Summary
Burada VirWaTest sunuyoruz, hangi kullanım noktasında su örneklerinden virüslerin konsantrasyonu ve tespiti için basit, uygun fiyatlı ve taşınabilir bir yöntemdir.
Abstract
İnsanlar ve hayvanlar tarafından atılan virüsler su kaynaklarını kirletebilir ve bu su içme, gıda sulama, yıkama, vb. için kullanıldığında insan sağlığına risk teşkil edebilir. Klasik dışkı bakteri göstergesi her zaman viral patojenlerin varlığını kontrol etmez, böylece viral patojenlerin ve viral göstergelerin tespiti, özellikle insani senaryolar ve bölgelerde risk azaltma önlemlerinin benimsenmesi için geçerlidir. su kaynaklı viral salgınlar sık görülür.
Şu anda, dışkı göstergesi bakterilerinin (FıB) ölçülmesine izin veren çeşitli ticari testler, kullanım noktasında test etmek için kullanılabilir. Ancak, bu tür ticari testler virüslerin algılanması için kullanılabilir değildir. Çevresel su örneklerindeki virüslerin algılanması, birkaç litreye daha küçük hacimlere yoğunlaşmasını gerektirir. Dahası, bir kez konsantre, virüslerin tespiti nüklenik asit ekstraksiyon ve moleküler algılama (örn., viral genomların polimeraz zincir reaksiyonu [PCR]-based) gibi yöntemlerle dayanır.
Burada açıklanan yöntem, 10 L su numuneleri virüslerin konsantrasyonu yanı sıra, basit ve taşınabilir ekipman ile kullanım noktasında viral nüklerik asitlerin çıkarılması sağlar. Bu, çeşitli virüsler için kullanım noktasında su örneklerinin test edilmesini sağlar ve insani senaryolardaki yanı sıra, donanımlı bir laboratuvarda mevcut olmayan herhangi bir bağlamda yararlıdır. Alternatif olarak, yöntem, su numuneleri ve daha fazla analiz için oda sıcaklığında bir laboratuvarda konsantre nakliye mevcut virüs konsantre sağlar.
Introduction
Herhangi bir insani acil durum ilk aşamalarında, temiz su temini, sanitasyon ve hijyen erişim etkilenen bu hayatta kalmak için önemlidir. Bu nedenle, su kalitesini izlemek suyun kaynaklı salgınları önlemek için bir önceliktir. Bu kontamine su sıklıkla hastalıkların kökeni bilinmektedir, ama genellikle Hepatit E virüsü gibi viral salgınlar kaynaklarını belirlemek zordur (HEV), konvansiyonel laboratuvar yöntemlerinin kullanılabilirliği bile. Su kalitesinin kontrolü fib1,2,3,4' ün ölçülmesini temel alır. Ancak, fib yokluğunda ve Rotavirüs (RoV), norovirüs (Nov) veya HEV5,6gibi viral su kaynaklı patojenlerin varlığı arasında hiçbir korelasyon olmadığı konusunda kapsamlı olarak belgelenmiştir. Böylece, FıB 'ye dayanan su kalitesi kriterlerinin kullanılması, su kaynaklı viral patojenlerin varlığı ile ilgili risklerin hafife almasına neden olabilir. İnsan adenovirüsler (hadv) veya spesifik patojenler gibi gösterge virüslerinin gözetimi, viral patojenlere maruz kalmanın tanımlanması ve insan enfeksiyonunun potansiyel kaynağını tanımlamak için yararlı olacaktır7,8, 9,10 ve sanitasyon tedbirlerinin etkinliğini doğrulamak için11.
Bugüne kadar, bu senaryolarda virüslerin tespiti yetenekli personel ve karmaşık lojistik üzerinde dayanılır. VirWaTest (virwatest.org), kullanım noktasında su örneklerinden gelen virüslerin konsantrasyonu ve daha sonra tespiti için basit, uygun maliyetli ve taşınabilir bir yöntemin geliştirilmesine yöneliktir.
Virüs konsantrasyonu, 10 L su numunelerinin organik flocculasyonu ilkesine dayanmaktadır ve bu da virüsler daha küçük hacimlerde12,13' te kurtarılır. Flokların ya toplanır ve virüsler yapışıklıkların bir tampon eklenir ve onlar daha fazla değil, oda sıcaklığında saklanan nüklik asitler bozulması önler 2 hafta.
Nükle asit ekstraksiyon yöntemi, nüklik asitlerin adsoryat ettiği manyetik partiküllerin kullanımına dayanır. Onlar bir yıkama tampondan diğerine transfer edilebilir ve sonunda parçacıklar iliştirmek için bir manyetik pipet kullanarak elüsyon tampon içine. Viral nüklik asit süspansiyonları, PCR bazlı moleküler yöntemler kullanılarak tespit edilebilecek bir referans laboratuvarına sevk edilebilir. Her nükleik asit ekstraksiyon için, iki farklı miktarlarda numunenin kökeni enzimatik inhibisyonu dışarı kural test edilir. Alternatif olarak, minimum ekipman kullanılabilirliği ile, PCR testleri kullanım noktasında çalıştırılabilir. Tüm işlem bir güç kaynağından bağımsız olarak gerçekleştirilecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1).
İnsan tarafından atılan ve yüksek konsantrasyonlarda Atıksu örneklerinde bulunan HAdV algılamak için nicel bir PCR tahlil, kullanım noktasında çalışacak şekilde adapte edilmiştir. HAdV insan dışkı viral göstergeler olarak kullanılır. MS2 bakteriyofaj için bir PCR de MS2 bu yana proses kontrolü olarak VirWaTest kullanılır adapte edilmiştir. Yöntem ilgi herhangi bir virüs tespiti için özelleştirilmiş olabilir.
