Summary
We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.
Abstract
Het Drosophila G-eiwit-gekoppelde fotopigment rhodopsine (R) bestaat uit een eiwit (opsine) en een chromofoor. Het activeringsproces van rhodopsine wordt geïnitieerd door fotonabsorptie-inducerende isomerisatie van de chromofoor, waardoor conformatieveranderingen van het opsine worden bevorderd en resulteert in een tweede donkerstabiele fotopigmenttoestand (metarhodopsine, M). Onderzoek van dit bi-stabiele fotopigment met behulp van willekeurige mutagenese vereist eenvoudige en robuuste methoden voor het screenen van gemuteerde vliegen. Daarom zijn verschillende methoden ontworpen voor het meten van verminderingen van functionele fotopigmentniveaus. Een dergelijke methode maakt gebruik van de ladingsverplaatsingen in het fotopigment na fotonabsorptie en de enorme hoeveelheden fotopigmentmoleculen die tot expressie komen in de fotoreceptoren. Dit elektrische signaal, genaamd de vroege receptorpotentiaal (of vroege receptorstroom), wordt gemeten met een verscheidenheid aan elektrofysiologische methoden (bijv. Elektroretinogram en hele celopnamen) en is lineair evenredig met functionele fotopigmentniveaus. De voordelen van deze methode zijn de hoge signaal-ruisverhouding, directe lineaire meting van fotopigmentniveaus en onafhankelijkheid van fototransductiemechanismen stroomafwaarts tot rhodopsine- of metarhodopsineactivering. Een aanvullende elektrofysiologische methode genaamd prolonged depolarizing afterpotential (PDA) maakt gebruik van de bi-stabiliteit van Drosophila fotopigment en de absorptie-spectrale verschillen van vlieg R- en M-pigmenttoestanden. De PDA wordt geïnduceerd door intens blauw licht, waarbij verzadigde hoeveelheden rhodopsine worden omgezet in metarhodopsine, wat resulteert in het falen van lichtresponsbeëindiging voor een langere tijd in het donker, maar het kan worden beëindigd door metarhodopsine naar rhodopsine conversie met behulp van intens oranje licht. Omdat de PDA een robuust signaal is dat een massale fotopigmentconversie vereist, leiden zelfs kleine defecten in de biogenese van het fotopigment tot gemakkelijk gedetecteerde abnormale PDA. Defecte PDA-mutanten leidden inderdaad tot de identificatie van nieuwe signaaleiwitten die belangrijk zijn voor fototransductie.
Introduction
De lichtgeactiveerde rhodopsine (R), een G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR), bestaat uit een 7 transmembraaneiwit (opsine) en een chromofoor. In Drosophila melanogaster (fruitvlieg) induceert fotonabsorptie isomerisatie van de 11-cis-3-OH-retinale chromofoor tot all-trans-3-OH-retinal1, waardoor de conformationele verandering van de rhodopsine naar metarhodopsine wordt bevorderd (M, figuur 1A). In tegenstelling tot gewervelde rhodopsine dissocieert de overheersende fractie van ongewervelde chromofoor zich niet van het opsine, wat resulteert in de fysiologisch actieve donkerstabiele pigmenttoestand M. Op zijn beurt induceert extra fotonabsorptie door de all-trans-3-OH-retinale chromofoor isomerisatie van de chromofoor 2,3, waardoor de R-pigmenttoestand wordt gegenereerd met de 11-cis-3-OH-retinale chromofoor. De R-toestand is een donker, stabiel en fysiologisch niet-actief fotopigment. Naast de extreem snelle fotonregeneratieroute van de chromofoor4, net als gewervelde fotopigmenten, bestaat er een alternatieve enzymatische langzame route voor chromofoorregeneratie bij ongewervelde dieren, waarbij sommige stadia worden uitgevoerd in retinale cellen rond de fotoreceptorencellen 5,6.
Drosophila heeft grote voordelen als modelorganisme voor het bestuderen van ongewervelde fotoreceptoren. Met name de toegankelijkheid van het preparaat en het vermogen om moleculaire genetica toe te passen hebben Drosophila tot een krachtig modelsysteem gemaakt7. Daarom zijn er verschillende in vivo en ex vivo experimentele methoden vastgesteld voor het bestuderen van fototransductie in het algemeen en fotopigmentniveaus in het bijzonder. De eenvoudigste in-vivo methode maakt gebruik van de relatief grote extracellulair geregistreerde spanningsrespons op het licht van het Drosophila-oog. Dienovereenkomstig roept lichtstimulatie een elektrische spanningsrespons op in het hele oog die kan worden gemeten met behulp van extracellulaire elektroretinogram (ERG) -opname, die ~ 3 ordes van grootte groter is dan de ERG-respons op licht van gewervelde ogen 8,9. De Drosophila ERG-respons is robuust en gemakkelijk te verkrijgen, waardoor het een handige methode is voor het identificeren van afwijkingen in lichtrespons als gevolg van mutaties. De ERG-reactie op licht ontstaat voornamelijk uit de fotoreceptoren, pigmentcellen (glia) en secundaire neuronen van de lamina (zie figuur 1B). De belangrijkste componenten van de ERG zijn (i) de extracellulaire spanningsrespons van de fotoreceptoren, (ii) de "aan" en "uit" transiënten aan het begin en einde van de lichtprikkel die voortkomen uit de lamina neuronen (figuur 2A, inzet, AAN, UIT), (iii) de langzame respons van de gliacellen (figuur 2A, inzet, pijlen), en (iv) de korte en voorbijgaande respons, als gevolg van ladingsverplaatsing tijdens fotopigmentactivering die voorafgaat aan de ON-transiënte10 (figuur 2C [inzet], D, E). Deze korte respons bestaat uit twee fasen (M1 en M2, figuur 2C [inzet]) en kan alleen worden geïnduceerd door extreem sterke lichtstimulatie, die tegelijkertijd miljoenen fotopigmentmoleculen activeert. Het wordt niet waargenomen onder blauwe stimulatie (figuur 2D, blauw spoor) noch in mutanten met sterk verlaagde fotopigmentniveaus (figuur 2E, rood spoor), maar de amplitude is licht verbeterd in een mutant die plc-activiteit elimineert (figuur 2E, oranje spoor). De M1-fase is een typisch ERP van de vlieg die ontstaat door de activering van M in de fotoreceptoren. De M1-fase, die een positieve polariteit heeft (intracellulair), geeft een neurotransmitter op de normale manier vrij in een teken-omkerende synaps en activeert de lamina-neuronen, die reageren op de fotoreceptor-depolarisatie door de synaptisch versterkte M2-fase te genereren. Zowel de M1- als de M2-fase weerspiegelen dus M-activering10,11.
