10 MΩ; qualquer puxador adequado pode ser usado.
- Cubra dois fios prateados com AgCl2, inserindo fio prata de 0,25 mm na solução de 3 M KCl conectada a uma fonte de alimentação 5 V personalizada.
- Insira cada fio de prata revestido nos suportes de eletrodos (Figura 6N).
- Encha o capilar de vidro com a solução filtrada do Ringer (ver Tabela 1) usando uma seringa de ponta alongada (Figura 6M).
- Insira o eletrodo do fio no capilar de vidro. Certifique-se de que a solução dentro do capilar esteja em contato com o fio de prata.
- Insira os suportes de eletrodos (Figura 7P, N) nos dois micromanipuladores de eletrodos (Figura 7G).
- Procedimento de preparação da mosca para gravações elétricas
NOTA: Para manter a mosca sob condições de adaptação escura, use apenas iluminação de luz vermelha fraca durante as etapas seguintes.- Anestesiar as moscas na garrafa com gás CO2 usando o sistema de dormente de mosca (Figura 6A, B) e despeje-as no recipiente adormecido.
- Escolha uma mosca e segure-a cuidadosamente pela asa usando uma pinça afiada. Cubra o resto das moscas com uma placa de Petri.
- Coloque a mosca no suporte de mosca no devido sentido deitado de lado, de costas para a mão (Figura 6P).
- Ligue a fonte de alimentação do ferro de solda. Defina a corrente para ~2,25 A. Esta corrente deve aquecer o filamento de platina de 0,25 mm para ~55-56 °C (ver Arquivo Suplementar).
- Coloque uma gota de cera com uma baixa temperatura de fusão (~55-56 °C) no ferro de solda (Figura 6F).
- Usando pinças, levante a mosca de suas asas e fixe suas asas ao suporte de mosca (Figura 6I) usando o ferro de solda.
- Usando o ferro de solda, conecte as costas da mosca à superfície do suporte com cera (Figura 6P).
- Abaixe a ponta do ferro de solda no ponto de junção das pernas e derreta a cera para cobrir todas as pernas juntas (Figura 6P).
- Coloque uma pequena gota de cera entre a cabeça e as costas na área do pescoço (Figura 6P).
NOTA: Tome cuidado especial para evitar superaquecimento da cabeça de mosca. Certifique-se de que a mosca está corretamente fixa e não pode se mover durante o experimento; pequenos movimentos podem criar artefatos nas gravações. Certifique-se de que as aberturas de traqueia (entradas respiratórias) no tórax e abdômen não estão cobertas com cera. - Coloque o suporte de mosca (Figura 7Q) em uma gaiola escura de Faraday em um bloco de ímã (Figura 7I) e certifique-se de que a mosca está ~5 mm da extremidade do guia de luz (Figura 7L).
- Coloque o eletrodo de gravação (Figura 7P) acima do olho da mosca e do eletrodo de terra (Figura 7N) sobre a parte superior traseira da mosca usando os micromanipuladores.
- Insira o eletrodo moído na parte de trás da mosca usando os micromanipuladores.
- Insira o eletrodo de gravação na periferia externa do olho da mosca, de preferência, utilizando os micromanípulos.
NOTA: Após inserir o eletrodo no olho, será observada uma pequena covinha; puxe o eletrodo para cima sem removê-lo do olho até que a covinha desapareça. Os eletrodos também podem ser imersos em pequenas gotículas de geleia de eletrodo aplicada no torso e no olho.
- Protocolo de resposta à intensidade
- Coloque um filtro laranja (filtro de borda de 590) na frente da lâmpada Xenon de alta pressão. Use um filtro grande (seis ordens de magnitude) atenuante da densidade neutra (ND).
- Espere 60 s no escuro e dê um pulso de luz de 5 s.
- Substitua o filtro ND por um filtro ND menos atenuante em uma ordem de incrementos de magnitude.
- Espere 60 s no escuro e dê um segundo pulso de luz de 5 s.
- Repetição passos 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente a intensidade da luz usando filtros ND menos atenuantes (o último pulso deve ser gerado sem filtro ND). Certifique-se de usar a série de filtros ND na direção adequada, começando a partir de uma grande atenuação e atingindo baixa atenuação.
- Protocolo PDA (este protocolo só pode ser realizado em moscas de olhos brancos)
- Dê um pulso de luz de 5 s de intensidade máxima usando um filtro laranja (filtro de borda de 590, para converter fotopigment máximo para o estado R).