Kalkınma sonrası, VirWaTest yöntemi, gerçek durumlarda protokolün uygulanması hakkında geribildirim sağlayan Orta Afrika Cumhuriyeti (RCA) ve Ekvador iki farklı ayarlarında kullanıcılar tarafından uygulandı.
Bizim bilginiz için, bu kullanım noktasında virüslerin konsantrasyonu ve algılanmasını sağlayan ilk işlemdir, herhangi bir güç kaynağı bağımsız, büyük ekipman, ve donma/soğutma koşulları. Sağlam sonuçlar elde etmek için her bir su örneğinin iki çoğaltır toplamak için tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlama ve paketleme
Not: ambalajlanabilir malzemeler/ekipmanlar Tablo 1' de listelenir. Proses kontrolü, konsantrasyon reaktifler, nüklik asit ekstraksiyon reaktifler ve algılama reaktifleri için gerekli reaktifler ele almak için eldiven kullanın. Nüklik asit ekstraksiyonu için gerekli reaktifleri işlemek için koruyucu gözlük takın.
- Proses kontrolü
- MS2 bakteriyofaj hisse senedi kültürünü (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) içeren 1 x 1010 PFU/ml LABORATUVARıNDA ıso prosedürü 10705-1:199514' ü izleyerek hazırlayın.
- Sonra, 10 ml tüp içine 1 x 108 PFU içeren boru başına süspansiyon 10 μL kısım ve su 37 °c ' de Buharlaştırıcı izin. Su örneği başına bir tüp kullanın.
- Ayrıca, toplanan örnek başına 10 mL steril damıtılmış su içeren bir tüp hazırlayın.
- Konsantrasyon reaktifler
- Preflocculated yağsız süt çözeltisi için (PSM), 5 10 L su örnekleri konsantre aşağıdaki miktarlarda kullanın.
- 5 gr yağsız süt içeren plastik bir tüp hazırlayın.
- 16,66 g deniz tuzları içeren bir fermuar Plastik çanta hazırlayın.
- 500 mL damıtılmış su içeren plastik bir şişe hazırlayın.
- PH ayarı için gerekli reaktifleri hazırlayın. PSM pH 'Sını ve 5 10 L su örneklerini ayarlamak için aşağıdaki miktarları kullanın.
- 10 mL plastik boruya 5 gr sitrik asit 1-hidrat ekleyin.
DIKKAT: göz ile temas ettiğinde sitrik asit ciddi irritasyona neden olur. Bu durumda, göz dikkatli bir şekilde su ile birkaç dakika durulayın. Eğer tahriş devam ederse, tıbbi tavsiye isteyin. - 10 mL plastik tüpüne 2 gr sodyum hidroksit koyun.
DIKKAT: Sodyum hidroksit şiddetli cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Yutulması durumunda, ağzını durulayın. Kusma. Eğer gözler ile temas ederse, birkaç dakika su ile dikkatli bir şekilde durulayın. Sonra, tıbbi tavsiye isteyin. - 25 mL steril damıtılmış suyu plastik bir kabına koyun.
- Plastik bir kap içine steril distile su 50 mL koyun.
- 10 mL plastik boruya 5 gr sitrik asit 1-hidrat ekleyin.
- Flocculation için kullanılan numune Klima poşeti hazırlayın, nükleik asitleri korumak için kullanılan koruyucu çözüm, ve nötralize poşet atılan su ve malzemeleri nötrleştirmek için. Test edilecek her 10 L su örneği için aşağıdaki tutarları kullanın.
- 15 g deniz tuzları ve 8 g sitrik asit 1-hidrat bir fermuar plastik torba içine klima poşet koyun.
- 2 ml liziz tampon (malzeme tablosu) ve 0,3 ml nüklik asit koruma ajanı (malzeme tablosu) 5 ml tüpüne ekleyin.
Dikkat: Lysis tampon guanidin tiyosiyanat ve Triton X-100 içerir. Asit ile temas toksik gazı serbest bırakmaktadır ve yutulması, solunduğu veya deriyle temas ederse zararlı olur. Yutulması durumunda, ağzını durulayın. Kusma. Cilt ile temas ederse, bol su ile yıkayın. Sonra, tıbbi tavsiye isteyin. Nüklik asit koruma maddesi cilt ve göz tahrişine neden olur ve yutulması durumunda zararlı olur. Cilt veya gözler ile temas ederse, birkaç dakika boyunca bol su ile durulayın. Her durumda, özellikle yutulması ve iyi hissetme, tıbbi tavsiye isteyin. - 4 fermuar plastik torbalara 40 g deterjan tozu koyun.
DIKKAT: Toz deterjan göz tahrişine neden olur. Eğer gözleri ile temas halinde, birkaç dakika için bol su ile durulayın. Tahriş devam ederse veya Yutulursa, tıbbi tavsiye isteyin.
- Preflocculated yağsız süt çözeltisi için (PSM), 5 10 L su örnekleri konsantre aşağıdaki miktarlarda kullanın.
- Nüklik asit ekstraksiyon reaktifler
- 50 μL manyetik parçacıklar (malzeme tablosu) ve 1 ml etanol 96% ' i 5 ml 'lik bir tüpün içine koyun ve bağlayıcı tamponu oluşturur.
