Test in vitro ad alto rendimento utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente

Gli organoidi tumorali derivati dal paziente ricapitolano accuratamente l'architettura e la funzione del tessuto tumorale con una migliore riproducibilità della malattia. Pertanto, la risposta di un paziente ai farmaci antitumorali può essere valutata con precisione utilizzando questo modello. Gli organoidi tumorali non sono adatti per un sistema di analisi in vitro ad alto rendimento o per l'analisi cellulare a causa della formazione di grandi cluster in coltura.

Utilizzando questa tecnica, è stato sviluppato un HTS semplice e più accurato per la valutazione di farmaci a bersaglio molecolare. Poiché la coltura organoide è molto diversa dalla coltura 2D, all'inizio ci si può sentire confusi sulla cultura, ma è importante osservare attentamente i cambiamenti morfologici degli organoidi. Dopo aver rimosso il vile congelato dalla conservazione dell'azoto liquido, agitare delicatamente gli organoidi tumorali derivati dal paziente a bagnomaria a 37 gradi Celsius per un minuto.

Rimuovere il vile dal bagno d'acqua e pulire con etanolo al 70%. Quindi posizionare il flaconcino nell'armadio di biosicurezza. Trasferire gli organoidi tumorali in un tubo da 15 millilitri contenente il mezzo per gli organoidi.

Utilizzare una pipetta di trasferimento a tre millilitri per mescolare delicatamente gli organoidi tumorali e il mezzo pipettando su e giù cinque volte. Pellet giù gli organoidi tumorali per centrifugazione. Scartare il surnatante e risospese il pellet organoide tumorale in cinque millilitri di mezzo fresco.

Trasferire la sospensione organoide tumorale in un pallone T25 e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo una settimana dal primo passaggio, trasferire la sospensione organoide tumorale da due palloni T25 in due tubi centrifughi e pellet giù gli organoidi tumorali mediante centrifugazione. Stimare il volume del pellet organoide tumorale e risospesciare il pellet in 2,5 millilitri di mezzo fresco per tubo.

Raggruppare la sospensione organoide tumorale in un tubo. Trasferire la sospensione aggregata in un matraccio T75 contenente 10 millilitri di mezzo fresco e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore di cambio del mezzo, tritare gli organoidi tumorali utilizzando uno strumento di frammentazione e dispersione cellulare dotato di un portafiltro contenente un filtro a maglie da 70 micrometri.

Diluire 15 millilitri di sospensione organoide tumorale 10 volte. Utilizzare il distributore di sospensione cellulare per seminare 40 microlitri di sospensione organoide tumorale diluita in una micropiastra sferoidale a attacco ultra basso da 384 pozzetti. Dopo 24 ore, utilizzare un gestore di liquidi per aggiungere 0,04 microlitri di soluzioni di agenti di prova da 10 diluizioni seriali a intervalli di concentrazione finale da 20 micromolari a 1,0 nanomolari nei pozzetti e incubare la piastra per sei giorni.

Alla fine dell'incubazione, aggiungere il reagente di misurazione dell'ATP intracellulare nei pozzetti di prova. Utilizzare un mixer per mescolare il contenuto della piastra e incubare la piastra per 10 minuti a circa 25 gradi Celsius. Utilizzare un lettore di piastre per misurare il contenuto intracellulare di ATP come luminescenza.

Dopo 24 ore dal terzo passaggio, posizionare una micropiastra sferoidale ad attacco ultra basso a 384 pozzetti con 40 microlitri di mezzo per e una piastra di destinazione sul sistema di prelievo e imaging cellulare. Costruire la camera di raccolta con sei millilitri di terreno di coltura e centrifugare a 1.500 volte G per due minuti per rimuovere le bolle d'aria. Aggiungere quattro microlitri di sospensione organoide tumorale nella camera di prelievo e impostare la camera di prelievo sul sistema.

Lasciare che i cluster cellulari si depositino nella parte inferiore della camera per un minuto dopo la dispersione e quindi avviare la scansione della camera. Impostare la dimensione del picking da 140 a 160 micrometri sul sistema per la selezione automatica dei cluster di celle. Quindi, controllare la qualità dei cluster di celle selezionati sulle immagini scansionate e trasferire 10 cluster di celle per pozzo utilizzando i suggerimenti di prelievo nella piastra di destinazione.

Nel presente studio, è stato valutato l'effetto degli agenti antitumorali sull'organoide tumorale derivato dal paziente. L'elevata sensibilità per tutti gli agenti antitumorali è stata indicata dai valori di concentrazione inibitoria semi-massimale inferiori a due micromolari nell'area sotto i valori della curva inferiori a 282. Per una valutazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente, è stata misurata la percentuale di citolisi degli organoidi tumorali in presenza di due diversi anticorpi.

La percentuale di citolisi è aumentata con il tempo. Senza gli anticorpi a sei ore con il rapporto effettore-cellula bersaglio di uno a uno, la citolisi ha raggiunto il 45% Mentre al rapporto di due a uno, la citolisi ha raggiunto il 70% La citolisi mediata da cellule natural killer usando trastuzumab era di circa il 60% al rapporto effettore-cellula bersaglio di uno a uno e l'80% al rapporto di due a uno a sei ore. Al contrario, cetuximab ha avuto un impatto dose-dipendente sulla citolisi mediata da cellule natural killer.

Alla più alta concentrazione di cetuximab, è stata osservata una citolisi del 90% nel rapporto effettore-cellula bersaglio di uno a uno e la citolisi al 100% è stata osservata nel rapporto di due a uno, indicando un'elevata efficacia di cetuximab. Un sistema di analisi ad alto rendimento che utilizza organoidi tumorali derivati dal paziente è superiore alla valutazione di potenziali agenti anti-cancro e presenta opportunità per la valutazione dei farmaci e i progressi nella medicina personalizzata.