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Bioengineering

Zebrafish लार्वा के प्रयोगात्मक हेरफेर में सुधार के लिए दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग डिवाइस

Published: October 27, 2017 doi: 10.3791/56340
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 4, 5,6, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 3Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 4Cellular and Molecular Pathology Graduate Program, University of Wisconsin-Madison, 5Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 6Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि zWEDGI (विकास और इमेजिंग के लिए zebrafish घायल और फंसाने वाली डिवाइस) का वर्णन करती है, जो zebrafish लार्वा को ओरिएंट और नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक compartmentalized डिवाइस है । डिजाइन पूंछ transection और घाव भरने और पुनर्जनन के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों के दीर्घकालिक संग्रह परमिट ।

Abstract

zebrafish लार्वा दोनों विकासात्मक जीवविज्ञान और घाव भरने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव है । इसके अलावा, zebrafish लार्वा सेलुलर संकल्प के साथ अंतरिक्ष और समय में गतिशील जैविक घटना के लाइव उच्च संकल्प सूक्ष्म इमेजिंग के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है । हालांकि, लाइव इमेजिंग के लिए agarose encapsulation के पारंपरिक विधि लार्वा विकास और ऊतक पुनर्विकास में बाधा कर सकते हैं । इसलिए, इस पांडुलिपि zWEDGI (zebrafish घायल और विकास और इमेजिंग के लिए डिवाइस फंसाने), जो डिजाइन और एक कार्यात्मक compartmentalized डिवाइस के रूप में गढ़े गए उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए ओरिएंट लार्वा की अनुमति का वर्णन caudal फिन डिवाइस और बाद में अनर्गल पूंछ विकास और फिर से विकास के भीतर transection । व्यवहार्यता बनाए रखते हुए यह डिवाइस घायल और दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । यह देखते हुए कि zWEDGI मोल्ड 3d प्रिंटेड है, इसके geometries की कस्टमाइज़ेशन विविध zebrafish इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए इसे आसानी से संशोधित कर देते हैं । इसके अलावा, zWEDGI कई लाभ प्रदान करता है, इस तरह के घावों के लिए प्रयोग के दौरान लार्वा के लिए उपयोग के रूप में या रिएजेंट के आवेदन के लिए, सुव्यवस्थित इमेजिंग के लिए एकाधिक लार्वा के समानांतर अभिविन्यास, और डिवाइस के पुनर्प्रयोज्य ।

Introduction

zebrafish लार्वा की अपक्षयी क्षमता ढाणियो rerio उन्हें घाव प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाने के साथ ही चिकित्सा और regrowth1,2,3,4. ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों और zebrafish के संरचनात्मक पारदर्शिता की एक सरणी के लिए उपयोग और आगे के रूप में अच्छी तरह से अब अवधि के अपक्षयी प्रक्रियाओं4के रूप में घाव प्रतिक्रिया घटनाओं के vivo अध्ययन में उनकी उपयोगिता को बढ़ाने । इन जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन उच्च संकल्प समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग इसलिए एक लाइव इमेजिंग zebrafish डिवाइस है कि उच्च स्थिरता और zebrafish लार्वा की न्यूनतम आंदोलन के लिए अनुमति देता है, जबकि व्यवहार्यता बनाए रखने की मांग । यह महत्वपूर्ण है कि डिवाइस प्रभावी घाव भरने के लिए अनुमति देता है, जबकि चिकित्सा और पुनर्जनन डिवाइस से अप्रभावित होते हैं ।

लाइव इमेजिंग के दौरान agarose में लार्वा को एंबेड करने की मानक लाइव इमेजिंग स्थिरीकरण विधि वृद्धि और घाव पुनर्जनन5 को प्रतिबंधित करता है और मृत्यु दरों में वृद्धि कर सकता है क्योंकि लार्वा चार के बाद हृदय तनाव और ऊतक परिगलन का संकेत दिखाना शुरू कर देते हैं । घंटे4. इसलिए, ब्याज के क्षेत्रों से agarose को हटाने अक्सर सामांय विकास और पुनर्जनन6की अनुमति के लिए आवश्यक है, agarose दूर काट रहा है के रूप में संभावित नुकसान के लिए लार्वा को उजागर । इसके अलावा, agarose एंबेडिंग तकनीक के साथ, उपयोगकर्ता कम समय में लार्वा ओरिएंट चाहिए पहले agarose जम5,6,7। तेजी से लार्वा हेर-फेर न केवल उपयोगकर्ता के कौशल की आवश्यकता है, यह भी लार्वा को नुकसान जोखिम । हालांकि लाइव इमेजिंग के लिए लार्वा को स्थिर करने के तरीके इन खामियों को दरकिनार करने के लिए वर्णित किया गया है, जैसे मेड़ आगर वेल्स3 या divets8, सिलिकॉन वैक्यूम तेल का उपयोग पीवीसी पाइपिंग या अन्य के साथ एक इमेजिंग चैंबर बनाने के लिए सामग्री6, और रोटेशन9टयूबिंग, इन तरीकों में से कई श्रम गहन, गन्दा, अक्सर गैर पुन: प्रयोज्य और पर्यावरण हेरफेर (नशीली दवाओं के उपचार, घायल आदिके लिए अनुमति नहीं है) के बाद मछली बढ़ गया है ।