DIKKAT: manyetik parçacıklar tamponu, asitler veya ağır metal iyonlarıyla temas ettiğinde toksik gaz oluşturan ve yutulduğunda veya deriyle temas ettiğinde toksik olan sodyum azid içerir. Eğer yutulur veya cilt ile temas, bol su ile ağız veya cilt durulayın ve tıbbi tavsiye isteyin. Etanol son derece yanıcı bir sıvı ve buharı ve ciddi göz tahrişi neden olur. Isı, sıcak yüzeyler, kıvılcımlar ve diğer herhangi bir ateşleme kaynağından uzak tutun. Cilt veya gözler ile temas ederse, bol su ile durulayın. Büyük miktarlarda su Yutulması durumunda ve/veya solunması durumunda, temiz havaya dışarı gidin. Her durumda, tıbbi tavsiye isteyin. - Ekleme 500 μL, 600 μL, ve 200 μL tampon 1, 2 ve 3, sırasıyla (malzeme tablosu), üç 2 ml tüpler yıkama.
Dikkat: yıkama tamponları, solmuş veya yutulması ve cildi ve gözleri tahriş ederse zararlı olan guanidinyum tiyosiyanat ve guanidinyum klorür içerir. Asitler ile temas çok toksik gaz bültenleri. Eğer cilt veya gözler ile temas halinde, bol su ile durulayın. Yutulması durumunda, ağız bol suyla durulayın. Kusma. Her zaman tıbbi tavsiye isteyin. - 0,5 mL tüpüne 120 μL elüsyon tampon (malzeme tablosu) ekleyin.
- 50 μL manyetik parçacıklar (malzeme tablosu) ve 1 ml etanol 96% ' i 5 ml 'lik bir tüpün içine koyun ve bağlayıcı tamponu oluşturur.
- HAdV ve MS2 algılama reaktifler
Not: bir 8-kuyu termocycler kullanılırsa, Iki farklı nüklik asit ekstraksiyon reaksiyonları her PCR tahlil aynı anda analiz edilebilir. Tüm PCR teknolojileri için, 1,5 mL tüplerine molekül biyoloji suyu hazırlayın.-
HAdV algılama
- 10 μL 22,5 μM AdF ileri astar, 10 μL 22,5 μM AdR ters astar ve 5 μL 11,25 μM AdP prob (Tablo 2) içeren bir karışımı hazırlayın.
- 2,5 bir tüp şeridi 1 ' den 8 ' e kadar boru karışımı μL ekleyin. Oda sıcaklığında kurutun, tüpleri kapatın ve onları ışıktan korunmaya devam edin.
- Kesme Strip iki şerit içine bölme: Tüpler 1-5 ve tüpler 6-8.
- Güçlendirilmiş HAdV bölgesinin nükvotit dizisini içeren DNA süspansiyonlarını seri olarak seyreltme hazırlayın. 1 x 105, 1 x 107ve 1 x 109 GC/ml tüplere 6-8 Içeren hava-kuru 1 μL süspansiyonlar.
Not: astarları, sondayı ve havayı kurutulan süspansiyonları içeren tüpleri ışığa karşı korunur.
-
MS2 algılama
- 10 μL 25 μm pecson-2F ileri astar, 10 μL 25 μM pecson-2R ters astar ve 2,5 μL 25 μM PecP-2 prob (Tablo 2) içeren bir karışımı hazırlayın.
- 2,25 bir tüp şeridi 1 ' den 8 ' e kadar boru karışımı μL ekleyin. Oda sıcaklığında kurutun, tüpleri kapatın ve onları ışıktan korunmaya devam edin.
- Kesme Strip iki şerit içine bölme: Tüpler 1-5 ve tüpler 6-8.
- Adım 1.4.1.4 olarak devam edin ama bunun yerine MS2 için tasarlanmış standart bir süspansiyon kullanın.
-
HAdV algılama
2. viral konsantrasyon
Not: örnek toplama, reaktif hazırlama, Flocculation, flokların ya koleksiyonu ve atık imha prosedürleri sırasında her zaman eldiven kullanın. Reaktif hazırlama prosedürü sırasında koruyucu gözlük takın.
- Örnek toplama
- Bir kapak ile düz bir alt kova 10 L su örneği toplayın. Her örnek için en az iki çoğaltır toplayın.
Not: Pelet görselleştirmek için net kova kullanmak önemlidir. Su numunesi askıya alınan malzeme (örneğin, kum, yosun) içeriyorsa, tortu izin ve, daha sonra, yeni bir kova su süpernatant toplamak. - Her su örneği için toplanan hacminin yanı sıra konum ve tahsilat tarihini de kaydedin.
- Bir kova desteği altında bir pil bağlı bir manyetik karıştırıcı koymak ve destek üzerine su örneği içeren kova yerleştirin.
Not: taze bir yerde düz bir yüzey arayın ve doğrudan güneş ışığından su örnekleri içeren kova tutun.
- Bir kapak ile düz bir alt kova 10 L su örneği toplayın. Her örnek için en az iki çoğaltır toplayın.
- Reaktifler hazırlama
-
pH ayar reaktifleri
- Sitrik asit tozu ve sodyum hidroksit Pelet içeren tencere içine dökün 25 ve 50 mL distile su, sırasıyla.
- Sitrik asit ve sodyum hidroksit tamamen çözününceye kadar elle yavaşça sallayın.
DIKKAT: suyu sodyum hidroksit pelletine dökmeyin. Bunun yerine, su üzerinde sodyum hidroksit Pellet dökün.
-
Preflocculated yağsız süt
- Bir manyetik karıştırıcı üzerinde bir stand-up çanta yerleştirin ve içine damıtılmış su 500 mL dökün. Çanta içine karıştırma mıknatıs bırakın ve manyetik karıştırıcı açın.
- Bir deniz tuzu poşeti ve bir yağsız süt tüp içeriğini stand-up çantasına dökün ve onları çözmek için orta hızda 5 dakika karıştırın.
- PH 3,4 ile 3,6 arasında olduğundan emin olmak için bir Pasteur pipet kullanarak PSM çözümüne 3 mL sitrik asit ekleyin. PH gösterge şeritleri kullanılarak PSM çözeltisi pH 'Sını ölçün. PH 3,5 'e yaklaştıkça daha küçük miktarlarda sitrik asit ve sodyum hidroksit ekleyin.