De depolarisatie van de fotoreceptor genereert de cornea-positieve "aan" transiënt, voortkomend uit de teken-omkerende synaps tussen het fotoreceptor axon en de monopolaire neuronen van de lamina 10,11 (figuur 1B). De langzame opkomst en het verval van de ERG ontstaan door de depolarisatie van de pigmentcellen (figuur 2A, inzet, pijlen) voornamelijk als gevolg van K+ efflux van de fotoreceptorcellen12 via de transiënte receptorpotentiaal (TRP) en TRP-achtige (TRPL) kanalen 13,14,15. Deze langzame kinetische componenten maskeren en vervormen grotendeels de golfvorm van de fotoreceptorrespons in vergelijking met intracellulaire of hele celopnamen van de fotoreceptorrespons op licht 9,10. Bovendien kan bij zeer sterke verlichting een extra transiënte respons worden waargenomen, die voorafgaat aan en gedeeltelijk fuseert met de transiënt "aan", (figuur 2C [inzet],D,E). Dit signaal is rechtstreeks afkomstig van de massale activering van het fotopigment10.
Verschillende lichtregimeprotocollen met behulp van neutrale dichtheid (ND) en kleurfilters, evenals sterke lichtgevende flitsen, zijn ontwikkeld om het oog in het algemeen en de fototransductiecascade in het bijzonder te onderzoeken. Deze protocollen zijn ook gebruikt om de eigenschappen van het fotopigment te onderzoeken.
Het intensiteitsresponsprotocol meet de piekamplitude van de ERG-spanningsrespons van het hele oog op toenemende lichtintensiteiten (figuur 2A,B). Dit protocol helpt bij het detecteren van veranderingen in de gevoeligheid van de fotoreceptorcellen voor licht9.
Het langdurige depolariserende afterpotentiële (PDA) protocol maakt gebruik van de verschillen in de absorptiespectra van rhodopsine en metarhodopsine dat in Drosophila een massale fotopigmentconversie van R naar zijn fysiologisch actieve en donkerstabiele intermediaire M-toestand2 mogelijk maakt. In de ERG-spanningsrespons wordt een relatief korte puls van verzadigingslicht gegeven en wordt de resulterende spanningsrespons geregistreerd. Onder deze voorwaarde wordt een plafond (omkeerpotentiaal) bereikt door het depolarisatiesignaal omdat activering van een fractie van een procent van de enorme hoeveelheid rhodopsinemoleculen (~ 1 x 108) voldoende is om het plafond te bereiken. De aanwezigheid van de fototransductiecomponenten in grote overvloed zorgt ervoor dat dit plafond zelfs in mutanten wordt bereikt met een aanzienlijke concentratievermindering of subtiele storing van de fototransductiecomponenten. Deze situatie sluit de isolatie van deze mutanten uit. Pak et al. introduceerden de PDA-screening7 op zoek naar een betrouwbare en onthullende test om visuele mutanten te isoleren. In Drosophila wordt de PDA-respons tot stand gebracht door het genetisch verwijderen van het rode screeningpigment, wat fotopigmentconversie mogelijk maakt, en de toepassing van blauw licht, dat bij voorkeur wordt geabsorbeerd door rhodopsine (figuur 3A) en dus resulteert in een grote nettoconversie van de R naar de M-fotopigmenttoestand. De beëindiging van de fototransductie wordt op het niveau van het fotopigment verstoord door een grote nettoconversie van R naar M, wat op zijn beurt resulteert in aanhoudende excitatie lang nadat het licht is uitgeschakeld (figuur 2C, figuur 4A [boven]). Tijdens de PDA-periode zijn de fotoreceptoren minder gevoelig voor volgende testlichten en gedeeltelijk ongevoelig (geïnactiveerd). De PDA detecteert zelfs kleine defecten in rhodopsinebiogenese en test de maximale capaciteit van de fotoreceptorcel om excitatie gedurende een langere periode te behouden. Omdat het strikt afhankelijk is van de aanwezigheid van hoge concentraties rhodopsine, scoort het gemakkelijk voor gebrekkige aanvulling van de fototransductiecomponenten. Opmerkelijk is dat het PDA-scherm veel nieuwe en zeer belangrijke visuele mutanten heeft opgeleverd (besproken in Pak et al.7). De PDA-mutanten geïsoleerd door Pak et al.7 zijn dus nog steeds uiterst nuttig voor het analyseren van het drosophila visuele systeem.