इसलिए, zWEDGI डिवाइस (चित्र 1) zebrafish लार्वा की लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग के लिए बढ़ते हुए आगर की कमियों में से कुछ को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि नमूना हेरफेर की अनुमति । zWEDGI तीन अर्द्ध खुले compartmentalized कक्षों के होते हैं (चित्र 1a) लदान के लिए अनुमति देने के लिए, संयम, घायल और इमेजिंग 2 से 4 दिनों के बाद निषेचन zebrafish लार्वा. डिवाइस Polydimethylsiloxane (PDMS) से गढ़े और एक ६० mm ग्लास नीचे इमेजिंग डिश के कवर पर्ची पर रखा है । डिजाइन यहां प्रस्तुत घाव भरने के अध्ययन के लिए करना था, लेकिन एक मॉड्यूलर डिजाइन और मानक निर्माण प्रौद्योगिकियों के उपयोग zWEDGI डिजाइन संशोधित करने और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए उत्तरदायी, विशेष रूप से प्रक्रियाओं के लिए है कि प्रयोगात्मक हेरफेर और दीर्घकालिक इमेजिंग के साथ ंयूनतम संयम की आवश्यकता होती है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: आधार zWEDGI डिजाइन zebrafish लार्वा कि 2 से 4 दिनों के बाद निषेचन (dpf) के लिए तैयार किया गया था और विस्कॉंसिन-मैडिसन अनुसंधान पशु संसाधन केंद्र के विश्वविद्यालय के दिशानिर्देशों का पालन करें ।

< p class = "jove_title" > 1. मोल्ड्स की डिज़ाइन और 3d प्रिंटिंग

  1. model डिवाइस के PDMS घटक को एक 3d मॉडलिंग सॉफ्टवेयर में वांछित geometries और विशेषताओं के साथ < सुप क्लास = "xref" > 5 . एक खाली मोल्ड और PDMS भाग के एक विधानसभा बनाएं और PDSM भाग के लिए इसी मोल्ड में एक गुहा बनाने के द्वारा PDMS भाग के लिए एक नकारात्मक मोल्ड उत्पंन करते हैं । 3 डी मुद्रण के लिए एक. stl फ़ाइल के रूप में मोल्ड सहेजें (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ , स्टेप १.१).
    नोट: एक stereolithography प्रारूप (. stl) मोल्ड डिजाइन की फ़ाइल यहां प्रस्तुत (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) https://morgridge.org/designs/पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध है.
  2. प्रिंट मोल्ड्स एक photopolymer 3डी प्रिंटर (< मजबूत क्लास = "xfig" > फिगर 2 , स्टेप १.२) का उपयोग कर रहे हैं । यदि संभव हो तो एक एकल मुद्रण में कई molds बनाओ, तो एक से अधिक डिवाइस PDMS के एक बैच के साथ ढाला जा सकता है.
    नोट: दिखाया उदाहरण एक ०.०७५ मिमी बीम व्यास और ०.०५ मिमी परत मोटाई के साथ हाय-Res मोड में मुद्रित किया गया था, photopolymer राल का उपयोग < सुप वर्ग = "xref" > ५ .
    1. साफ एक स्प्रे बोतल में एक ठीक ब्रश, विकृत शराब का उपयोग कर molds, और संपीड़ित हवा धीरे से साफ़ करने के लिए और हटाने unपछाड़ने राल । microchannel क्षेत्रों से किसी भी सामग्री को निकालें.
    2. के बाद एक यूवी पोस्ट इलाज उपकरण में molds के लिए प्रत्येक पक्ष पर ६० मिनट के रूप में इलाज unzebrafish लार्वा को विषाक्त है < सुप वर्ग = "xref" > १० .
  3. रेत के साथ मोल्ड की गुहा पक्ष २०० एक समतल सतह पर सैड धैर्य जब तक सभी सीलिंग सतहों सैड (लोडिंग चैनल geometries और मोल्ड परिधि) के साथ संपर्क में हैं । छौंक ४०० और ६०० धैर्य रेत कागज के साथ रेत, उत्तरोत्तर, सभी ज्यामिति का सामना करना पड़ में चिकनी फ्लश सतहों का उत्पादन करने के लिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , चरण १.३) । यह डिजाइन गहराई के करीब है सत्यापित करने के लिए एक डायल संकेतक के साथ रेत देने के बाद गुहा की गहराई को मापने ।
    1. स्वच्छ मोल्ड्स और कवर डिस्क्स (1 & #190; इंच व्यास x & #188; इंच मोटा borosilicate ग्लास या एक्रिलिक; एक ग्लास प्रति मोल्ड कवर) एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में रखकर 30 मिनट के लिए पानी से भरा या रनिंग वॉटर के तहत फ्लश करके ।
      2. संपीड़ित हवा के साथ
    2. झटका सूखी और दोनों molds साफ और isopropyl शराब और फ़िल्टर संपीड़ित हवा के साथ कवर किया । हवाई मलबे से संदूषण को कम करने के लिए उपकरणों के निर्माण के लिए एक जगह के रूप में एक स्वच्छ पीठ का प्रयोग करें । साफ molds और कांच कवर साफ बेंच या एक कवर पेट्री डिश में जब तक जरूरत छोड़ दें ।
< p class = "jove_title" > 2. zWEDGI डिवाइस के PDMS निर्माण

