Abstract
본 연구는 열 응력과 관련된 합병증에 대한 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 균주의 보호 효과를 평가하기 위해 디자인되었다. 서른 두 흰쥐이 연구에 사용되었다. 동물을 경구 B. 두 일 동안 하루에 두 번 처리 하였다 서브 틸리 BSB3 변형 또는 PBS. 다음날 마지막 처리 후, 각 그룹을 분할하고, 두 개의 실험 그룹 (하나는 PBS로 처리 한 B. subtilis에 처리) 25 분 동안 45 ℃로 넣었다. 두 대조군은 실온에서 25 분 동안 머물렀다. 모든 쥐를 안락사시키고, 다른 매개 변수는 모든 그룹에서 분석 하였다. 열 스트레스의 악영향 융모 높이 및 장 상피 점막 전체 두께의 감소에 의해 등록된다; 루멘에서 박테리아의 전위; 혈액 (LPS) 수준 리포 폴리 사카 라이드의 적혈구의 수포 및 고도 증가했다. 치료의 보호 효능은 사전 평가되고이러한 부작용의 vention. 이 프로토콜은 열 스트레스 합병증의 예방을위한 박테리아와 쥐의 구강 치료를 위해 설립되었다, 그러나이 프로토콜은 수정 및 관리의 다른 경로에 대해 서로 다른 화합물의 분석에 사용할 수 있습니다.
Protocol
모든 실험 절차는 오번 대학의 IACUC, 어번, 알라바마에 의해 승인되었다.
문화 미디어, 요리 및 세균 문화 1. 준비
- 영양 한천 플레이트에 밤새 성장 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 BSB3 문화의 하나의 식민지를 가진 플라스크에 영양 배지 10 ㎖를 접종한다.
- 리터 당 포자 매체 (19) (500 ml의 확인 : 박토 영양 국물, 8g, 10 % (w / v)의 KCl을 10 ml의 1.2 % (v)를 4 × 7H 2 O, 10 ml의 황산 / 승, 한천, (15) g) 및 20 분 동안 121 ℃로 오토 클레이브. 다음 멸균 솔루션을 50 ℃로 냉각하고 추가 할 수 있습니다 : 1 M 칼슘을 (NO 3) 2, 1 ml의; 0.01 M MnCl 2, 1 ㎖; 1 mM의 4, 1 ml의 병용했을.
- 실온에서 20 분 동안 40 O를 C에 차가운 준비 매체는 살균 캐비닛 (20) 무균 배양 접시의 각에 25 ml에 붓는다. 매체가 하룻밤 응고 수 있습니다.
- B의 하룻밤 문화의 0.5 ml의 확산acillus 서브 틸리 BSB3 페트리 접시에서 매체의 표면에. 90 %의 포자까지 5 일간 37 ℃로 문화를 품어. 고해상도 현미경에 의한 위상 밝은 포자를 알 수있다.
- 플레이트를 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 첨가하고 멸균 된 셀 확산기를 이용하여 표면으로부터 박테리아를 긁어 수확 박테리아. 필요할 때까지 냉장고에 정지를 저장합니다.
- O 37 ℃에서 24 시간 - 18 인큐베이션 포자 형성 배지 플레이트 상에 세균 현탁액의 적절한 희석액 (10-5 ~ 10-6)의 0.1 mL의 도금에 의해 박테리아의 생존을 확인
- 식민지 카운터를 사용하여 접시에 박테리아 식민지를 카운트하고 테스트를 정지 박테리아의 역가를 계산합니다. 최종 농도 1 × 10 8 CFU / PBS에서 ml의 세균 현탁액을 준비합니다.
2. 동물
- 300g - 32 수컷 흰쥐 (250을 사용하여). 표준 펠릿 차우와 물을 무료로 액세스 할 수있는 특정 병원균이없는 상태에서 동물을 유지한다. 평균 온도 (21 ± 1 O를 C), 습도 (50 ± 5 %) 및 12 시간 명암주기를 설정합니다.