De PDA wordt geïnduceerd in Drosophila door blauw licht te verzadigen, wat resulteert in continue depolarisatie lang na lichtverschuiving (figuur 4A [boven]). Na het verzadigen van PDA-inducerend blauw licht, blijven de perifere fotoreceptoren (R1-6) continu actief in het donker met hun maximale capaciteit en bereiken ze verzadiging. Extra verzadigde blauwe lichten tijdens de PDA produceren gedurende vele seconden geen extra respons in R1-6-cellen, maar induceren een respons in R7-8-cellen die op de PDA wordt gesuperponeerd. De gesuperponeerde reacties worden verklaard door de verschillende absorptiespectra van de fotopigmenten die in deze cellen tot expressie komen (R7-8)16. De PDA kan worden onderdrukt door de fotoconversie van M terug naar R met verzadigingsoranje licht (figuur 4A [boven]). Het vermogen van de PDA om de fotoreceptorcellen naar hun maximale actieve capaciteit te brengen, een situatie die niet kan worden bereikt door intens wit licht, verklaart waarom het een belangrijk hulpmiddel is geweest om te screenen op visuele mutanten van Drosophila. Dit komt omdat het de detectie mogelijk maakt van zelfs kleine defecten in eiwitten die betrokken zijn bij de biogenese van normale fotopigmentniveaus17,18. Twee groepen PDA-defecte mutanten zijn geïsoleerd: noch inactivatie noch afterpotentiële (nina) mutanten en inactivatie, maar geen napotentiële (ina) mutanten. Het fenotype van de eerste is een gebrek aan een PDA en de bijbehorende inactivatie als gevolg van een grote verlaging van de fotopigmentspiegels (figuur 4A [midden]). Het fenotype van de laatste vertoont inactivatie, maar geen donkere depolarisatie na blauw licht als gevolg van een nog onbekend mechanisme in de mutant met normale rhodopsinespiegels maar zonder eiwitten die interageren met de TRP-kanalen (figuur 4A [onder]).
De PDA komt voort uit het verschil in de hoeveelheid fotopigment ten opzichte van arrestine (ARR2), dat M-activiteit 19,20,21 bindt en beëindigt (figuur 1A). Bij Drosophila-fotoreceptoren is de hoeveelheid van het fotopigment ongeveer vijf keer groter dan de hoeveelheid ARR219. ARR2-niveaus zijn dus onvoldoende om alle M-moleculen te inactiveren die worden gegenereerd door een grote netto fotoconversie van R naar M, waardoor een overmaat aan M constant actief is in het donker 17,19,20,22,23. Dit mechanisme verklaart de eliminatie van de PDA-respons door mutaties of door carotenoïddeprivatie24,25, waardoor het fotopigmentniveau afneemt, maar geen invloed heeft op de arrestinespiegels. Bovendien verklaart deze verklaring ook de fenotypen van null ARR2 (arr23) mutant allel21, waarin PDA kon worden bereikt bij ~10-voudige dimmer blauwlichtintensiteiten 19,20,21 (figuur 4B,C). De PDA is geen uniek kenmerk van vliegenfotoreceptoren en komt voor bij elke geteste soort met een donker stabiel M-spectrum met een absorptiespectrum dat verschilt van dat van de R-toestand, waardoor voldoende fotoconversie van het fotopigment van de R naar de M-toestand mogelijk is. Een grondig onderzochte soort waarbij de PDA-fenomenologie werd ontdekt, is de barnakel (Balanus) fotoreceptor, waarbij het absorptiespectrum van de R-toestand zich in een langere golflengte bevindt dan de M-toestand2 (figuur 3B). Dienovereenkomstig induceert oranjerood licht, in tegenstelling tot de situatie in de vlieg, oranjerood licht een PDA, terwijl blauw licht de PDA2 onderdrukt.
Het early receptor potential (ERP) protocol maakt gebruik van de ladingsverplaatsing die optreedt tijdens R- of M-activering. Het visuele pigment is een integraal onderdeel van het oppervlaktemembraan van het signaleringscompartiment van zowel gewervelde als ongewervelde membranen3. Dienovereenkomstig gaat het activeringsproces waarbij de fotopigmentmoleculen van de ene tussentoestand naar de volgende veranderen, gepaard met een ladingsverplaatsing 4,26. Omdat de fotopigmentmoleculen elektrisch parallel aan de membraancapaciteit4 zijn uitgelijnd, genereert een snelle gesynchroniseerde conformatieverandering een snelle polarisatieverandering van het oppervlaktemembraan, die bij vliegen optreedt in het signaleringscompartiment dat bestaat uit een stapel van ~ 30.000-50.000 microvilli genaamd rhabdomere. Deze polarisatie ontlaadt vervolgens passief door de membraancapaciteit van het cellichaam totdat het celmembraan even gepolariseerd is. Het ERP is de extracellulaire registratie van de ladingsverplaatsing. Het intracellulair geregistreerde ERP manifesteert het extracellulaire ERP geïntegreerd door de tijdconstante van het celmembraan 4,27,28. De stroom die wordt geactiveerd door de verplaatsing van de visuele pigmentlading kan ook worden gemeten in hele-cel spanningsklemopnamen29,30 (figuur 5A-D), met als groot voordeel (in vroege receptorstroom (ERC) opnames) van het minimaliseren van het effect van membraancapaciteit op de kinetiek van het signaal.
De protocolsectie beschrijft hoe ERG-metingen van Drosophila eye9 en ERC-metingen kunnen worden uitgevoerd door hele-celopnamen van Drosophila geïsoleerde ommatidia31,32. We beschrijven ook specifieke protocollen die worden gebruikt om fototransductie in het algemeen en fotopigmenten in het bijzonder te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het meten van de intensiteitsresponsrelatie, langdurige depolariserende afterpotentiële (PDA) en de vroege receptorpotentiaal (ERP) met behulp van het elektroretinogram
- Geschikte opfokomstandigheden voor D. melanogaster bereiding
- Raise D. melanogaster vliegt in flessen met standaard gele maïs bevattend voedsel in een incubator die op een temperatuur van 24 °C wordt gehouden en in een 12 uur donkere/lichte cyclus
- Houd de vliegenflessen ten minste 24 uur voorafgaand aan het experiment in het donker.