- Substitua o filtro laranja por um filtro azul de banda larga (BP450/40 nm) e dê três pulsos de luz de 5 s em intensidade máxima.
NOTA: Também é possível dar um pulso de luz azul de intensidade máxima de longa intensidade contínua até que uma resposta de tensão de estado estável seja alcançada. - Aguarde 60 s no escuro, substitua o filtro azul pelo filtro laranja anterior e dê dois pulsos de luz de 5 s com intervalos de 60 s.
- Protocolo potencial ERP/M para medir o espectro de equilíbrio fotográfico de M (este protocolo só pode ser realizado em moscas de olhos brancos10,25)
- Dê um pulso de luz azul contínuo (bp) 450/40 nm) até atingir uma resposta de tensão de estado estável, que converte a quantidade máxima de fotopigment do estado R para o estado M das células R1-6.
- Dê um breve (<3 ms) flash de luz intenso de um comprimento de onda entre 350-700 nm (o espectro de absorção conhecido de fotopigment de células R1-6) usando estreito (~2 nm) filtros de bandpass e medem o pico de amplitude da fase M1 da resposta potencial M (que reflete a absorção de metarhodopsina neste comprimento de onda específico no foto-equilíbrio10,25).
NOTA: Para a ativação síncrono de uma grande piscina de moléculas de fotopigmentamento, é necessário um breve e intenso flash de luz para que o conteúdo do fóton seja embalado em curta duração. O potencial M é composto por dois componentes: M1 (fase negativa da córnea), que reflete o deslocamento de carga da metarhodopsina no fotoreceptor, e M2 (fase positiva da córnea11,33), que reflete a resposta amplificada M1 dos fotorreceptores na lamina 9,10,11 . Cada um desses componentes pode ser identificado e medido. No entanto, é preferível medir o potencial M1, pois é uma manifestação linear direta dos níveis M. Se o M2 for usado, certifique-se de que sua amplitude esteja na faixa linear usando privação de carotenoide leve24,25. - Dê um pulso de luz azul contínuo (BP450/40 nm) novamente, seguido por um breve (<1 ms) flash de luz intenso de um comprimento de onda diferente.
- Repita este protocolo até que todo o espectro de absorção de M no equilíbrio fotográfico esteja coberto.
2. Protocolo ERC para medir o espectro de ação dos estados R e M das células R1-6 usando gravações de grampo de tensão de células inteiras
NOTA: Para obter um protocolo detalhado para o uso de gravações de grampo de tensão de células inteiras, consulte Katz et al.34. O M-potencial utiliza o ERG para medir a ativação do estado M somente porque a contribuição do estado R é suprimida pela capacitância da membrana. Em contraste, o ERC mede a ativação tanto dos estados R (ERC positivos) quanto M (ERC negativo) porque as gravações de grampo de tensão removem o efeito da capacitância da membrana (ver introdução).
- Converta o fotopigment para o estado desejado (R ou M). Para conversão de R a M, primeiro, adapte as moscas por um breve (<1 ms) azul adaptativo (BP450/40 nm). Para conversão M para R, dê um curto flash laranja adaptativo (filtro de borda OG590).
- Dê um breve flash de luz (<1 ms) de um comprimento de onda entre 350-700 nm e meça a amplitude máxima negativa ou positiva da resposta ERC, que reflete a absorção M/R neste comprimento de onda específico.
NOTA: Para a ativação síncrono de uma grande piscina de moléculas de fotopigmentamento, é necessário um breve e intenso flash de luz para embalar o conteúdo do fóton em uma curta duração. A conversão máxima de fotopigment de R para M por flash azul pode atingir ~80% do total de moléculas de fotopigment por causa da sobreposição no espectro de absorção de R e M (Figura 3A). Portanto, em comprimentos de onda abaixo de ~550 nm, o ERC tem dois componentes: uma fase negativa que reflete a resposta da metarhodopsina, e uma fase positiva que reflete a resposta da rodopsina restante. O ERC depende linearmente da intensidade da luz (Figura 5D). Assim, para obter a sensibilidade espectral dos estados R e M, cada fase do ERC precisa ser normalizada nos vários comprimentos de onda para a energia igual29. - Repetia as etapas 2.1.-2.2. usando flashes de diferentes comprimentos de onda.
- Plote o ERC positivo e negativo normalizado em função do comprimento de onda.