3. 실험 설계
- 적응 2 일 후 구강 투여 (11)에 의해 동물의 치료를 시작합니다. 경구 위관 바늘과 주사기를 사용합니다. B. 16 쥐 치료 서브 틸리 BSB3 현탁액 (랫트 당 1 mL)을 이틀 동안 하루에 두 번씩 (B. 서브 틸리 기). PBS 16 쥐 (쥐 당 1 ㎖) 이일 (PBS 군) (그림 1)에 대한 하루에 두 번을 취급합니다.
- 그룹 1 제어 (PBS / 아니오 스트레스), 그룹 2 (B) : 치료 후, 각 그룹 (그룹당 8 쥐)를 세분화 서브 틸리 스 (B. 서브 틸리 / 아니오 스트레스), 그룹 3 스트레스 (PBS / 열 스트레스) 및 그룹 4- B. 서브 틸리 + 스트레스 (B. 서브 틸리 / 열 스트레스).
- ELEC를 사용하여 각 쥐 직장 온도 측정디지털 온도계를 TRONIC. 25 분 동안 실온에서 그룹 1 및 2의 쥐 유지. 45 O C에서 기후 챔버에서 그룹 3, 4, 상대 습도 25 분 동안 55 %의 장소 동물.
- 이후, 전자 디지털 온도계를 이용하여 모든 군의 각 쥐 직장 온도를 측정한다. 4 시간 동안 실온에서 모든 동물을 놓습니다.
- 밀봉 마취 항아리 - (4 % 2)와 쥐 깊이 (발가락 핀치에 대한 응답의 부재) 마취 될 때까지 관찰 이소 플루 란과 쥐를 마취. 단두대와 빠른 잘린 쥐를 안락사.
- 혈청을 얻는 즉시 현미경 검사 용 피펫으로 혈액 샘플 (각 쥐에서 7 μl를) 데리고 apyrogenic 튜브에 apyrogenic 피펫과 - (16 ml의 15) 각각의 쥐 20에서 트렁크 혈액을 수집합니다.
- 응고 할 수 있도록 적어도 30 분 동안 냉장고에 혈액 튜브를 넣어. 20 O C에서 원심 분리기 튜브, 7,000 XG에 10 분 동안 빠르게피펫으로 혈청을 제거합니다. 분석 할 때까지 -20 ℃로 각각 50 μl의 볼륨에 쥐 저장소에서 얻은 나누어지는 혈청.
4. 수술
- 잘라 내기 / 전기 가위로 시체의 아래쪽 복부 및 흉부의 모든 모피 트림. 살균 캐비닛에 시체를 놓고 70 % 알코올로 시체의 면도 표면을 처리.
- 복부의 정중선 절개를 만들기 위해 멸균 메스를 사용합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 쥐에서 간, 장간막 림프절, 비장과 소장을 제거합니다.
세균 전좌 5. 분석
- 미리 무게 멸균 튜브에 간, 장간막 림프절, 비장의 각 샘플을 놓고 무게. 시료와 관의 무게와 빈 튜브의 중량 차이로 시료의 중량을 계산한다.
- 1:10 희석을 얻기 위해 튜브에 멸균 PBS를 추가 (w / v)의의 샘플 및 homoge균질 현탁액 (21)을 얻기 위해 멸균 유리 조직 균질 각 샘플 nize.
- 멸균 PBS에서 각 샘플의 일련 희석 (10-1 10-4)을 확인합니다. 접시 헤민 (0.005 g / L) 및 비타민 K1 (0.01 g / L) MacConkey 플레이트의 표면의 5 %의 혈액 한천 브루셀라 혈액 한천 상 각 조직의 모든 희석액 0.1ml를.
- 37 입출력 C 22 MacConkey의 5 %의 혈액 아가 플레이트 및 호기성 브루셀라 혈액 아가 플레이트 혐기성 조건에서 부화.
- 24 시간 후에 호기성 세균의 콜로니를 카운트하고, 배양 48 시간이 콜로니 계수기를 사용하여 후 혐기성 세균의 콜로니. 조직의 그램의 콜로니 형성 단위 (CFU)의 수와 그 결과를 표현한다.
6. 조직 학적 분석
- 수술에 의해 각각의 쥐에서 소장 샘플을 제거 (- 4.2 4.1 단계). 파라핀에 포함 Bouin의 정착액의 샘플을 수정헤 마톡 실린 및 에오신 표준 절차 (23)를 이용하여 6 μm의 섹션과 얼룩 섹션을 준비합니다.