- Algemene installatie
- Bereid opnamepipetten voor door 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) met vezels gevulde borosilicaatglascapillairen te trekken (figuur 6L, O). De weerstand van de pipetten moet 5-10 MΩ zijn; elke geschikte trekker kan worden gebruikt.
- Bekleed twee zilveren draden met AgCl2 en steek 0,25 mm zilverdraad in een 3 M KCl-oplossing die is aangesloten op een op maat gemaakte 5 V-voeding.
- Steek elke gecoate zilverdraad in de elektrodehouders (figuur 6N).
- Vul het glazen capillair met gefilterde Ringer's oplossing (zie tabel 1) met een langwerpige tipspuit (figuur 6M).
- Steek de draadelektrode in het glazen capillair. Zorg ervoor dat de oplossing in het capillair in contact komt met de zilverdraad.
- Plaats de elektrodehouders (figuur 7P, N) in de twee elektrodemicromanipators (figuur 7G).
- Procedure voor het voorbereiden van de vlieg op elektrische opnames
OPMERKING: Om de vlieg onder aan het donker aangepaste omstandigheden te houden, gebruikt u alleen gedimde rode lichtverlichting tijdens de volgende stappen.- Verdoof de vliegen in de fles met CO2-gas met behulp van het vliegenslapersysteem (figuur 6A, B) en giet ze in de slaapcontainer.
- Kies één vlieg en houd hem voorzichtig bij zijn vleugel met een scherp pincet. Bedek de rest van de vliegen met een petrischaaltje.
- Plaats de vlieg op de vlieghouder in de juiste richting liggend op zijn kant, met zijn rug naar de hand (figuur 6P).
- Zet de voeding van de soldeerbout AAN. Stel de stroom in op ~2,25 A. Deze stroom moet de 0,25 mm platina-iridiumfilament verwarmen tot ~55-56 °C (zie Aanvullend bestand).
- Plaats een druppel was met een lage smelttemperatuur (~55-56 °C) op de soldeerbout (figuur 6F).
- Til de vlieg met een pincet van zijn vleugels en bevestig zijn vleugels aan de vlieghouder (figuur 6I) met behulp van de soldeerbout.
- Verbind met behulp van de soldeerbout de rug van de vlieg met was op het standaardoppervlak (figuur 6P).
- Laat de punt van de soldeerbout op het verbindingspunt van de poten zakken en smelt de was om alle poten samen te bedekken (figuur 6P).
- Plaats een kleine druppel was tussen het hoofd en de rug in het nekgebied (figuur 6P).
OPMERKING: Wees extra voorzichtig om oververhitting van de vliegenkop te voorkomen. Zorg ervoor dat de vlieg goed is gefixeerd en niet in staat is om te bewegen tijdens het experiment; kleine bewegingen kunnen artefacten in de opnames creëren. Zorg ervoor dat de luchtpijpopeningen (ademhalingsinlaten) in de thorax en buik niet bedekt zijn met was. - Plaats de vliegenhouder (figuur 7Q) in een donkere kooi van Faraday op een magneetblok (figuur 7I) en zorg ervoor dat de vlieg zich op ~5 mm van het uiteinde van de lichtgeleider bevindt (figuur 7L).
- Plaats de opname-elektrode (figuur 7P) boven het oog van de vlieg en de grondelektrode (figuur 7N) over de bovenrug van de vlieg met behulp van de micromanipulators.
- Plaats de grondelektrode in de achterkant van de vlieg met behulp van de micromanipulators.
- Plaats de opname-elektrode in de buitenste periferie van het oog van de vlieg, bij voorkeur met behulp van de micromanipulators.
OPMERKING: Na het inbrengen van de elektrode in het oog, zal een klein kuiltje worden waargenomen; trek de elektrode naar boven zonder deze uit het oog te verwijderen totdat het kuiltje verdwijnt. De elektroden kunnen ook worden ondergedompeld in kleine druppeltjes elektrodegelei die op de romp en het oog worden aangebracht.
- Intensiteit-respons protocol
- Plaats een oranje filter (590 edge filter) voor de hogedruk Xenon lamp. Gebruik een groot (zes ordes van grootte) dempend ND-filter (neutral density).
- Wacht 60 s in het donker en geef een 5 s lichtpuls.
- Vervang het ND-filter door een minder dempend ND-filter in stappen van één orde van grootte.
- Wacht 60 s in het donker en geef een tweede 5 s lichtpuls.
- Herhaal stap 1.4.1.-1.4.4, waarbij de lichtintensiteit geleidelijk wordt verhoogd met minder dempende ND-filters (de laatste puls moet worden gegenereerd zonder ND-filter). Zorg ervoor dat u de reeks ND-filters in de juiste richting gebruikt, beginnend bij grote demping en het bereiken van lage demping.
- PDA-protocol (dit protocol kan alleen worden uitgevoerd op witoogvliegen)
- Geef een 5 s lichtpuls van maximale intensiteit met behulp van een oranje filter (590 rand filter, om maximaal fotopigment om te zetten naar de R-toestand).
- Vervang het oranje filter door een breedband blauw (BP450/40 nm) filter en geef drie 5 s lichtpulsen op maximale intensiteit.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om een lange continue maximale intensiteit blauwe lichtpuls te geven totdat een steady-state spanningsrespons is bereikt. - Wacht 60 s in het donker, vervang het blauwe filter door het vorige oranje filter en geef twee 5 s lichtpulsen met intervallen van 60 s.
- ERP/M-potentiaalprotocol voor het meten van het foto-evenwichtsspectrum van M (dit protocol kan alleen worden uitgevoerd op witoogvliegen10,25)
- Geef een continue blauwe (bandpass (BP) 450/40 nm) lichtpuls totdat een steady-state spanningsrespons wordt bereikt, die de maximale hoeveelheid fotopigment van de R-toestand omzet in de M-toestand van R1-6-cellen.
