Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

Summary

Imaging embryonal vävnad i realtid är en utmaning under långa tidsperioder. Här presenterar vi en analys för att övervaka cellulära och sub-cellulära förändringar i chick ryggmärgen under långa perioder med hög rumslig och temporal upplösning. Denna teknik kan vara anpassade för andra regioner av nervsystemet och utvecklande embryot.

Abstract

Den embryonala ryggmärgen består av cykling neurala progenitorceller som ger upphov till en stor andel av de neuronala och glia-celler i det centrala nervsystemet (CNS). Även om mycket är känt om de molekylära mekanismer som mönster ryggmärgen och framkallar neuronal differentiering ^{1, 2,} saknar vi en djup förståelse för dessa tidiga händelser på nivå cellens beteende. Det är sålunda kritiskt att studera uppträdandet av neurala progenitorceller i realtid, eftersom de undergår neurogenes.

Tidigare har realtid avbildning av tidig embryonal vävnad har begränsats av cell / vävnads viabilitet i odling liksom de fototoxiska effekten av fluorescerande avbildning. Här presenterar vi en ny analys för avbildning sådan vävnad under långa perioder, att använda en ny ex vivo-protokoll slice kultur och brett fält fluorescensmikroskopi (Fig. 1). Detta tillvägagångssätt ger på lång sikt time-lapse övervakning av chick embryonal sPinal sladd stamceller med hög rumslig och temporal upplösning.

Denna analys kan modifieras till bild en rad av embryonala vävnader ^{3, 4} Förutom observation av cellulära och sub-cellulära beteenden, utveckling av nya och mycket känsliga reportrar för genaktivitet (till exempel Notch signalering ⁵⁾ gör denna analys ett kraftfullt verktyg för att förstå hur signalering reglerar cellens beteende under fosterutvecklingen.

Protocol

1. Dish Preparation

1. Rätter som används för bit kultur är glasbottnad (med ett täckglas som bas) (WillCo rätter). Dessa placeras på linsen vävnad i en 6 cm vävnadsodlingsplatta för att hålla glaset botten ren.
2. På dagen före experimentet, tillsätt 2 ml 0,1% poly-L-lysinlösning till glaset bottenförsedda skålen och inkubera under 5 min vid rumstemperatur för att tillåta den poly-L-lysin för att belägga glaset botten.
3. Ta bort poly-L-lysin lösning och skölj tre gånger i avjoniserat vatten och därefter en gång i 70% etanol.
4. Låt torka över natt. Rätter kan också torkas genom en försiktig uppvärmning i mikrovågsugn på låg effekt i 30-45 sekunder.

2. Embryo Elektroporering

1. Inkubera ägg vid 37 ° C till Hamburger-Hamilton (HH) steg 10 (≈ 36 timmar) (eller annan önskad scenen).
2. Innan du börjar förbereda glas nålar (vi använder en Flaming / Brun Modell p87 mikrokapillär avdragare) och bryta spetsen av needle med användning av en fin pincett under ett dissektionsmikroskop. I slutet av nålen bör vara tillräckligt skarp för att genomtränga embryot utan att ha ett så smalt att det hindrar injektion av DNA-lösningen.
3. Fönster ägg och elektroder ställe (5 mm från varandra) på vardera sidan av embryot
4. Införa DNA (~ 0,025 till 0,5 pg / pl i avjoniserat vatten färgas med en liten mängd av snabb grönt) i det neurala röret.
5. Tillämpa gällande - 12-17 V tre gånger, 50 ms pulslängd med 950 ms mellan pulserna.
6. Vi använder låga koncentrationer av DNA och låga spänningar elektroporation för att uppnå mosaik uttryck så att vi kan följa enskilda celler.
7. Täck fönster i äggskalet med cellotape och kontrollera att den är förseglad.
8. Tillåta embryona att återhämta sig under 3-4 timmar eller över natten vid 37 ° C.

3. Kollagen och skiva kultur Medium Förberedelser

1. Förbered kollagen mix och skiva odlingsmedium cirka en timme före skivning.
2. Till 300 | il typ 1 kollagen tillsätt 100 pl 0,1% ättiksyralösning och 100 | il 5 x L15-medium. Vortex noggrant efter varje tillsats. Lösningen ska gulna.
3. Nu lägga 15-20 il 7,5% natriumbikarbonat och grundligt vortex. Lösningen bör bli svagt rosa, och volymen av natriumbikarbonat som krävs för detta kan variera. Håll på is och fyll upp nytt varje gång.
4. Till 10 ml Neurobasal-medium tillsätt B-27 komplement och Glutamax, att en 1 x slutlig koncentration och 10 | il gentamicinlösning.
5. Ställe medium i en 37 ° C inkubator buffrad med _5% CO2. Lämnar den övre delen av behållaren lös för att tillåta den att utjämnas mot _CO2.