- 각 샘플 (배율 100 배) 24 장 융모 총 점막 두께의 높이를 측정하는 고해상도 현미경 시스템을 사용한다. 각 쥐에서 4 샘플을 분석하고 각 샘플에 최소 20 측정을합니다. 마이크로 미터의 결과를 표현한다.
7. 사이토 카인 분석
- IL-1β 상업 쥐 ELISA 키트를 사용하여; IL-6; TNF-α; INF-γ 및 IL-10는 제조사의 프로토콜에 따라 혈청 사이토 카인의 수준을 측정한다.
- 관련 장비에 대한 표준을 사용하여 분석 시료의 각 세트에 대한 표준 곡선을 생성합니다. 적절한 표준 곡선과 실험 데이터를 비교하여 각 샘플에서 사이토 카인의 수준을 정의합니다.
8. 리포 폴리 사카 라이드 분석
- 래트에 따른 LPS ELISA 키트를 사용하여 혈청 LPS 레벨 분석제조 업체의 프로토콜입니다. 표준 곡선의 값으로 얻어진 값의 비교에 의해 샘플에서 LPS의 농도를 추정한다.
혈액의 9 고해상도 광학 현미경
- 이전 25, 26 설명 현미경 시스템을 사용합니다. 라이브 화상을 기록하는 현미경 시스템을위한베이스 및 비디오 카메라와 컴퓨터 (25) 등의 제진 플랫폼을 사용한다. 이전 27 바와 같은 리차드슨 슬라이드를 이용하여 테스트 영상을 보정한다.
- 유리 슬라이드, 커버 슬립, 사진의 각 쥐에서 갓 그린 혈액의 7 μl를 놓고 각 샘플 (확대 1,700X) 72 × 53.3 μm의 2 열 이미지 프레임을 기록합니다.
- 실시간으로 고해상도 직시 광학 이미지를 제공하는 소프트웨어를 사용하여 소포의 농도를 측정한다. 각 실험 조건 28 20 이미지 프레임의 최소를 검사합니다.
10 Statis틱
- 평균과 표준 편차 등의 모든 값을 표현한다. 통계 분석 및 그래프 플로팅을 수행합니다. 두 표본 t 검정으로 결과를 분석 통계적 유의성을 정의하는 0.05의 유의 수준을 설정한다.
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Representative Results
열 스트레스 후 바로 전에 동물의 체온의 평균은 각각 36.7 ± 0.07 입출력 C 및 40.3 ± 0.17 O C (P <0.05)이었다. 열 (그룹 3)로 쥐의 노출 융모 높이의 현저한 억제 및 점막 전체 두께의 결과 (도 2, 3 참조). 열 유해한 영향에서 스트레스 보호 소장 전에 BSB3 균주의 경구 투여.
장내 세균은 세균의 전위 장간막 림프절 분석 (MLN) 간 및 각 쥐의 비장에 의해 결정 하였다. 1.7 × 103 ± 4.6 × 10 2 CFU / g 조직 (그림 4)의 농도로 세균 배양 MLN에서만 고립 된 쥐의 간 (그룹 3) PBS로 사전 처리 및 열에 노출. 대조군에서 모든 테스트 샘플 (그룹 1, 2) 및 열 응력 동물BSB3 변형 (그룹 4) 멸균했다을 받았다. 어떤 세균은 비장 샘플로부터 분리되지 않았다.
IL-1β의 변화 없음; IL-6, TNF-α는, INF-Γ 사이토 카인 수준은 열 스트레스 래트에 등록 하였다. IL-10 및 LPS 수준의 열 노출 크게 상승하기 전에 PBS로 처리 된 동물의 혈청에서 발견되었다 (그룹 3) - (도 5,도 6). B.와 전처리 서브 틸리 BSB3 (그룹 4) 열 스트레스 동물의 혈청에서 IL-10와 LPS의 상승을 방지.
(1.4 ± 0.2)에서 무료로 소포 농도의 유의 한 증가 (3.8 ± 0.3)에 10 6 μL -1 10 6 소포를 × × (P <0.001)가 열 스트레스 전에 PBS를받은 쥐의 혈액에서 발견되었다 (그림 7 8). BSB3 전처리 동물의 그룹에서 자유 소포의 수의 변화는 후미 없었다어 열 노출 (그림 7).