- Manyetik karıştırıcı kapatın ve flokların ya görünür olduğundan emin olun. Flocs görselleştirmeye yardımcı olmak için bir el feneri kullanın.
-
pH ayar reaktifleri
- Flokülasyon
- Su içine karıştırma mıknatıs bırakın, maksimum hızda manyetik karıştırıcı ayarlayın ve açın. Karıştırma mıknatıs dönmeye başlar emin olun.
- Bir proses kontrol tüpüne 10 mL distile su ekleyin. Viral stok rehydrate ve suya çözüm dökmek için birkaç kez tüp tersine çevirin.
- Su içine bir örnek Klima poşet içeriğini dökün ve 5 dakika boyunca karıştırın.
- PH gösterge şeritleri kullanılarak su örneğinin pH değerini ölçün. PH 3,4 ve 3,6 arasında yatıyor emin olmak için su örneği için sitrik asit veya sodyum hidroksit birkaç damla ekleyin. PH 3,5 'e yaklaştıkça daha küçük miktarlarda sitrik asit ve sodyum hidroksit ekleyin.
- 100 mL PSM çözüm 100 mL kapsayıcı kullanarak ekleyin.
- Kapağı ile kova mühür, minimum hızda manyetik karıştırıcı ayarlamak ve 8 h için karıştırma su bırakın.
- Manyetik karıştırıcı kapatın ve su hala en az 5 h için flokların ya yerleşmek izin vermek için izin verin.
- FLOC koleksiyonu
- Pipet kumandasının, iki pipetin ve plastik tüpten oluşan bir Sifonlama sistemi inşa ederek suyun flocs üzerinde boşaltma için su süpernatant Aspire.
- Pipet denetleyiciye 10 mL 'Lik bant ucu pipet takın. Sonra, Pipet ucunu plastik tüpe takın.
- 10 mL 'Lik açık uçlu pipetin filtresini Cımbız kullanarak çıkarın ve pipeti plastik tüpe takın.
- Yere boş bir kova yerleştirin.
- Açık uçlu pipetin ucunu suya batırın. Flocs rahatsız önlemek için su yüzeyine yakın tutmak için emin olun. Su süpernatant bant-End pipet ulaşıncaya kadar aspirate.
- Plastik tüpü teyp-uç pipete bağlı olarak çimdik ve pipetten ayırın.
- Tüpü boş bir kova içine yerleştirin. Boş kova su akışını izin tüp üzerindeki basıncı bırakın.
- Su seviyesini karıştırma mıknatıs ulaşmak ve kova uzak pipet taşımak üzere olduğunda su akışını durdurmak için plastik tüp çimdik.
- Flokların ya pelletini ve 500 ml stand-up plastik torba içine dökün kova sallayın. Flokların ya 1 h daha fazla razı izin verin.
- 50 ml 'lik pipet ve manuel pipet kontrolörü kullanarak su süpernatant dikkatle Aspire, flocs rahatsız kaçınarak.
- Bir 100 ml pipet kullanarak flokların ya aspirate ve 50 ml dereceli santrifüjli tüp aktarmak. Örnek konsantre son hacminin aşağı Not ve 1 mL bir Pasteur pipet kullanarak, koruyucu çözüm içeren 5 mL tüp aktarın.
Not: konsantre numunenin son hacminin mümkün olduğunca doğru ve kayıtlı olarak ölçülmesi için Santrifüjlü tüpün mezun olması önemlidir. - Alanda nüklik asit ekstraksiyon gerçekleştirin. Alternatif olarak, virüs içeren koruyucu solüsyonu 15 güne kadar 20-30 °C ' de saklayın veya daha fazla analiz için bir referans laboratuvarına sevk etme.
- Pipet kumandasının, iki pipetin ve plastik tüpten oluşan bir Sifonlama sistemi inşa ederek suyun flocs üzerinde boşaltma için su süpernatant Aspire.
- Atık imha ve malzeme yeniden kullanımı
- Bir nötralize Ajan poşet içeriğini atılan su içeren kova ekleyin. Su karıştırın ve sonra, 30 dakika boyunca hala bırakın.
- Tedavi edilen suyu genel atık olarak atın.
- Pipetleri ve plastik tüpü kovanın içine yerleştirin. Kova su ile doldurun ve bir nötralize Ajan poşet içeriğine dökün.
- Onları sterilize etmek için en az 30 dakika yıkayın ve kalan nötralizasyon ajanı kaldırmak için bol temiz su ile durulayın.
3. nüklik asit ekstraksiyonu
Not: eldivenleri kullanın ve nüklik asit ekstraksiyon prosedürü sırasında her zaman koruyucu gözlük takın.
-
Manyetik pipet çalışması
- Ekstraksiyon yapmadan önce manyetik pipetin çalışmasını tanıyın.
-
Nüklik asit ekstraksiyon
- Ekstraksiyon için gerekli reaktifler içeren tüpleri, soldan sağa doğru: bağlayıcı tampon, yıkama tamponları ve elüsyon tampon olarak düzenleyin. Numunelerin sayısına göre uygun sayıda tüp ayarlayın veya analiz ediliyor çoğaltır.
- 1 mL örnek konsantresi, tek kullanımlık Pasteur pipet kullanarak bağlayıcı tamponu içeren tüpe aktarın. Solüsyonu homojenize etmek için tüp 8X ' i 10X 'a çevirin.
- Çözümü, Güneş enerjili orbital ya da el ile kullanarak sürekli karıştırma sırasında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kulkarın.