- Geef een korte (<3 ms) intense lichtflits van een golflengte tussen 350-700 nm (het bekende absorptiespectrum van R1-6 cellen fotopigment) met behulp van smalle (~ 20 nm) bandpassfilters en meet de piekamplitude van de M1-fase van de M-potentiaalrespons (die de metarhodopsineabsorptie bij deze specifieke golflengte bij foto-evenwicht 10,25 weerspiegelt).
OPMERKING: Voor synchrone activering van een grote pool van fotopigmentmoleculen is een korte, intense lichtflits vereist, zodat het fotonengehalte in korte tijd wordt verpakt. De M-potentiaal bestaat uit twee componenten: M1 (corneanegatieve fase), die de ladingsverplaatsing van de metarhodopsine in de fotoreceptor weerspiegelt, en M2 (corneapositieve fase11,33), die de versterkte M1-respons van de fotoreceptoren in de lamina 9,10,11 weerspiegelt . Elk van deze componenten kan worden geïdentificeerd en gemeten. Het verdient echter de voorkeur om de M1-potentiaal te meten, omdat het een directe lineaire manifestatie is van de M-niveaus. Als M2 wordt gebruikt, zorg er dan voor dat de amplitude binnen het lineaire bereik ligt door milde carotenoïde deprivatie24,25 te gebruiken. - Geef opnieuw een continue blauwe (BP450/40 nm) lichtpuls, gevolgd door een korte (<1 ms) intense lichtflits van een andere golflengte.
- Herhaal dit protocol totdat het volledige absorptiespectrum van M bij foto-evenwicht is gedekt.
2. ERC-protocol voor het meten van het actiespectrum van R- en de M-toestanden van R1-6-cellen met behulp van spanningsklemregistraties voor hele cellen
OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol voor het gebruik van spanningsklemopnamen voor hele cellen, zie Katz et al.34. De M-potentiaal gebruikt de ERG alleen om de activering van de M-toestand te meten omdat de bijdrage van de R-toestand wordt onderdrukt door de membraancapaciteit. Daarentegen meet de ERC de activering van zowel R (positieve ERC) als M (negatieve ERC) toestanden omdat spanning-klemregistraties het effect van membraancapaciteit wegnemen (zie inleiding).
- Converteer het fotopigment naar de gewenste toestand (R of M). Voor R naar M conversie, eerst, pas de vliegen aan door een korte (<1 ms) adaptieve blauwe (BP450/40 nm) flits. Geef voor M naar R-conversie een korte adaptieve oranje (OG590 edge filter) flitser.
- Geef een korte lichtflits (<1 ms) van een golflengte tussen 350-700 nm en meet de maximale negatieve of positieve amplitude van de ERC-respons, die de M/R-absorptie op deze specifieke golflengte weerspiegelt.
OPMERKING: Voor synchrone activering van een grote pool van fotopigmentmoleculen is een korte, intense lichtflits vereist om het fotonengehalte in korte tijd te verpakken. De maximale fotopigmentconversie van R naar M door blauwe flits kan ~80% van de totale fotopigmentmoleculen bereiken vanwege de overlap in het absorptiespectrum van R en M (figuur 3A). Daarom heeft de ERC bij golflengten onder ~550 nm twee componenten: een negatieve fase die de respons van de metarhodopsine weerspiegelt en een positieve fase die de respons van de resterende rhodopsine weerspiegelt. De ERC is lineair afhankelijk van de lichtintensiteit (figuur 5D). Om de spectrale gevoeligheid van R- en M-toestanden af te leiden, moet elke fase van de ERC worden genormaliseerd op de verschillende golflengten voor gelijke energie29. - Herhaal stap 2.1.-2.2. met behulp van flitsen van verschillende golflengten.
- Plot de genormaliseerde positieve en negatieve ERC als functie van de golflengte.
OPMERKING: De sterke lichtflits induceert een enorme stroom door de lichtgevoelige kanalen, wat leidt tot metabole stress op de fotoreceptor, wat op zijn beurt lichtonafhankelijke kanaalopening veroorzaakt. De ERC wordt over deze constitutieve stroom heen gelegd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 illustreert de robuustheid en het gemak van het gebruik van de ERG-techniek. Het is robuust omdat het wordt opgenomen in de vrijwel intacte vlieg door een eenvoudige techniek van extracellulaire spanningsregistraties die een eenvoudige elektrofysiologische opstelling vereisen. De robuustheid manifesteert zich door het verkrijgen van opnames van lichtresponsen met relatief grote amplitudes (in het millivolt-bereik), zelfs wanneer mutaties de lichtrespons sterk verminderen of vervormen. Daarom kan zelfs een onervaren experimentator de zeer eenvoudige experimentele opstelling gebruiken en leren hoe hij binnen een paar dagen zinvolle resultaten kan behalen. Het belangrijkste doel van de techniek die is ontworpen om fotopigmentniveaus te meten, wordt bereikt door extreem vereenvoudigde methoden van de PDA (figuur 2C) en ERP (figuur 2C-E). Het alternatief, namelijk microspectrofotometrie, vereist dure optische apparatuur en aanzienlijke training en vaardigheid (figuur 3B). De ERC (figuur 5A-D), hoewel technisch uitdagend, is minder gevoelig voor celconservering; het wordt gekenmerkt door een hoge signaal-ruisverhouding en de eliminatie van membraancapaciteit.