NOTA: O forte flash de luz induz uma corrente maciça através dos canais sensíveis à luz levando ao estresse metabólico no fotorreceptor, o que, por sua vez, causa abertura de canal independente da luz. O ERC é sobreposto a esta corrente constituinte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 2 exemplifica a robustez e a facilidade de utilização da técnica ERG. É robusto porque é gravado na mosca praticamente intacta por uma técnica simples de gravações de tensão extracelular que requerem uma simples configuração eletrofisiológica. A robustez se manifesta pela obtenção de gravações de respostas de luz com amplitudes relativamente grandes (na faixa de milívolos) mesmo quando mutações reduzem fortemente ou distorcem a resposta à luz. Portanto, mesmo um experimentador inexperiente pode usar a configuração experimental altamente simples e aprender a obter resultados significativos em poucos dias. O principal objetivo da técnica projetada para medir os níveis de fotopigmentamento é alcançado por métodos extremamente simplificados do PDA (Figura 2C) e ERP (Figura 2C-E). A alternativa, ou seja, microspectrophotometria, requer equipamentos ópticos caros e treinamento e habilidade consideráveis (Figura 3B). O ERC (Figura 5A-D), embora tecnicamente desafiador, é menos sensível à preservação celular; caracteriza-se por uma alta relação sinal-ruído e a eliminação da capacitância da membrana.
Figura 1: O ciclo fotoquímico: a ativação e desativação do fotopigmentamento. (A) Iluminação azul saturada (seta azul ondulada) fotoconverte rhodopsin (R) à metarhodopsina (M). A fosforilação múltipla de M por quinase de rhodopsin e posterior vinculação de prisão em 2 (ARR2) inativa M. Luz laranja (seta vermelha ondulada) fotoconvertes M não fosfoillated de volta para R. O M não fosforilado ativa a proteína G heterotrimeric (Gqαβγ), causando a dissociação de Gqα de Gqβγ e a troca do PIB vinculado com o GTP citoplasmático. Gqα-GTP então ativa fosfolipase C (PLC), que hidrólise PIP2 para diacylglycerol (DAG) e trisfosfato inositol (IP3), ativando assim os canais TRP/TRPL de forma ainda pouco clara. Ca2+ calmodulin-dependent kinase (CaMKII) fosforila o complexo M pp-ARR2 e sofre endocitose dependente de clathrin e degradação. Iluminação com luz laranja (seta vermelha ondulada) fotoconvertes M pp-ARR2 complexo para R fosforilado (Rpp), liberando ARR2 para o citosol. A fosforilato R (Rpp) sofre desfosforilação pela fosfatase de rhodopsin (rdgC), produzindo R pronto para outro ciclo do fotopigmentamento. (B) Perfil de profundidade de ERG de mosca de olhos brancos para um estímulo branco de 1 s (coluna central) ou um flash estrobo branco (coluna à direita). Os estímulos são indicados por barras ou pontos abaixo dos traços. Os traços são organizados verticalmente em ordem de profundidade, com o traço superior gravado ~10 μm abaixo da córnea, com cada gravação subsequente 25 μm mais profunda que a anterior. À esquerda está uma câmera de desenho lucida de uma seção correspondente através de outro olho, indicando retina, membrana do porão (BM), casca laminar, cartuchos laminar (seccionado obliquamente) e casca de medullar. Este número foi modificado de Stephenson e Pak11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Gravações eletroretinogramas (ERG) de respostas leves do tipo selvagem de olhos brancos (w1118) e drosophila mutante mostrando a relação intensidade-resposta, despolarização prolongada pós-potencial (PDA) e potencial metarhodopsin (M-potencial). (A) Relação intensidade-resposta de uma mosca WT (w1118) obtida por uma série de luzes laranjas (filtro de borda OG590, a energia total emitida da borda do guia de luz usando o filtro laranja foi de 4 mW ) com intensidade de luz crescente indicada na escala de log. O inset mostra a resposta indicada em uma escala de tempo mais rápida. Inset: Os principais componentes do ERG são a resposta de tensão extracelular do fotoreceptor (potencial receptor), os transitórios "on" e "off" (ON, OFF response) no início e no final do estímulo de luz, e a resposta lenta das células glia (setas). (B) A amplitude média de pico das respostas ERG é traçada em função da intensidade relativa da luz. (C) O ERP de uma mosca WT (w1118) foi obtido pela aplicação de azul saturado (BP450/4 nm, a energia total emitida da borda do guia de luz usando o filtro azul foi de 1 mW) luz que inicialmente induz um PDA. O ERP (inset) foi obtido por um flash verde intenso (~70 J, 2 ms de duração) (seta, filtro de interferência de banda larga de 550 nm), que suprimiu o PDA. Inset: os vários componentes do ERP incluem o potencial M1 negativo da córnea e o potencial M2 positivo, como indicado. Também é indicado um resíduo em resposta transitória ("ON"). (D-E) A conversão de fotopigment é necessária para a indução do potencial M: (D) O potencial M foi obtido por um flash verde (filtro de interferência de banda larga de 550 nm) após adaptação azul, mas não por um flash azul (BP450/4 nm) após adaptação azul em WT (w1118) fly. (E) O protocolo de D foi repetido em WT (w1118 , traço preto) e duas moscas mutantes (PLC mutante nulo, norpAP24, traço laranja e mutante de rhodopsina hipomórfica, ninaEP318, traço vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Espectros de absorção de fotopigmentações de mosca e craca. (A) Espectros de absorção relativa de rodopsina mosca (R) e metarhodopsina (M) calculados a partir de medições fotométricas do espectro de diferença e do espectro foto-equilíbrio. Este número foi modificado de Selinger e Minke35. (B) Dois nomogramas dartnall com comprimentos de onda de pico a 492 nm e 532 nm, com uma razão de absorção máxima de 1,63:1, respectivamente. A diferença entre essas curvas dá o melhor ajuste ao espectro de diferença medido a partir do ocelli da craca Balanus eborneus, obtida por medições de transmissão na faixa de 400-650 nm após a saturação do azul monocromático (442 nm) e laranja (596 nm) adaptação. Este número foi modificado de Minke e Kirschfeld36. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O fenótipo PDA dos mutantes Nina, Ina e Arr2 . (A) O protocolo de indução e supressão do PDA em Drosophila. O protocolo de indução do PDA é composto por uma iluminação inicial usando pulso de luz laranja de intensidade máxima (filtro de borda de 590 bordas, a energia total emitida da borda do guia de luz usando o filtro laranja foi de 4 mW, barra laranja) seguida pela aplicação de três pulsos de luz azul de intensidade máxima (os pulsos2 e 3rd são para verificação de alcançar o PDA máximo, Filtro BP450/40 nm, a energia total emitida da borda da guia de luz usando o filtro azul foi de 1 mW, três barras azuis). A supressão do PDA foi obtida pela aplicação do pulso de luz laranja seguido pela aplicação de uma luz laranja adicional (duas barras laranja). O protocolo de indução e supressão do PDA foi repetido no mutante de olhos brancos do gene estrutural do fotopigment R1-6, ninaEP318 7 (meio). O protocolo de indução e supressão do PDA também foi repetido no mutante nulo de olhos brancos da proteína específica dos olhos quinase C (PKC32) inaCP209 (inferior). (B) Uma comparação entre a quantidade de luz azul necessária para a indução de um PDA entre WT de olhos brancos (W1118) e mutante Arr2 nulo (Arr23). Um trem de laranja alternado (filtros de borda saturados de 590) e azul (BP450/40 nm) pulsos de luz de intensidades de luz crescentes (ND em escala relativa de registro). À luz azul de intensidade de -log 1, um PDA é induzido (superior). O paradigma do traço superior foi repetido no mutante Arr23 mostrando que o PDA foi induzido à luz azul de ~10 dobras de luz dimmer (-log 2) intensidade (inferior). (C) Um trem de pulsos de luz azul dim (-log 2) de intensidade constante não conseguiu induzir um PDA na mosca W1118 (esquerda), enquanto o mesmo trem de luzes azuis fracas induziu um PDA pelo pulso de luz 1st no mutante Arr23 (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Registros