- Manyetik pipet ve üç yıkama tamponları için yeniden kullanılabilir temiz bir uç kullanarak manyetik parçacıklar toplayın.
- Manyetik parçacıkları 500 içeren tüpün içine bırakın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.
- Manyetik parçacıkları, 600 μL yıkama tamponu 2 içeren tüpüne aktarın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.
- Manyetik parçacıkları, 200 μL yıkama tamponunun 3 ' ü içeren tüpüne aktarın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.
- Manyetik parçacıkları, elüsyon tamponunu içeren tüpün içine bırakın ve ucu atın.
- Güneş enerjili orbital kullanarak sürekli karıştırma sırasında çözüm oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kulkarın.
Not: manyetik parçacıkların elüsyon tamponunun içinde karıştırma önemli bir adımdır. Bir orbital eksikliği durumunda, sürekli el kuluçbe süresi boyunca karıştırın. - Manyetik Pipetteki ucu yeni bir tane ile değiştirin ve manyetik partikülleri elüsyon tampondan toplayın. Moleküler algılama yöntemlerine müdahale ettikleri için manyetik partikülleri elüsyon tamponunu tamamen kaldırtığınızdan emin olun.
- Ucunu ona bağlı parçacıklar ile atın. PCR analizine devam edin, elüsyon tamponunu bir referans laboratuvarına sevk edin veya daha fazla analiz için ek tamponu 4 °C ' de saklayın.
4. pil ile çalışan sekiz-tüp gerçek zamanlı termocycler ile viral algılama
Not: nüklik asit algılama prosedürü sırasında eldiven kullanın ve her zaman koruyucu gözlük takın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir PCR deneyi yapılırken eldivenleri yenilerini değiştirin.
-
HAdV nicel PCR
- 2, 4 ve 5 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.
- 1-5 tüplere 4 μL PCR karışımı ekleyin.
- Örnek A 'dan tüp 1 ' e ve 14 μL 'den Tüp 3 ' e örnek B 'ye 14 μL nükleik asit ekstraksiyonu ekleyin.
- 2 μL ayıklanan nükleik asitleri, örnek A 'dan tüp 2 ' ye ve 2 μL 'ye örnek B 'den tüp 4 ' e ekleyin. Beş-tüp şeridi kapatın.
- 6, 7 ve 8 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.
- 6, 7 ve 8 numaralı tüplere bu karışımı 4 μL ekleyin ve kapatın.
- Her iki şerit termocycler koyun ve uygun çalıştırmak seçin (Tablo 3).
- Su tüpünü atın ve elde edilen nüklrik asidi dondurucuda, mümkünse ya da yoksa, ikinci bir testin gerçekleştirilmesi gerektiğinde ışığa karşı korunan taze bir yerde tutun.
- Mikropipetler, raf, çalışma malzemesi ve tüm malzemeyi düzgün bir nüklik asit temizleyici ile temizleyin ve kullanılan ucu, eldivenleri ve tüpleri içeren plastik torbası atın.
DIKKAT: Nüklik asit çıkarıcı çok yanıcı bir sıvı ve buharıdır. Sprey sis nefes ve gözler veya cilt ile sıvı herhangi bir temas önlemek etmeyin. Aksi takdirde, hemen bol su ile durulayın ve tıbbi tavsiye isteyin. - Sonuçları toplayın ve elde edilen verileri analiz edin.
-
MS2 nicel PCR
- 2, 4 ve 5 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.
- 4 μL PCR karışımı ekleyin ve 0,5 μL ters transkriptaz enzimi için tüpler 1-5.
- Örnek A 'dan tüp 1 ' e ve 14 μL 'den Tüp 3 ' e örnek B 'ye 14 μL nükleik asit ekstraksiyonu ekleyin.
- 1 μL ayıklanan nükleik asitleri, örnek A 'dan tüp 2 ' ye ve 1 μL 'ye örnek B 'den tüp 4 ' e ekleyin. Beş-tüp şeridi kapatın.
- 15,5, 5, 6, 7 ve 8 numaralı tüplere atom içi ücretsiz su ekleyin ve kapatın.
- 4 μL PCR mix ve 0,5 μL ters transkriptaz enzim 6, 7 ve 8 Tüpler ekleyin.
- Her iki şerit termocycler koyun ve uygun çalıştırmak seçin (Tablo 3).
- 4.1.10 için 4.1.8 adımlarda açıklandığı gibi devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntem geliştirme
Bu prosedür GenIUL ve Oxfam ıntermón işbirliği ile su ve gıda virüsler Kontaminants Laboratuvarı geliştirilmiştir. Bu üç farklı adımda oluşur. Birincisi, viral parçacık konsantrasyonu, daha önce12,17,18açıklanan bir yağsız süt flokülasyon yöntemi bir adaptasyon olduğunu. Orijinal Yöntem bir güç kaynağı, daha basit ve santrifüjleme adımları olmadan bağımsız olarak değiştirildi.
VirWaTest konsantrasyon yönteminin kurtarılması HAdV ve MS2 bakteriyofis-çili yeraltı suyu örneklerinde test edildi. VirWaTest konsantrasyonu ve ekstraksiyon yönteminin viral iyileşmesi, HAdV için% 3,01, MS2 ve% 17,52 ile% 44,22 arasında% 18,02 olarak tahmin edilmiştir. Bu kurtarmalar, bu viral stokların bilinen konsantrasyonlarına sahip olduktan sonra su örneklerinde HAdV ve MS2 ilk konsantrasyonlarına kıyasla yöntemin geliştirilmesi sırasında nicel PCR tarafından elde edilen değerlerden hesaplanır.