그림 1. 연구 설계. 쥐의 두 그룹 (각 그룹에서 16 쥐) B.와 구강 투여에 의해 치료를 받았다 하루에 두번 BSB3 서브 틸리 스 (B. subtilis에 기) 또는 PBS로 (PBS 군). 3 일에 각 그룹은 각 그룹의 8 쥐에 의해 세분화했다. 그룹 3과 4에서 쥐는 25 분 동안 45 ℃로 넣었다. 대조군 (그룹 1, 2)을 실온에서 보관 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 장내 융모의 높이 (A)와 쥐의 점막 두께 (B)의 측정. 쥐가 PBS 또는으로 처리 사전B. 서브 틸리 BSB3 45 O C (스트레스) 또는 실온 (대조군)에 노출시켰다. 각 군은 8 마리의 래트로 구성되었다. 각 샘플의 각 매개 변수의 스물 측정을 수행 하였다. 값은 평균과 표준 편차로 표시됩니다. 결과는 통계적 유의성을 정의하는 유의 수준 0.05에서 두 개의 샘플 t-test로 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
헤 마톡 실린 및 에오신. 쥐와 장 점막 스테인드 그림 3. 조직 학적 이미지는 PBS 또는 B로 미리 처리 하였다 서브 틸리 BSB3 및 45 O를 C (스트레스) 또는 실온 (제어)에 노출 A. PBS / 아니오 스트레스;. B. PBS / 열 스트레스를, C. B. 서브 틸리 / 아니오 스트레스, D. B. 서브 틸리 / 열 스트레스. 융모 높이가 화살표로 표시된다. 200 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
쥐의 조직에서 박테리아의 그림 4. 총계는. 쥐 PBS 또는 B로 사전 처리 서브 틸리 BSB3 45 O C (스트레스) 또는 실온 (대조군)에 노출시켰다. 각 군은 8 마리의 래트로 구성되었다. 장간막 림프절, 간 및 비장을 무균 적 랫 균질화 제거하고 호기성 및 혐기성 세균을 복구 한천 배지 상에 플레이 팅 하였다. 전좌 세균 (호기성 및 혐기성)의 총 수는 조직의 그램 당 집락 형성 단위 (CFU)로 표시됩니다. 값은 다음과 같이 제시 평균과 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
쥐의 혈청에서 IL-10의 그림 5. 수준. 쥐가 PBS 또는 B로 처리 사전 서브 틸리 BSB3 45 O C (스트레스) 또는 실온 (대조군)에 노출시켰다. 각 군은 8 마리의 래트로 구성되었다. 혈청은 각 래트에서 얻은 시판 래트 ELISA 키트로 분석 하였다. 값은 평균과 표준 편차로 표시됩니다. 결과는 통계적 유의성을 정의하는 유의 수준 0.05에서 두 개의 샘플 t-test로 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
쥐의 혈청 그림 6. LPS 농도. 쥐가 PBS 또는 B로 처리 사전 서브 틸리 BSB3 45 O C (스트레스) 또는 실온 (대조군)에 노출시켰다. 각 군은 8 마리의 래트로 구성되었다. 혈청은 각 래트에서 얻은 시판 래트 ELISA 키트로 분석 하였다. 값은 평균과 표준 편차로 표시됩니다. 결과는 통계적 유의성을 정의하는 유의 수준 0.05에서 두 개의 샘플 t-test로 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
쥐의 혈액에서 소포 그림 7. 번호. 쥐 처리 사전PBS 또는 B와 서브 틸리 BSB3 45 O C (스트레스) 또는 실온 (대조군)에 노출시켰다. 신선하게 채혈의 작은 방울 (7 μL)를 각 샘플 (배율 1,700X)에 열 이미지 프레임을 유리 슬라이드 상에 배치 coverslipped, 촬영하고 기록 하였다. 소포의 농도를 실시간으로 고해상도 직시 광학 이미지를 제공하는 소프트웨어를 사용하여 측정 하였다. 스물 이미지 프레임은 각 실험 조건에 대해 조사 하였다. 값은 평균과 표준 편차로 표시됩니다. 결과는 통계적 유의성을 정의하는 유의 수준 0.05에서 두 개의 샘플 t-test로 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(가) 쉬게 그림 8. 증가열 스트레스 후 혈액의 세겔 농도. 실온 (A) 또는 (45) 오 C (B)에 노출하기 전에 PBS로 전처리 쥐의 혈액의 비디오 이미지입니다. 신선하게 채혈의 작은 방울 (7 μL)를 각 샘플 (배율 1,700X)에 열 이미지 프레임을 유리 슬라이드 상에 배치 coverslipped, 촬영하고 기록 하였다. 소포는 V. 바 6 μm의로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심각한 건강 상태 (29)에서, 고온에 노출 된 결과. 예방 및 열 스트레스와 관련된 합병증의 조기 발견은 매우 중요 (30)이다. 제시된 프로토콜은 열 스트레스 부작용 방지를위한 다양한 방식의 효능을 평가하는 데 사용될 수있다.