Figuur 1: De fotochemische cyclus: de activering en deactivering van het fotopigment. (A) Verzadigde blauwe verlichting (golvende blauwe pijl) fotoconverteert rhodopsine (R) naar metarhodopsine (M). Meervoudige fosforylering van M door rhodopsinekinase en daaropvolgende binding van arrestine 2 (ARR2) inactiveert M. Oranje licht (golvende rode pijl) fotoconverteert niet-gefosforyleerde M terug naar R. Het niet-gefosforyleerde M activeert heterotrimeer G-eiwit (Gqαβγ), waardoor de dissociatie van Gqα van Gqβγ en de uitwisseling van gebonden BBP met cytoplasmatische GTP ontstaat. Gqα-GTP activeert vervolgens fosfolipase C (PLC), dat PIP2 hydrolyseert tot diacylglycerol (DAG) en inositoltrisfosfaat (IP3), waardoor de TRP / TRPL-kanalen op een nog onduidelijke manier worden geactiveerd. Ca2+ calmodulin-dependent kinase (CaMKII) fosforyleert het M pp-ARR2 complex en ondergaat clathrin-afhankelijke endocytose en afbraak. Verlichting met oranje licht (golvende rode pijl) fotoconverteert M pp-ARR2 complex naar gefosforyleerde R (Rpp), waardoor ARR2 vrijkomt aan het cytosol. Gefosforyleerde R (Rpp) ondergaat defosforylering door de rhodopsinefosfatase (rdgC), waardoor R klaar is voor een nieuwe cyclus van het fotopigment. (B) Diepteprofiel van ERG van witogige vlieg tot een witte stimulus van 1 s (middelste kolom) of een witte stroboscoopflits (rechterkolom). Prikkels worden aangegeven door balken of stippen onder de sporen. Sporen zijn verticaal gerangschikt in volgorde van diepte, waarbij het bovenste spoor ~ 10 μm onder het hoornvlies wordt geregistreerd, waarbij elke volgende opname 25 μm dieper is dan de laatste. Aan de linkerkant is een camera lucida tekening van een overeenkomstige sectie door een ander oog, wat wijst op netvlies, keldermembraan (BM), laminaire schil, laminaire patronen (schuin gesneden) en medullair korst. Dit cijfer is aangepast van Stephenson en Pak11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Elektroretinogram (ERG) opnames van lichtresponsen van white-eyed wild type (w1118) en mutant Drosophila die de intensiteit-responsrelatie, langdurige depolariserende afterpotentiële (PDA) en metarhodopsinepotentiaal (M-potentiaal) laten zien. (A) Intensiteit-responsrelatie van een WT (w1118) vlieg verkregen door een reeks oranje lichten (OG590 randfilter, de totale energie die wordt uitgezonden door de rand van de lichtgeleider met behulp van het oranje filter was 4 mW ) met toenemende lichtintensiteit aangegeven in -logschaal. De inzet toont de aangegeven respons op een snellere tijdschaal. Inzet: De belangrijkste componenten van de ERG zijn de extracellulaire spanningsrespons van de fotoreceptor (receptorpotentiaal), de "aan" en "uit" transiënten (AAN, UIT-respons) aan het begin en het einde van de lichtprikkel en de langzame respons van de gliacellen (pijlen). (B) De gemiddelde piekamplitude van de ERG-responsen wordt uitgezet als functie van de relatieve lichtintensiteit. (C) De ERP van een WT (w1118) vlieg werd verkregen door de toepassing van verzadigingsblauw (BP450/4 nm, de totale energie die door de rand van de lichtgeleider werd uitgestraald met behulp van het blauwe filter was 1 mW) licht dat aanvankelijk een PDA induceert. De ERP (inzet) werd verkregen door een volgende intense (~ 70 J, 2 ms duur) groene flits (pijl, breedband 550 nm interferentiefilter), die de PDA onderdrukte. Inzet: de verschillende componenten van het ERP omvatten het cornea-negatieve M1-potentieel en het positieve M2-potentieel, zoals aangegeven. Een residuele op voorbijgaande ("ON" respons) is ook geïndiceerd. (D-E) Fotopigmentconversie is vereist voor de inductie van de M-potentiaal: (D) M potentiaal werd verkregen door een groene (breedband 550 nm interferentiefilter) flits na blauwe aanpassing, maar niet door een blauwe (BP450/4 nm) flits na blauwe aanpassing in WT (w1118) vlieg. (E) Het protocol van D werd herhaald in WT (w1118 , black trace) en twee mutante vliegen (PLC null mutant, norpAP24, orange trace, en hypomorphic rhodopsin mutant, ninaEP318, red trace). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Absorptiespectra van fotopigmenten van vliegen en barnakels. (A) Relatieve absorptiespectra van vliegen rhodopsine (R) en metarhodopsine (M) berekend op basis van fotometrische metingen van het verschilspectrum en het foto-evenwichtsspectrum. Dit cijfer is aangepast van Selinger en Minke35. (B) Twee Dartnall-nomogrammen met piekgolflengten bij 492 nm en 532 nm, met een verhouding van de piekabsorptie van respectievelijk 1,63:1. Het verschil tussen deze curven past het beste bij het verschilspectrum gemeten van de ocelli van de barnakel Balanus eborneus, verkregen door transmissiemetingen in het bereik van 400-650 nm na verzadiging van monochromatisch blauw (442 nm) en oranje (596 nm) aanpassing. Dit cijfer is aangepast van Minke en Kirschfeld36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het PDA-fenotype van de nina-, ina- en Arr2-mutanten . (A) Het protocol van inductie en onderdrukking van de PDA in Drosophila. Het PDA-inductieprotocol bestaat uit een initiële verlichting met behulp van maximale intensiteit oranje lichtpuls (590 randfilter, de totale energie die wordt uitgezonden door de rand van de lichtgeleider met behulp van het oranje filter was 4 mW, oranje balk) gevolgd door de toepassing van drie pulsen van maximale intensiteit blauw licht (de2e en3e pulsen zijn voor