VirWaTest manyetik nüklik asit ekstraksiyonu, 33 nehir ve yeraltı suyu numunelerinin HAdV ve MS2 ile birlikte test edilerek Laboratuvarda kullanılan sütun bazlı ekstraksiyon yöntemi olan ticari RNA mini kiti (örn. QIAamp viral RNA mini Kit) ile karşılaştırıldı ve konsantre tarafından yağsız süt Flocculation. Karşılaştırma sonuçları VirWaTest yöntemi kurtarma HAdV için 23/33 durumlarda, yanı sıra MS2 (Tablo 4) için daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bir Wilcoxon testi MS2 için HAdV ve 0,02791 için 0,0005569 p-değerleri gösterdi. VirWaTest nüklik asit ekstraksiyon ticari bir daha önemli ölçüde daha yüksek viral kurtarma sağlar.
VirWaTest yöntemi ile konsantre çevresel su örneklerinde HAdV tespiti
Alanda viral konsantrasyon için Gelişmiş yöntemi test etmek için, Oxfam su, sanitasyon ve hijyen (WASH) ekibi, banghi bulunan (RCA) Mart 2017, toplanan ve beş iyi su örneklerinden konsantre virüsler.
Ayrıca, Pedernales alanında (Ekvador), hangi depremler tarafından etkilenen 2016 ve 2017, altı iyi su örnekleri Şubat ayında bir Oxfam WASH ekibi tarafından toplanan 2017, ve virüsleri VirWaTest konsantrasyon yöntemi ile konsantre edildi. Her iki ayardan viral konsantreler VirWaTest nüklik asit ekstraksiyon ve viral quantification için Barselona laboratuvarına gönderildi.
Ekvador 'da, doğal olarak ortaya çıkan HAdV altı numunenin altı içinde incelenmiştir, 3,27 x 101 ile 1,80 x 102 GC/L arasında değişen konsantrasyon değerlerine sahip, ancak beş örneklerden biri toplanan ve banghi (RCA) ' da yoğunlaşmıştır 3,46 x 102 GC/L (Tablo 5) konsantrasyonunda hadv için pozitif.
MS2, iç proses kontrolü olarak tüm test örneklerine eklenen, test tüm örneklerinde tespit edildi, yöntemin doğru konsantrasyon tespiti için gerçekleştirildiğini gösteren.
Şekil 1 : Virwatest yöntemi. Adımları genel bakış VirWaTest yöntemi oluşur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Malzeme | Konsantrasyon | Nüklik asit ekstraksiyon | Algılama |
| Ekipman | Manyetik karıştırıcı (2 adet) Pil (2 adet) Pil/karıştırıcı konnektörleri (2 adet) Güç adaptörleri (2 adet) Kova desteği (2 adet) Halat (1 adet) Karıştırma mıknatıs (3 adet) Cımbız (1 adet) Silikon borular (1 adet) Pipet kumandası (1 adet) Marker (1 adet) |
Manyetik pipet (1 adet) Solar Rotary platformu (1 adet) Çok boyutlu tüp raf (1 adet) Zamanlayıcı (1 adet) |
Termocycler (1 adet) Pil (1 adet) Bilgisayar Tüp raf (1 adet) 0,5 μL-10 μL Micropipet (1 adet) 2 μL-20 μL Micropipet (1 adet) |
| Sarf malzemeleri ve reaktifler (her 2 su örneği için/çoğaltır) | Kova (3 adet) pH gösterge şeritler Teyp-End 10 mL pipet (2 adet) Açık tip 10 mL pipet (2 adet) Teyp-End 50 mL pipet (2 adet) Teyp-End 100 mL pipet (2 adet) Pasteur pipet (4 adet) Stand-up plastik torba (4 adet) 25 mL damıtılmış su ile Plastik Konteyner (1 adet) 50 mL damıtılmış su ile Plastik Konteyner (1 adet) 100 mL boş konteyner (1 adet) Eldiven (6 Pairs) Proses kontrolü (2 tüpler) 10 mL distile su ile boru (2 adet) Sitrik asit (1 tüp) Sodyum hidroksit (1 tüp) Skimmed süt (1 tüp) Sitrik asit poşeti (1 adet) Damıtılmış su (1 500 mL şişe) Örnek Klima (2 poşet) Koruyucu çözelti (2 tüpler) Nötralizasyon ajanı (4 poşet) |
Manyetik pipet uçları (2 adet) Pasteur pipet (2 adet) Bağlayıcı tampon (2 tüpler) Yıkama tamponu 1 (2 tüpler) Yıkama tamponu 2 (2 tüpler) Yıkama tamponu 3 (2 tüpler) Elüsyon tampon (2 tüpler) Eldiven (6 Pairs) |
10 μL Micropipet uçları (1 kutu) 20 μL Micropipet uçları (1 kutu) DNA qPCR Mix (1 tüp) RNA qPCR Mix (1 tüp) Ters Transcriptase enzim (1 tüp) Moleküler Biyoloji su (1 tüp) Primers, prob ve standart (1 ünite) ile HAdV tüp şeridi MS2 astar, prob ve standart (1 ünite) ile tüp şeridi Nüklik asit sökücü Eldiven (6 Pairs) |
Tablo 1: VirWaTest içeriği. İki su örneğinde/çoğaltır virüs konsantrasyonu, ekstraksiyon ve algılama için hazırlıklı olması gereken ekipman, sarf malzemeleri ve reaktifler.
| Virüs | Astar | GenBank katılım No. | Konum | Sıra (5 ' \u20123 ') | Uzun -luğu | Başvuru | ||
| İnsan Adenovirus (HAdV) | Adf | J 01917.1 | 18869\u201218887 | (CWTACATGCACATCKCSGG) | 19 | Hernroth ve ark., 200215 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | Mehmet hüseyın | 19 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2 bakteriyofaj (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344 \ u2012363 | ELAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson ve ark., 200916 | ||
| pecson-2R | 659 \ u2012678 | BIR daha. | 20 | |||||
| PecP-2 | 369 \ u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tablo 2: nicel PCR denemeleri Için Oligonükleotides. Primers ve prob, HAdV ve MS2 nüklik asit dizileri bağlamak için tasarlanmıştır.