이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 다음과 같습니다 열처리 과정 (45 O C, 25 분); 수집 및 독소 오염을 방지하는 혈액 처리 중 apyrogenic 재료의 사용; 동결 융해를 반복을 피하기 위해 -20 ℃로 혈청 분취 량을 유지; 세균 전위의 분석에서 멸균 절차에 따라. 이 프로토콜은 열 스트레스의 부작용 방지를위한 박테리아와 쥐의 구강 치료를 위해 설립되었다. 관리 및 다른 화합물의 다른 경로의 경우,이 프로토콜은 수정 될 수 있습니다. TR의 예를 들면, 시간열 스트레스 전에 eatment은 확장 될 수있다. 경구 투여는 직장 투여로 변경 될 수있다. 고초균 박테리아가 고온에 노출하기 전에 동물을 경구 처리에 의한 열 응력 합병증의 예방을 위해 사용되었다. 열 응력의 합병증을 치료하기 위해,이 프로토콜은 열에 노출 된 후 동물의 치료 용 박테리아를 이용하여 수정 될 수있다.
이는 체온의 상승은 적혈구 수포의 증가를 야기하는 것이 도시되었으며, 이것은 완전히 B. 사전 처리에 의해 막혔다 서브 틸리 스 박테리아. 따라서, 열에 노출시 혈중 소포 농도의 증가는 열 스트레스의 레벨을 표시하고, 적혈구의 안정성 및 열에 대한 저항력 진단 증거를 제공 할 수있다. 또한 평가 열 스트레스 합병증에 대한 예방 치료 효과에 대해 아주 유용하고 신속한 테스트입니다. 유도 O열 스트레스의 마커로서 F 열 충격 단백질 30 이전 논의되었지만,이 방법은 시간 소모적이며, 열 스트레스에 대한 반응의 실시간 진단에 사용될 수 없다.
열 스트레스 부작용의 예방에 제시된 방법은 간단하고 비용 효과가 추가 장비 나 특별한 시설이 필요하지 않습니다. 이 작품의 미래 응용 프로그램이 보호를위한 새로운 절차를 열 스트레스 합병증에 대한 보호의 메커니즘을 이해하고 특성화하는 데 도움이 될 것입니다. 강렬한 야외 신체 활동 29시 열사병의 위험이있는 사람들의 그룹 -이 방법은 도로 노동자, 군인, 운동 선수에 대한 의미이다. 제안 된 방법은 하나의 열 스트레스의 정도를 조사하고, 극한 조건에서 작업하는 사람들의 건강을 보호하기 위해 다양한 방법을 평가할 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey agar plates | VWR | 470180-742 | |
| 5% blood agar plates | VWR | 89405-024 | |
| Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin’s Fixative | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Rat ELISA kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC4021 | |
| TNF-alpha Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC3011 | |
| Rat LPS ELISA Kit | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Environmental Chamber 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultra Centrifuge | |||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Colony counter | Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Freezer | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra microplate reader | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Rocking Shaker | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Video camera | Sony | ||
| Richardson test slide | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus software | Media Cybernetics, MD, USA | ||
| Triple Beam Balance | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Tissue Homogenizer, Dounce | VWR | 71000-518 |
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