verificatie van het bereiken van de maximale PDA, BP450/40 nm filter, de totale energie die werd uitgestraald door de rand van de lichtgeleider met behulp van het blauwe filter was 1 mW, drie blauwe balken). PDA-onderdrukking werd verkregen door de toepassing van de oranje lichtpuls gevolgd door de toepassing van een extra oranje licht (twee oranje balken). Het PDA-inductie- en onderdrukkingsprotocol werd herhaald in de white-eyed mutant van het structurele gen van R1-6 fotopigment, ninaEP318 7 (midden). Het PDA-inductie- en onderdrukkingsprotocol werd ook herhaald in de witoog-nulmutant van het oogspecifieke eiwitkinase C (PKC32) inaCP209 (onder). (B) Een vergelijking tussen de hoeveelheid blauw licht die nodig is voor de inductie van een PDA tussen witogige WT (W1118) en nul Arr2-mutant (Arr23). Een trein van afwisselend oranje (verzadigde 590 randfilters) en blauwe (BP450/40 nm) lichtpulsen van toenemende lichtintensiteiten (ND in relatieve -logschaal). Bij blauw licht van -log 1 intensiteit wordt een PDA geïnduceerd (boven). Het paradigma van het bovenste spoor werd herhaald in de Arr23-mutant waaruit bleek dat de PDA werd geïnduceerd bij het blauwe licht van ~ 10-voudige dimmerlicht (-log 2) intensiteit (onder). (C) Een trein van gedimde (-log 2) blauwe lichtpulsen van constante intensiteit kon geen PDA induceren in W1118 fly(links), terwijl dezelfde trein van gedimde blauwe lichten een PDA induceerde door de1e lichtpuls in de Arr23 mutant (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Patch-clamp hele-cel opnames van lichtresponsen van geïsoleerde ommatidia, geregistreerd van wit-eyed WT (w1118), die de generatie van vroege receptorstroom (ERC) en de intensiteit-responsrelatie laten zien. (A) Patch-clamp hele-cel opnames van geïsoleerde ommatidium van WT fly (w1118) van bifasische ERC respons met sub-microseconde latentie. De lichtprikkel bestaat uit een intense (~ 220 J, 0,8 ms duur) blauwe lichtflits (breedbandfilter met piekabsorptie bij 425 nm, pijl) stimulatie toegepast na sterke aanpassing aan geelgroen (breedbandfilter met piekabsorptie bij 546 nm licht, zwart spoor). Bij het begin van het licht wordt een snel-negatief elektrisch artefact waargenomen. De negatieve fase ontstaat uit de activering van M en de positieve fase ontstaat uit de activering van R. De activering van de lichtgeïnduceerde stroom (LIC) manifesteert zich door de vertraagde negatieve fase die voortvloeit uit het openen van de lichtgevoelige kanalen. De ninaEI17 null mutant vertoonde een gebrek aan ERC-respons op dezelfde lichtflits die werd toegepast op geïsoleerd ommatidium (rood spoor). (B) ERC-meting van Rh1-fotopigmenten geregistreerd vanuit dezelfde cel als (A). Het zwarte spoor toont monofasische negatieve respons (M-toestand) op oranje flitsstimulatie van de WT (w1118) vlieg na sterke aanpassing aan blauw licht. (C) Monster van bifasische ERC-sporen gemeten uit een enkele fotoreceptorcel van transgene Drosophila (opn4;ninaEI17) die mlanopsinefotopigment (opn4) van muizen tot expressie brengt in R1-6 vliegfotoreceptoren als reactie op toenemende intensiteiten van witte flitslichten (in een relatieve -log I-schaal; ND geeft neutrale dichtheidsfilters aan). Het begin van de flits wordt aangegeven door de pijl. (D) De toename van de lichtintensiteit manifesteerde zich door een lineaire toename van de ERC-amplitude van opn4;ninaEI17. Een grafiek van de gemiddelde piekamplitude van de negatieve fase van ERC-responsen (logschaal) als functie van de relatieve lichtintensiteit (I/Imax, ook in logschaal). De continue rechte lijn vertegenwoordigt een lineaire regressiecurve die het beste past bij de experimentele punten (R2 = 0,99, foutbalken zijn SEM, n = 5). Dit cijfer is aangepast van Yasin et al.29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Gereedschappen en inrichtingen die nodig zijn voor het fixeren van de vlieg en het opnemen van pipetvoorbereiding. (A) Vliegslapersysteem; (B) Vliegslaper systeem pedaal; c) koude lichtbron; (D) Stereoscopische microscoop; e) wasfilamentverwarming; f) soldeerbout; (G) Pedaal van de waxfilamentverwarmer; (H) Ruw pincet; (I) Magnetische vliegenstandaard; j) was met lage smelttemperatuur; (K) Delicate doekjes; (L) Verticale pipettrekker; (M) Spuit met langwerpige punt; n) houders van elektroden; O) capillairen van borosilicaatglas; (P) Vaste vlieg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Overzicht van de ERG-opstelling. (A) Pulsgenerator; b) computer; (C) A/D-converter; (D) Versterker; (E) Stereoscopische microscoop; (F) Micromanipulator (mechanische fijne); G) micro-elektrodevoorversterkersysteem met kopwerk; h) antitrillingstabel; (I) Aan / Uit magneetblok; J) Micromanipulator (mechanisch grof); K) kooi van Faraday; (L) Lichtgeleider van Xenon lichtbron; (M) Lichtgeleider van flitslichtsysteem; n) houder van de geslepen elektrode; O) lichtdetector; (P) Houder van de opname-elektrode; (Q) Magnetische vliegenstandaard; (R) Xenon lamp voeding; (S) Kleur- en ND-filters staan; (T) Optische bank; (U) Flash Lamp systeem; (V) Sluiter bestuurder; (W) Lamp voeding; (X) Xenon flitslichtsysteem Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| De oplossing van Ringer | |
| Reagens | Concentratie (mM) |
| NaCl | 130 |
| Kcl | 2 |
| MgCl2 | 5 |
| CaCl2 Zoekertjes | 2 |
| Hepes | 10 |
| pH-titratie tot 7,15 met NaOH en HCl | |
Tabel 1: Samenstelling van Ringer's oplossing.