| Sıcaklık | Zaman | Döngü | Sıcaklık | Zaman | Döngü |
| 95 °C derece | 12 dak. | 1 | 55 °C derece | 15 dk. | 1 |
| 95 °C derece | 10 dak. | 1 | |||
| 95 °C derece | 15 sn | 40 | 95 °C derece | 15 sn | 40 |
| 60 °C derece | 1 dk. | 60 °C derece | 1 dk. |
Tablo 3: nicel PCR denemeleri Için termal koşullar. HAdV ve MS2 amplifikasyon için kullanılan sıcaklık, zaman ve döngüleri.
| QIAgen | VirWaTest | QIAgen | VirWaTest | ||
| Medyan | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| Demek | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| HAdV için p-değeri (Wilcoxon): 0,0005569 | |||||
| p-değeri (Wilcoxon) MS2 için: 0,02791 | |||||
| Virüs test | Test örnekleri | QIAgen | VirWa testi | ||
| HAdv | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tablo 4: VirWaTest nüklik asit ekstraksiyon gelişimi. 33 HAdV ve MS2 için yeraltı suyu örneklerinde Qiagen ve VirWaTest ekstraksiyon yöntemlerini karşılaştırırken elde edilen medyan, ortalama ve SD değerler.
| Ülke | Site | Örnek | HAdV GC/L |
| Rca | Bir de la SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, köy 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, köy 3 | 3 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier fondo | 4 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Ekvador | (Borehole A) | 6 | 7,96 x 101 |
| Emrah B | 7 | 1,80 x 102 | |
| Emrah C | 8 | 8,88 x 101 | |
| Iyi su A | 9 | 6,06 x 101 | |
| Iyi su B | 10 | 1,12 x 102 | |
| Iyi su C | 11 | 3,27 x 101 |
Tablo 5: VirWaTest yöntemini kullanarak HAdV 'In ölçülmesini. Nicel PCR sonuçları, GC/litre cinsinden, HAdV için toplanan ve RCA ve Ekvador konsantre su örneklerinde nicelik için ifade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VirWaTest yöntemi, deneyimli olmayan kullanıcılar tarafından kullanım noktasında virüs ve nüklik asit ekstraksiyonu su örneklerinden konsantrasyonu sağlar. Bu, uygun maliyetli, hızlı ve basit bir protokoldür. Konsantrasyon, düşük pH ve yüksek iletkenlik koşullarında yağsız süt proteinlerinin, virüslerin adsorbe olduğu flokların ya içine toplu hale getiren, yağsız süt kullanılarak organik flocculasyon ilkesine dayanır. Ne zaman flokların ya sediment, onları toplamak kolay, 10 L su konsantre mümkün hale, geleneksel ultracent, büyük su hacimleri ile başa çıkmak olamaz ise.
Yöntem, pille çalışan manyetik karıştırıcı dışında herhangi bir elektrik Ekipmanı kullanmadan örnekleme noktasında uygulanabilir olması için değiştirildi. Su filtrasyon dayalı diğer bazı yaklaşımlar virüslerin konsantrasyonuna adapte edilmiş ve ayrıca kullanım noktasında gerçekleştirilebilir. Ancak, su örneklerinde bulunan askıya alınan malzeme genellikle filtreleri takunya; Bu nedenle, bu sistemler ile konsantre olabilecek küçük hacim ciddi bir kısıtlamadır.
Bu, numunenin bulanıklığını ne olursa olsun, kullanım noktasında su örneklerinden virüs konsantre etmek için bir yöntemin ilk açıklamasıdır. VirWaTest konsantrasyon yöntemi, uygun malzeme varsa aynı anda birkaç numunenin işlenmesini sağlar. Ayrıca, yağsız süt flokülasyon bakteri ve parazit konsantrasyonu19için yararlı olduğu gösterilmiştir.
Uygun malzemenin hazırlanması prosedürü düzgün gerçekleştirmek için çok önemlidir. Analiz edilecek su örneklerinin sayısını göz önünde bulundurun ve reaktifler ve malzemenin hazırlanması için test gerekli olduğu yere geçmeden önce reaktif ve malzeme hazırlamak. Uygun miktarda malzeme varsa, aynı anda çeşitli örnekler işlenebilir.
Bir su numunesi konsantrasyonu başlamadan önce, bir viral stok bilinen bir konsantrasyon süreç kontrolü olarak örnek Spike için kullanılacaktır. Bu yöntem, kullanım noktasında su örneğine eklenmeden önce damıtılmış su ile rehydrated bir kurutulmuş viral stok kullanır. Bu yordamın sonunda yanlış negatif sonuçlar kural ve yöntemin performansını bir göstergesi verir yararlıdır.
VirWaTest ile elde edilen viral konsantreler, VirWaTest nüklik asit ekstraksiyon ve algılama yöntemlerinin uygulanması alanında daha fazla test edilebilir veya alternatif olarak, oda sıcaklığında bir referans laboratuvarına konsantreler gönderilebilir. Konsantre koruyucu çözüm, virüslerin 2 haftaya kadar kararlı kalmasını sağlar (yayımlanmamış sonuçlar).