  1. एक प्लास्टिक कप में 5:1 (उत्प्रेरक के लिए आधार) के अनुपात में १८४ सिलिकॉन PDMS elastomer (polydimethylsiloxane) डालने से PDMS बनाते हैं । एक लकड़ी के शिल्प छड़ी के साथ 2 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिश्रण, खुद पर पर जेल सरगर्मी, रोटी गूंध की तरह । 5 मोल्ड के लिए, बेस के 10 जी और उत्प्रेरक के 2 जी का उपयोग करें ।
    1. De-25-45 मिनट के लिए एक वैक्यूम desiccator में गैस मिश्रण जब तक सभी बुलबुले चले गए हैं ।
    2. एक 10mL सिरिंज का उपयोग PDMS के लगभग ०.७५ मिलीलीटर के साथ 3 डी मुद्रित molds के प्रत्येक की गुहा को भरने के लिए एक meniscus (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , चरण २.१) के साथ बह जाता है ।
    3. De-गैस ४५ मिनट के लिए भरे molds कि जब भरने के गठन हो सकता है अतिरिक्त बुलबुले को दूर करने के लिए ।
  2. PDMS-भरे मोल्ड के ऊपर एक ग्लास कवर डिस् क लागू करें, बबल को फंसे होने से रोकने के लिए एक कोण पर डिस् क नीचे दबाकर (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , Step २.२). कांच डिस्क कवर लागू किया जाता है के रूप में अतिरिक्त PDMS को निष्कासित करने की अनुमति दें ।
  3. छोटे शाफ़्ट दबाना का उपयोग करने के लिए मोल्ड को कसकर कवर डिस्क पकड़ो ।
    नोट: यह एक सपाट सतह बनाता है एक बार PDMS ठीक हो जाता है और जहां 3d मुद्रित geometries ग्लास कवर स्लिप के साथ फ्लश कर रहे है छेद के माध्यम से पैदा करता है । वैकल्पिक रूप से, एक समय में ठीक किया जा सकता जो डिवाइस की संख्या बढ़ाने के लिए, एक बहु-दबाना डिवाइस बनाएँ ( उदा . < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ , स्टेप २.३).
  4. PDMS डिवाइस में १०० o C पर clamped मोल्ड में ९० मिनट के लिए एक ओवन में (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , चरण २.४). ओवन से मोल्ड निकालें और जब तक वे आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । यदि clamping डिवाइस धातु है, मोल्ड को हटाने और दबाना से डिस्क विधानसभा कवर करने के लिए अवशिष्ट गर्मी के कारण PDMS इलाज जारी रखने से धातु को रोकने के ।
    नोट: डिवाइस अभी भी थोड़ा गर्म है और पूरी तरह से ठीक नहीं है, जबकि मोल्ड से हटाने के लिए सबसे आसान है. हालांकि, एक बार मोल्ड ओवन से हटा दिया जाता है और कवर डिस्क हटा दी जाती है, इस उपकरण को नए सांचे में लाने के लिए आगे बढ़ने से पहले कुछ दिनों के लिए बैठ सकते हैं । यदि डिवाइस शीघ्र ही इलाज ओवन से हटाने के बाद ढाला हुआ है, यह एक कवर पेट्री डिश में जगह के लिए यह पूरी तरह से इलाज करने की अनुमति जबकि दूषित पदार्थों को कम करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 3. प्लाज्मा-बांडिंग zWEDGI ग्लास डिश के लिए