de células inteiras de patch-clamp de respostas leves de ommatidia isolada, registradas a partir de WT de olhos brancos (w1118), mostrando geração de corrente receptora precoce (ERC) e sua relação intensidade-resposta. (A) Gravações de células inteiras de grampo de remendo de ommatidium isolado de mosca WT (w1118) de resposta ERC bifásica com latência sub-microsegundo. O estímulo de luz é composto por um intenso (~220 J, 0,8 ms de duração) flash de luz azul (filtro de banda larga com absorção máxima a 425 nm, seta) estimulação aplicada após forte adaptação ao verde-amarelo (filtro de banda larga com absorção máxima a 546 nm de luz, traço preto). No início da luz, um artefato elétrico rápido e negativo é observado. A fase negativa surge da ativação de M, e a fase positiva surge da ativação de R. A ativação da corrente induzida pela luz (LIC) manifesta-se pela fase negativa retardada decorrente da abertura dos canais sensíveis à luz. O mutante nulo ninaEI17 mostrou falta de resposta do ERC ao mesmo flash de luz aplicado ao ommatidium isolado (traço vermelho). (B) Medição ERC de fotopigmentamentos Rh1 registrados a partir da mesma célula que (A). O traço preto mostra resposta negativa monofásica (estado M) à estimulação de flash laranja da mosca WT (w1118) após forte adaptação à luz azul. (C) Amostra de traços de ERC bifásicos medidos a partir de uma única célula fotoreceptora de Drosophila transgênica (opn4;ninaEI17) expressando em êxtase os camundongos que expressam o foópio de melanopsina (opn4) em fotoreceptores de mosca R1-6 em resposta ao aumento das intensidades das luzes de flash brancas (em uma escala relativa -log I; ND indica filtros de densidade neutra). O início do flash é indicado pela seta. (D) O aumento da intensidade da luz se manifestou por um aumento linear na amplitude ERC de opn4;ninaEI17. Um gráfico da amplitude média de pico da fase negativa das respostas ERC (escala de registro) em função da intensidade relativa da luz (I/Imax, também em escala de log). A linha reta contínua representa uma curva de regressão linear que melhor se encaixa nos pontos experimentais (R2 = 0,99, as barras de erro são SEM, n = 5). Este número foi modificado de Yasin et al.29. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Ferramentas e dispositivos necessários para fixação de mosca e preparação de pipetas de gravação. (A) Sistema de dormente fly; (B) Pedal do sistema de sono voador; (C) Fonte de luz fria; (D) microscópio estereoscópico; (E) Aquecedor de filamento de cera; (F) Ferro de solda; (G) Pedal aquecedor de filamento de cera; (H) Pinças ásperas; (I) Suporte de mosca magnética; (J) Cera de baixa temperatura de fusão; (K) Lenços delicados; (L) Puxador de pipeta vertical; (M) Seringa com ponta alongada; (N) Detentores de eletrodos; (O) Capilares de vidro borossilicato; (P) Mosca fixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Visão geral do gerador de pulso ERG. (A) ; (B) Computador; (C) Conversor A/D; (D) Amplificador; (E) microscópio estereoscópico; (F) Micromanipulador (multa mecânica); (G) Sistema de pré-amplificador microeletríndeo com estágio frontal; (H) Tabela anti vibração; (I) Bloco de ímãs ligados/ desligados; (J) Micromanipulador (coarse mecânico); (K) Gaiola de Faraday; (L) Guia de luz da fonte de luz xenon; (M) Guia de luz do sistema de luz flash; (N) Suporte de eletrodos de terra; (O) Detector de luz; (P) Suporte de eletrodo de gravação; (Q) Suporte de mosca magnética; (R) Fonte de alimentação da lâmpada de xenônio; (S) Os filtros de cor e ND permanecem; (T) Banco óptico; (U) Sistema de lâmpadas flash; (V) Motorista de obturador; (W) Fonte de alimentação da lâmpada; (X) Sistema de luz flash xenon Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução de Ringer | |
| Reagente | Concentração (mM) |
| NaCl | 130 |
| Kcl | 2 |
| MgCl2 | 5 |
| CaCl2 | 2 |
| HEPES | 10 |
| titulação de pH para 7,15 usando NaOH e HCl | |
Tabela 1: Composição da solução de Ringer.