Aanvullend bestand 1: Schakelschema van de wassmeltregelaar. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het grote voordeel van het gebruik van de Drosophila-fotoreceptorvoorbereiding is de toegankelijkheid, het gemak en de nauwkeurigheid van lichtstimulatie en, belangrijker nog, het vermogen om de kracht van moleculaire genetica toe te passen7. Uitgebreide genetische studies hebben Drosophila vastgesteld als een uiterst nuttig modelsysteem voor de genetische dissectie van complexe biologische processen7. De relatief eenvoudige structuur van het Drosophila-genoom (bestaande uit slechts vier chromosomen, waaronder de X- en Y-geslachtschromosomen, twee grotere autosomale elementen, chromosomen 2 en 3 en het kleine punt vierde chromosoom), groeigemak en snelle generatietijd (~ 2 weken bij 24 ° C) maken Drosophila geschikt voor het screenen van grote aantallen gemuteerde individuele vliegen. Bovendien wordt de isolatie en het onderhoud van elke geïsoleerde mutatie mogelijk door het genereren van balancerchromosomen, die dominante markers en meerdere inversies bevatten, die recombinatie met de inheemse chromosomen voorkomen. De beschikbare moleculaire hulpmiddelen hebben het mogelijk gemaakt om in vitro gemodificeerde genproducten in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving te bestuderen37. Deze krachtige methodologie heeft een overvloed aan gemuteerde vliegen geproduceerd met defecten in nieuwe eiwitten die anders moeilijk te voorspellen zouden zijn geweest7.
Het grote voordeel van het gebruik van de ERG voor metingen van fotopigmentniveaus en gevoeligheid voor licht is de eenvoud en het gebruiksgemak en de grote signaal-ruisverhouding. Het nadeel van het gebruik van de ERG is de heterogene cellulaire oorsprong, die de golfvorm van de lichtrespons als gevolg van de fotoreceptoren vervormt9. Het grote voordeel van spanning-klem hele-cel opnames is de mogelijkheid om geleidingsverandering af te leiden door het meten van de stroom-spanning (I-V) relatie. Het openen en sluiten van de TRP- en TRPL-kanalen tijdens en na de verlichting wordt weerspiegeld door deze meting13. Bovendien wordt een hoge signaal-ruisverhouding verkregen vanwege de lage weerstand van de opnamepipet (~ 10 MΩ) en de meting van stromen, waardoor betrouwbare metingen van kwantumbulten (single-photon responsen) mogelijk zijn, wat nuttig is voor het kalibreren van de effectieve lichtintensiteit38. Een groot nadeel van patch-clamp whole-cell opnames is dat, terwijl ERG opnames urenlang kunnen worden bewaard, zelfs onder extreme lichtintensiteiten, het moeilijk is om betrouwbare patch-clamp hele-cel opnames uit te voeren voor meer dan 15-30 minuten, en dimlicht stimulatie is vereist voor langdurige opnames. Om hele-celopnamen te verkrijgen, is direct contact tussen de opnamepipet en het fotoreceptormembraan vereist. Direct contact wordt bereikt door het verwijderen van de pigment (glia)cellen rond de ommatidia34 (figuur 1B). Pigmentcelverwijdering veroorzaakt metabole stress omdat de fotoreceptorcel de metabolieten die nodig zijn voor de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) niet kan synthetiseren, waardoor de metabole toevoer wordt verstoord39. Aangezien TRP- en TRPL-kanalen kwetsbaar zijn voor anoxie en gemakkelijk spontaan openen in het donker als gevolg van ATP-uitputting, legt het gebruik van geïsoleerde ommatidia grote moeilijkheid op40,12. De hele procedure moet worden uitgevoerd onder zwak rood licht omdat de lichtrespons een groot verbruik van ATP34 induceert.
De meeste mutaties in de fototransductiecascade induceren een afname van de gevoeligheid voor licht. Deze vermindering van de gevoeligheid voor licht kan gemakkelijk worden gedetecteerd door een scherm op basis van het meten van de intensiteit-responsrelatie. Intensiteit-respons paradigma's worden bereikt door herhaalde lichtstimulaties met toenemende intensiteit op een logaritmische schaal. Toenemende (en niet afnemende) intensiteiten van oranje licht zijn nodig om aanpassing aan licht te voorkomen. De ERG (M-potentiaal) en de PDA zijn zeer eenvoudige methoden om fotopigmentniveaus te meten. Het alternatief, namelijk microspectrofotometrie36, vereist dure optische apparatuur en aanzienlijke training en vaardigheid.
Kortom, de ERG is een eenvoudig toe te passen maar relatief onnauwkeurig instrument. Whole-cell recording31 is nauwkeurig voor het meten van fotopigmentniveaus met behulp van de ERC, en het is essentieel voor het compenseren van de onnauwkeurigheid en beperkingen van de ERG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (ISF) en de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Wij danken de heer Anatoly Shapochnikov voor de bouw van de wasfilamentkachel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
| 1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
| 2 condenser lenses | |||
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
| Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
| Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
| Clampex | Molecular Device | Software | |
| CO2 tank | |||
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
| Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
| Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
| Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
| Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
| Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
| Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
| Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
| Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
| Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
| Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
| Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
| Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
| Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
| Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
| Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
| pCLAMP | Molecular Device | Software | |
| Petri dish | 60 mm | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
| Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
| Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
| Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
| Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
| Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |
References
- Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
- Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
- Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
- Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
- Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
- Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
- Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
- Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
- Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
- Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
- Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
- Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
- Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
- Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
- Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
- Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
- Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
- Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
- Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
- Cone, R. A., Cobbs, W. H.
- Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
- Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
- Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
- Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
- Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
- Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
- Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
- Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
