Transfert de gènes dans des embryons de poulet âgés par Ex ovo Électroporation

Une méthode de transfert de gènes dans des embryons de poulet à des stades d'incubation plus tard (plus de Hamburger et Hamilton étape (HH) 22) est décrite. Cette méthode permet de surmonter les inconvénients de

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer un transfert de gènes dans des embryons de poulet plus âgés in vivo afin d’étudier la fonction et la régulation des gènes aux stades de développement plus âgés. Ceci est accompli en cassant d’abord un œuf vers le jour d’incubation 2,5 et en transférant l’embryon entier dans un système de boîte de Pétri. La deuxième étape consiste à injecter le plasmide, codant pour le gène d’intérêt dans la partie appropriée de l’embryon.

Après avoir injecté le plasmide, placé des électrodes à côté de l’embryon et effectué une électroporation Xovo, l’étape finale consiste à collecter les embryons électroporés pour analyse. En fin de compte, l’immunohistochimie est utilisée pour détecter l’expression des gènes transférés dans l’embryon. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment faire l’électroporation ovale X à l’aide de BUL de poulet.

Le principal avantage de cette technique est que la surélectroporation X peut surmonter les problèmes de surélectroporation utilisée pour le transfert de gènes dans les embryons de poulet plus âgés. La réussite de la culture X ovo d’embryons de poulet nécessite l’utilisation d’ovules frais fécondés. N’utilisez pas d’œufs conservés à 12 degrés Celsius pendant plus d’une semaine.

Pondez les œufs sur leurs côtés longs dans un incubateur à tirage forcé à 37,5 degrés Celsius avec 60 % d’humidité après une incubation de 2,5 jours. Lorsque les embryons sont à environ hamburger et Hamilton. Étape 17, sortez les œufs de l’incubateur.

Étiquetez le haut de chaque œuf avec un crayon pour indiquer la direction de la fissuration de chaque œuf. Versez environ 20 millilitres d’eau distillée stérile dans une grande boîte de Pétri propre et grande d’un diamètre de 145 millimètres. Placez une petite boîte de Pétri stérile d’un diamètre de 94 millimètres dans la grande boîte de Pétri.

Ensuite, cassez chaque œuf sur le fond contre un bord métallique tranchant. Ouvrez délicatement l’œuf et transférez tout son contenu dans la petite boîte de Pétri. Pour garantir la bonne qualité de l’embryon, tout le contenu de l’ovule doit être conservé sous une forme normalement ronde dans un système de boîte de Pétri sans aucune lésion de la membrane de la viline.

Après avoir transféré le contenu de chaque œuf dans le petit plat, couvrez le grand plat avec un couvercle. Placez les systèmes de boîtes de Pétri dans un autre incubateur pour une culture plus poussée à 37,5 degrés Celsius avec environ 60 % d’humidité avant l’électroporation de Xovo. Utilisez une micro-électrode polaire pour extraire les capillaires en verre des tubes de verre de 1,0 millimètre de diamètre.

Cassez l’extrémité des capillaires en verre dans un diamètre approprié. Ensuite, configurez les paramètres appropriés pour l’électroporation, tels que différentes tensions pour le tissu distinct et la taille des embryons. Connectez les électrodes appropriées à l’électro en fonction du tissu cible et de la taille des embryons.

Préparez une solution plasmidique contenant des plasmides, codant pour un gène cible et un gène marqueur. Dans cette démonstration, la cadhérine sept ou CAD sept est la cible et la protéine fluorescente verte ou GFP est le marqueur. Ajouter du vert rapide à une concentration finale de 0,1 % pour marquer la solution plasmidique en vert.

Enfin, à l’aide d’une pipette à bouche, chargez le capillaire de verre avec la solution plasmidique. Les embryons de poulet de la culture X ovo qui ont été incubés pendant six jours sont utilisés pour l’électroporation X ovo. Pour commencer cette procédure, à l’aide d’une pince fine, déchirez soigneusement les membranes de tylène et d’amnions sur le tectum optique et ajoutez trois gouttes de solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % sur la surface du tectum.

À l’aide d’une pipette buccale, injectez la solution plasmidique du capillaire de verre dans la cavité du tectum. Placez les électrodes avec une cathode à aiguille en tungstène et une anode à plaque rectangulaire à côté du tectum. Utilisez immédiatement l’électro pour appliquer des impulsions électriques sur le tectum.

Couvrez la grande boîte de Pétri avec le couvercle et remettez-la dans l’incubateur deux ou trois jours après l’électroporation des plasmides codant pour la GFP et le CAD sept dans le tectum de poulet à E six, les tectums sont collectés et fixés pour l’immuno-coloration. Les résultats sont présentés sur cette figure en E huit. La protéine GFP est fortement exprimée dans le tum comme l’indiquent ces images de montage entier ici.

Le panneau A est une image en champ clair. Le panneau B est une image GFP A, et le panneau C est émergé. Image de plus, dans les coupes du tectum en E neuf protéines GFP visualisées en vert dans le panneau D et CAD sept protéines visualisées en rouge dans le panneau E sont co-exprimées comme représenté par la couleur jaune dans le panneau F.Lorsqu’elle est effectuée correctement, l’efficacité de l’électroporation X ovo est de 60 à 100 %Ces résultats suggèrent que l’électroporation X ovo est une méthode réussie pour le transfert de gènes dans des embryons de poulet plus âgés in vivo.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un transfert de gènes dans des embryons de poulet plus âgés et la chance avec votre expérience.