4. Slice Kultur

1. Ta bort embryon från ägg och tvätta i L15 medium.
2. Rum i en vävnadsodlingsskål med ett skikt av Sylgard vid botten och stift dem genom de omgivande extra embryonala membranen så att de sträcks spänd.
3. Använda en mikrofonroknife, skiva embryot så rak som möjligt genom regionen av intresse. För ryggmärgen bör skivor ligga mellan 1-2 somiter tjocka. Låt skivor knutna till embryo medan du skär andra embryon så att du inte förlorar dem.
4. Framställa en 200 pl mikropipett spets genom att skära av ~ 1 mm av spetsen och fästa detta till ett p2 eller p10. Denna spets kommer att användas för att överföra ryggmärgsskivor till glaset nedre skålen. En 10 pl tips är att inte tillräckligt bred för att plocka upp skivor.
5. Belägga insidan av spetsen med kollagen genom att pipettera 1 il kollagen blandning framställdes sedan. Låt stå i 1-2 minuter och skölj sedan med L15 medium. Detta kommer att förhindra att vävnaden från att klibba fast på insidan av spetsen.
6. Ta bort skiva från embryo med hjälp av en microknife och ta bort från skålen med en P2 eller P10 utrustad med en 200 fil spets och satt till 1 fil. Försök att ta upp så lite medium som möjligt.
7. Vortex kollagen mixen och släpp 5-8 pl av denna vidare till poly-L-lysin belagd skålen.
8. Omedelbart tas embryot skiva i kollagen och position på plats med ett par av fin pincett. Skivorna bör placeras så att den sida som skall avbildas ligger i plan med täckglas. Vävnaden bör vidhäfta till poly-L-lysin beläggning på täckglaset.
9. Upprepa detta tills du har flera skivor på täckglaset. Vi kan vanligtvis rum 6-9 skivor på ett fat.
10. När alla skivorna är på plats skall den omfatta skålen och tillåta kollagen för att ställa i 20 minuter. En del av den placerade tidigaste kollagenet kan redan ha börjat torka ut. För att förhindra detta lägger en liten mängd L15 dessa innan du täcker.
11. Väl inställd, tillsätt försiktigt 2 ml medelstora bit kultur som har jämviktats i 5% CO ₂ vid 37 ° C under minst en timme. Försiktighet måste vidtas för att inte rubba det kollagen från täckglaset.
12. Rum i en 37 ° / _5% CO2 inkubator och tillåta skivorna återhämta sig under minst 3 timmar innan avbildning. Om det inte finns någon fukt, placera skålen i en plexiglaslåda humorha lite fuktigt papper i ett hörn.

5. Imaging Embryo Slices

1. Vi använder en DeltaVision kärna brett fält mikroskop utrustat med en väderstation miljö kammare för bild skivor. Kammaren bibehålls konstant vid 37 ° C, med en _CO-2 perfusionsapparat att bibehålla mikroskopställningen vid _5% CO2 / 95% luft.
2. Imaging utförs normalt med en 40 x / 1,30 NA objektiv oljeimmersion och bilder tagna med en CoolSnap HQ2 kyld CCD-kamera.
3. Z-sektioner tagna var 1,5 | im genom 45 ^ m vävnad. Exponeringstid bör hållas så låg som möjligt. Vi utsätter normalt 5-50 ms för varje Z-sektion. Bilderna är tagna var 7 minuter och upp till 9 skivor kan besökas med DeltaVision systemets exakt punkt besök funktion.

6. Representativa resultat

Ett exempel tidsförlopp sekvens av en ryggmärg progenitorcell ärvisas i Fig.. 2a och motsvarande Film 1. Imaging startades på en ryggmärg skiva från en två dagar gammal (HH steg 12) embryo. Denna cell transfekterades med en konstruktion som uttrycker GFP-αTubulin. Under detta tidiga skede, neurala stamceller genomgår huvudsakligen stamfader-progenitorceller mode divisioner under vilken cellerna delar för att generera ytterligare två celler cykling stamceller. Figur. 2b och motsvarande Movie 2 visar en cell transfekterad med GFP-GPI (GPI förankrade GFP), som markerar cellmembranet. Denna cell genomgår en delning under vilken basala processen delas upp i två och är lika ärvs av dottern cellerna.

Figur 1. Slice kultur protokoll för time-lapse avbildning.

Figur 2. Cellen behavior under normal ryggmärg utveckling. (a) Utvalda bilder från film 1. Cell som uttrycker GFP-tubulin delar med en klyvning plan som är vinkelrätt mot den apikala ytan (2 h 20 min), vilket genererar två dotterceller som delar återigen (24 h 23 min och 25 h 54 min). (B) Utvalda bilder från Movie 2. Cell transfekterad med GFP-GPI genomgår celldelning under vilken basala processen delas (vita pilar) och lika ärvs av dottern cellerna.