Arquivo suplementar 1: Diagrama do circuito do regulador de derretimento da cera. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A maior vantagem do uso da preparação do fotorreceptor Drosophila é sua acessibilidade, a facilidade e precisão da estimulação da luz e, o mais importante, a capacidade de aplicar o poder da genética molecular7. Estudos genéticos extensivos estabeleceram o Drosophila como um sistema modelo extremamente útil para a dissecção genética de processos biológicos complexos7. A estrutura relativamente simples do genoma de Drosophila (composto por apenas quatro cromossomos, incluindo os cromossomos sexuais X e Y, dois elementos autossômicos maiores, cromossomos 2 e 3, e o pequeno quarto cromossomo), facilidade de crescimento e tempo de geração rápida (~2 semanas a 24 °C) tornam a Drosophila adequada para a triagem de grandes números de moscas individuais mutagenizadas. Além disso, o isolamento e a manutenção de qualquer mutação isolada tornam-se possíveis devido à geração de cromossomos balanceador, contendo marcadores dominantes e inversões múltiplas, que impedem a recombinação com os cromossomos nativos. As ferramentas moleculares disponíveis permitiram estudar produtos genéticos in vitro modificados em seu ambiente celular nativo37. Esta poderosa metodologia produziu uma infinidade de moscas mutantes com defeitos em novas proteínas que teriam sido difíceis de prever7.
A principal vantagem de usar o ERG para medições dos níveis de fotopigment e sensibilidade à luz é sua simplicidade e facilidade de aplicação e grande relação sinal-ruído. A desvantagem de usar o ERG é sua origem celular heterogênica, distorcendo a forma de onda da resposta à luz decorrente dos fotorreceptores9. A maior vantagem das gravações de células inteiras de repressão à tensão é a capacidade de obter mudanças de condutância medindo a relação corrente-tensão (I-V). A abertura e o fechamento dos canais TRP e TRPL durante e seguindo a iluminação são refletidos por esta medição13. Além disso, uma alta relação sinal-ruído é obtida devido à baixa resistência da pipeta de gravação (~10 MΩ) e à medição das correntes, permitindo medições confiáveis de lombadas quânticas (respostas de fótons únicos), o que é útil para calibrar a intensidade de luz efetiva38. Uma grande desvantagem das gravações de células inteiras de patch-clamp é que, embora as gravações de ERG possam ser mantidas por horas, mesmo sob intensidades extremas de luz, é difícil realizar gravações de células inteiras confiáveis por mais de 15-30 minutos, e a estimulação de luz fraca é necessária para gravações prolongadas. Para obter gravações de células inteiras, é necessário contato direto entre a pipeta de gravação e a membrana fotorreceptora. O contato direto é obtido removendo as células pigmentais (glial) ao redor da ommatidia34 (Figura 1B). A remoção de células pigmentadas causa estresse metabólico porque a célula fotorreceptora não pode sintetizar os metabólitos necessários para a produção de triptofato de adenosina (ATP), interrompendo o fornecimento metabólico39. Uma vez que os canais TRP e TRPL são vulneráveis à anoxia e facilmente abrem espontaneamente no escuro devido ao esgotamento da ATP, o uso de ommatidia isolada impõe grande dificuldade40,12. Todo o procedimento tem que ser feito sob luz vermelha fraca porque a resposta de luz induz um grande consumo de ATP34.
A maioria das mutações na cascata de fototransdução induz uma diminuição da sensibilidade à luz. Essa redução da sensibilidade à luz pode ser facilmente detectada por uma tela baseada na medição da relação intensidade-resposta. Paradigmas de intensidade-resposta são alcançados por repetidas estimulações de luz com intensidade crescente em escala logarítmica. O aumento (e não a diminuição) das intensidades da luz laranja são necessários para evitar a adaptação à luz. O ERG (M-potencial) e o PDA são métodos altamente simples de medir os níveis de fotopigmentação. A alternativa, ou seja, microspectrophotometria36, requer equipamentos ópticos caros e treinamento e habilidade consideráveis.
Para concluir, o ERG é uma ferramenta simples de aplicar, mas relativamente imprecisa. A gravação de célulasinteiras 31 é precisa para medir os níveis de fotopigmentamento usando o ERC, e é essencial para compensar a imprecisão e limitações do ERG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Israel Science Foundation (ISF) e da United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Agradecemos ao Sr. Anatoly Shapochnikov pela construção do aquecedor de filamento de cera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
| 1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
| 2 condenser lenses | |||
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
| Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
| Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
| Clampex | Molecular Device | Software | |
| CO2 tank | |||
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
| Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
| Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
| Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
| Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
| Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
| Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
| Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
| Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
| Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
| Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
| Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
| Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
| Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
| Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
| Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
| pCLAMP | Molecular Device | Software | |
| Petri dish | 60 mm | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
| Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
| Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
| Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
| Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
| Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |
References
- Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
- Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
- Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
- Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
- Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
- Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
- Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
- Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
- Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
- Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
- Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
- Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
- Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
- Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
- Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
- Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
- Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
- Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
- Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
- Cone, R. A., Cobbs, W. H.
- Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
- Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
- Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
- Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
- Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
- Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
- Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
- Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