  1. एक बेंच वाइस में PDMS डिवाइस युक्त मोल्ड दबाना ताकि मोल्ड & #39; s geometries अप, वर्किंग स्टेशन बेंच के समानांतर सामना कर रहे हैं ।
    1. फ्लैट इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग मोल्ड से PDMS पुल टैब जारी करके PDMS डिवाइस को दूर करने के लिए शुरू करते हैं । चिमटी के साथ मोल्ड की परिधि के आसपास काम (एक पैन से बाहर एक केक को हटाने की तरह (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , कदम ३.१)).
    2. फ़िल्टर संपीड़ित हवा और चिमटी का उपयोग धीरे पुल टैब पर पकड़ और डिवाइस के नीचे हवा उड़ाने से मोल्ड से बाहर डिवाइस खींचने के लिए । धीरे काम करते हैं, हवा मोल्ड से PDMS अलग मदद करने के लिए, पतली सुरंग वर्गों के आसपास चिमटी के सुझावों के साथ विशेष ध्यान लेने की अनुमति ।
  2. जगह PDMS डिवाइस उल्टा एक गिलास तली हुई डिश के कवर के अंदर पर इतना है कि निरोधक सुरंग कील प्लास्टिक छू रहे है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , कदम ३.२).
  3. जगह ऊपर से नीचे zWEDGI के साथ पकवान कवर और इसी गिलास भीतरी ऊपर की ओर का सामना करना पड़ ग्लास के साथ एक प्लाज्मा क्लीनर में तली हुई डिश (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , कदम ३.३) ।
    1. प्लाज्मा सफाई चैंबर खाली जब तक दबाव तक पहुंच ५०० mTorr.
    2. रेडियो फ्रीक्वेंसी (आरएफ) शक्ति उच्च करने के लिए सेट करें । डिवाइस और लगभग 2 मिनट के लिए आरएफ आवृत्ति के लिए पकवान बेनकाब धीरे de-चैंबर दबाव और एक साफ कमरे हुड के लिए उपकरण और पकवान वापस ।
  4. डिश कवर से PDMS डिवाइस को हटा दें । PDMS zWEDGI पर यह ध्यान से शीशे पर सही अभिविन्यास के लिए स्थिति से फ्लिप कांच नीचे पकवान के केंद्र पर अच्छी तरह से (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा २ , स्टेप ३.४)
    1. चिमटी के पीछे अंत का उपयोग कर, हल्के से PDMS पर नीचे प्रेस डिवाइस हवा बुलबुले के नीचे फंस नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए । माइक्रो चैनलों के मिनट geometries के आस-पास दबाव लागू करें और PDMS को किनारों से बाहर चिकना करे (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 5C ).
      नोट: PDMS और कांच के बीच पूरा संपर्क प्लाज्मा संबंधों से बेहतर पालन सुनिश्चित करता है । zWEDGI डिवाइस इस तरह के एक गिलास तली हुई 6-अच्छी तरह से बेनी के रूप में अन्य ग्लास तली हुई डिश प्रारूपों, पर बंधुआ हो सकता हैई (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ).
    2. साफ कमरे हुड से हटाने से पहले डिवाइस डिश पर एक कवर जगह है ।
      नोट: एक बार जब उपकरणों के लिए गिलास तय किया गया है, प्रोटोकॉल रोका जा सकता है जब तक वे उपयोग के लिए तैयार हैं ।
< p class = "jove_title" > 4. चैनल की तैयारी और लोडिंग लार्वा

< p class = "jove_content" > नोट: जनरल zebrafish पशुसंवर्धन zebrafish पुस्तक के प्रति आयोजित की गई, http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html पर ऑनलाइन उपलब्ध है. वयस्क zebrafish और भ्रूण पहले वर्णित के रूप में बनाए रखा गया < सुप वर्ग = "xref" > १ . वाइल्ड टाइप एबी तनाव का इस्तेमाल किया गया । इमेजिंग लाइव लार्वा के लिए आवश्यकताओं के संबंध में विशिष्टियों के लिए संस्था & #8217; एस एनिमल केयर प्रोटोकॉल का पालन करें ।