VirWaTest nüklik asit ekstraksiyon Manyetik parçacık tabanlı bir yöntemdir. Kolay ve hızlıdır ve birkaç numunenin aynı anda işlenmesini sağlar ve viral nüklik asit ekstraksiyonları için şu anda kullanılan yöntemlere göre eşdeğer ve daha iyi iyileşme verimliliği gösterir. Nükleik asitler, oda sıcaklığında referans laboratuvarlara gönderilebilir veya kullanıcıların moleküler algılama gerçekleştirmede emin iseniz, orijinal su örneğinin kullanımı noktasında nicel bir PCR tahlil yapılabilir.
Ayrıca, küçük bir laboratuar tesisi varsa, VirWaTest konsantrasyon protokolü bir santrifüje bağlı standart nüklik asit ekstraksiyon kitleri ve reaktifler korumak için bir dondurucu gerektiren standart PCR tabanlı yöntemlerle birleşebilir ancak bu kullanımı Standart termocyclers, daha az pil çalışan olanlar daha pahalıdır.
Ancak, bir güç kaynağı bazen mevcut olmadığından, biz MS2 bakteriophages için süreç kontrolü ve viral bir dışkı göstergesi olarak HAdV olarak tespit optimize edilmiştir, ve metodoloji diğer herhangi bir virüs için özelleştirilebilir, hepatit gibi virüsler, RoV, NoV, ya da diğerleri, reaktifler bakım için bir dondurucu gerek kalmadan alanında çalıştırmak için, ne de geleneksel termocyclers ama sadece bir pil tarafından işletilen bir. Pille çalışan birkaç termocyclers ticari olarak mevcuttur. Alternatif olarak, bir güç kaynağı varsa, diğer konvansiyonel qPCR donanımları kullanılabilir. Bir sekiz-tüp termocycler kullanılırsa, iki nükleik asit ekstraksiyonları (iki farklı numune veya aynı örnekten iki çoğaltır) aynı PCR tahlil test edilebilir. Her nükleik asit ekstraksiyon için, iki farklı miktarlarda numunenin kökeni enzimatik inhibisyonu dışarı kural test edilecektir. Adaptasyon, PCR tüplerinin hava kurutma astar, prob ve standart süspansiyonlar ile önceki hazırlığına dayanmaktadır. Burada açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayarak kullanılabilecek birkaç liyofilize ticari qPCR çözümleri var. Biz gerçekleştirmek için kolay olarak kabul bir olasılık tarif ettik.
Yöntemin geliştirilmesi sırasında gerçekleştirilen karşılaştırma yöntemleri, konsantrasyon, ekstraksiyon ve algılama VirWaTest yöntemlerinin su örneklerinde virüslerin ölçülmesi için verimli olduğunu göstermiştir.
Konsantrasyon değişkeninden sonra toplanan birim bu yana tanımlanan yordamın algılama (LOD) sınırı değişkendir. Ayrıca, LOD farklı virüsler için biraz farklı olabilir. Yaklaşık 10 L hacmi toplanırsa, HAdV için LOD yaklaşık 1 x 102 viral GC/L olacaktır. Dolayısıyla, nispeten küçük HAdV konsantrasyonları VirWaTest yöntemi ile tespit edilebilir. İçinde Pedernales (Ekvador), altı numunelerin altı dışarı test HAdV sundu, konsantrasyonlarda LOD yakın, arasında değişen 3,27 x 101 için 1,80 x 102 GC/L. Banghi 'de (RCA), HAdV, 3,46 x 102 GC/L konsantrasyonunda analiz edilen beş numunenin birinde saptandı. HAdV varlığı, hem de MS2 varlığı olarak test numunelerde kontrol süreci olarak, yöntem su örneklerinden viral partiküllerin kurtarma için yararlı olduğunu gösterir, hatta olmayan kullanıcılar tarafından gerçekleştirilen.
Şu ana kadar elde edilen geribildirim, viral konsantrasyonun, numunelerin kullanım noktasında uygulandığında önemli sorunlar olmadan, gerçekleştirmek için kolay bir prosedür olduğunu gösterir, ancak 8 h ve 5 h basamakları gereklidir. Bu adımlar herhangi bir insan yardımı olmadan ortaya dikkat etmek önemlidir. Dahası, filtrasyon temelinde daha hızlı bir yöntem, bulanık olmayan sularda alternatif olarak geliştirilmiştir. Ancak, flokülasyon şimdiye kadar, yüksek bulanıklık sunan numunelerin konsantrasyonu sağlayan benzersiz bir yöntem gibi görünüyor. Viral konsantreler daha sonra oda sıcaklığında dünyanın dört bir yanından herhangi bir laboratuara gönderilebilir, bu da daha kolay örnekleme alanları her zaman iyi ulaşım hizmetleri soğutma koşulları sağlayan yok beri virüsler test yapar. Alternatif olarak, burada sunulan ayıklama ve algılama protokolleri numunelerin kullanımı noktasında viral algılama için test sağlar.
Bildiğimiz kadarıyla, bu ilk yöntem konsantrasyonu ve alanda su örnekleri virüslerin varlığı için test için yararlı olduğu bildirilmiştir. Diğer birçok insani kriz senaryosunda, insan viral patojenlerin varlığını değerlendirmek için prosedür uygulamak için daha fazla çaba yapılmalıdır. Ayrıca, kullanıcının geribildirim prosedür dostça yapmak için potansiyel uygulama hakkında Öngörüler sağlamak için gerekli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
VirWaTest bir araştırma projesi HıF tarafından finanse edildi (Insani yenilik fonları) ELHRA programı (geliştirme öğrenme & Insani yardım için araştırma). Yazarlar bu çalışmada nazikçe işbirliği yapan WASH ekipleri kabul eder. Ekvador numunelerin Analizi Oxfam Ecuador ve Dirección de araştırma de la Universidad de Las Americas tarafından finanse edildi (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas Barcelona Üniversitesi 'nde bir Serra-Hunter adam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