Film 1. Klicka här för att se filmen .

Movie 2. Klicka här för att se filmen .

Discussion

Vi presenterar här en ny time-lapse avbildning analys för att övervaka cellens beteende i kyckling embryonal skiva kultur. Denna analys möjliggör hög upplösning avbildning av levande vävnad för upp till 70 timmar, även om tidsramar mellan 24-48 timmar är lättare att fånga. Användningen av en hög NA olja mål och relativt korta intervall mellan tidpunkter gör bilden förvärvet med hög upplösning, samt ger oss möjlighet att övervaka cellens beteende som ofta sker snabbt och kan lätt missa under vanlig time-lapse avbildning med konfokal mikroskopi.

Den stora fördelen med denna analys är förmågan att bilden celler under långa tidsperioder. Användningen av breda fält ⁶ i stället för konfokala laser scanning ⁷ mikroskopi är avgörande för detta. Konfokalmikroskopi har traditionellt erbjudit flera fördelar jämfört med brett fält mikroskopi, inklusive möjligheten att ta optiska sektioner och eliminera ofokuserad information direkt 8, med undantag av en signifikant mängd information, och nödvändiggör längre exponeringstider. Bred-mikroskopi, å andra sidan, använder fullständig fältbelysning och allt ljus som passerar genom objektiv sänds till detektom. Detta tillsammans med en hög kvanteffektivitet kyldes anordning (CCD)-kamera säkerställer avbildning med en hög signal till brusförhållande i jämförelse med konfokalmikroskopi ^9, med mycket snabba exponeringstider. I vår ansökan måste vi bilden under långa perioder, spela 3D-stackar och slutligen lösa små nära diffraktionsbegränsad strukturer. Även konfokalmikroskopi förhindrar out-of-fokus ljuset från att någonsin nå detektorn och därmed avsevärt minskar bakgrund i tjocka, tätt-märkta prover ^{7, 8,} uppnår bara en användbar signal-brus-förhållande med mycket större ljus input än bred- mikroskopi ^10. För mycket ljuskänsliga sparselY-märkta prover som våra elektroporerade ryggmärgen skivor, därför genomför brett fält mikroskopi bättre än konfokalmikroskopi. När den kombineras med bild restaurering av avfaltning, som tar bort ur fokus information och förbättrar kontrast, wide-fältet är då särskilt bra för detektering av små, dunkla föremål ^11. Även om inte lämpliga för alla vävnader avbildning experiment har detta tillvägagångssätt varit mycket effektiva för vår levande cell imaging program.

Valet av fluorescerande protein är en viktig faktor som kan påverka cellöverlevnad. Vi finner att de bästa resultaten erhålles från konstruktioner som använder grönt fluorescerande protein (GFP) ¹² som en markör. Vi utvärderar för närvarande ett antal röda fluorescerande proteiner som effektivt kan användas i kombination med GFP för dubbla kanaler time-bortfaller. Det finns ett flertal sådana proteiner som finns ^13. Även om många proteiner är stabila som fusioner med en fluorescerande proteinKan vissa proteiner göras instabil genom sammansmältning, vilket resulterar i reducerad cellviabilitet. I sådana fall är användningen av konstruktioner innehållande en inre ribosominträdesställe (IRES) är användbara för att separera det intressanta proteinet från det fluorescerande proteinet.

När imaging ryggmärgen skivor, måste man för att minimera exponeringen för fluorescerande ljus. De mikroskop okular får endast användas med ljus (brightfield) för att hitta och position skivor. Fluorescerande bilder bör alltid köpas med hjälp av mikroskop programvaran med minimal exponering gånger. Dessa bör hållas i intervallet 5-50 ms och användning av neutrala densitet filter bör experimenteras med. Även om längre exponeringstider kan initialt producera tydligare bilder, kan de fototoxiska effekten av fluorescerande ljus exponering leder till celldöd. De första 5-10 | im i vävnad som är närmast den täckglaset bör inte avbildas som denna region innehåller vävnad som kan ha skadats underskivning.

Även om exemplen som presenteras här är embryon elektroporerades vid HH skede 10 och avbildade 6-7 timmar senare, kan denna metod användas för embryon upp till HH scenen 18. I senare skeden är ryggmärgsvävnad mycket större och så är det svårt att skära hand. I dessa fall kan bädda embryona i agaros med låg smältpunkt och snittning med en vibratom erhålla bättre resultat. Även om vi presentera denna analys som ett förfarande för avbildning av celler i u ryggmärgen har detta tillvägagångssätt också modifierats för att avbilda andra embryonala vävnader, inklusive den sensoriska placodes ^3.