  1. के साथ चैनलों को कुल्ला करने से कम & #160; १०० & #181; L ७०% इथेनॉल निरोधक सुरंग के माध्यम से कुल्ला करने के लिए एक micropipette का उपयोग कर, चैनल प्रति । निकालें इथेनॉल और कुल्ला 2 या 3 बार डबल आसुत पानी के साथ । शुष्क हवा के लिए अनुमति दें ।
  2. स्किम दूध (1% पानी में पतला% की एकाग्रता) के साथ चैनलों को भरने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पकवान के गिलास coverslip करने के लिए लार्वा के पालन को कम करने के लिए । फिर, धीरे से कुल्ला करने के लिए डबल आसुत जल में डिवाइस कई बार जलमग्न । हवा शुष्क उल्टा करने की अनुमति दें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । zWEDGI डिवाइस के इस तैयारी का उपयोग करने के लिए कई दिन पहले किया जा सकता है । स्टोर कमरे के तापमान पर कवर किया ।
  3. तैयार 1% कम पिघलने बिंदु (LMP) agarose के संयोजन से १०० & #181; l 2% पिघला LMP agarose साथ १०० & #181; L 2x & #160; Tricaine (०.४ mg/एमएल Tricaine-एथिल 3-aminobenzoate) E3 बफ़र में < सुप वर्ग = "xref" > ११ प्री-वार्म टू ३८ हे ग. 1% बनाए रखें agarose/tricaine समाधान पर ३८ ओ सी एक गर्म ब्लॉक में तालमेल को रोकने के लिए.
    नोट: multiphoton माइक्रोस्कोपी के लिए < सुप वर्ग = "xref" > 11 , या तो अन-स्वर्णीय zebrafish वेरिएंट का उपयोग करें (जैसे कैस्पर < सुप क्लास = "xref" > 12 ) या वर्णक गठन को रोकने के लिए ०.२ mM N-phenylthiourea युक्त E3 में लार्वा बनाए रखना < सुप वर्ग = "xref" > ११ वर्णक द्वारा निकट अवरक्त तरंग दैर्ध्य के अवशोषण को कम करने के लिए.
    चेतावनी: N-phenylthiourea विषाक्त है । निपटान के लिए संस्था & #39; s नियम का पालन करें.
    4. e3 बफर में
  4. Anesthetize लार्वा जिसमें ०.२ मिलीग्राम/एमएल tricaine (tricaine/e3) < सुप क्लास = "xref" > ११ . लार्वा एक स्पर्श उत्तेजना के लिए स्थिर और गैर उत्तरदायी हैं जब तक रुको.
  5. पूर्व गीला Tricaine के कुछ microliters के साथ चैनल/
    1. एक व्यापक छिद्र पिपेट टिप का उपयोग कर एक एकल लार्वा उठाओ । लार्वा लोडिंग चैनल में जमा करना (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 3 ए ). एक पिपेट टिप या इसी तरह के उपकरण का उपयोग करना, इस तरह कि पृष्ठीय पक्ष लोडिंग चैंबर के स्ट्रेट एज चेहरे और पूंछ निरोधक सुरंग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ) की ओर चेहरे के लोडिंग चैंबर में लार्वा ओरिएंट ।
    2. ध्यान से जख्मी चैंबर से द्रव वापस लेने, लार्वा निरोधक सुरंग में प्रवाह करने के लिए अनुमति (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 सी ). लार्वा के आसपास नमी बनाए रखते हुए तरल के अधिकांश निकालें (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3d ). इस प्रक्रिया को थोड़ा घाव चैंबर की ओर झुकाव पकवान द्वारा सहायता प्राप्त कर सकते हैं ।
  6. जगह 1% LMP agarose में Tricaine/E3 (~ ३८ o C) पर लार्वा & #39; s head, filling चैंबर भरना (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > figure 3E ). agarose उचित स्थिति में लार्वा के साथ जमना के लिए अनुमति दें । Tricaine/E3 के रूप में निर्जलीकरण को बनाए रखने के लिए आवश्यक घाव चैंबर जोड़ें । शेष 2 चैनलों के लिए इस लोडिंग प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  7. एक सिरिंज सुई का उपयोग कर, ध्यान से किसी भी agarose कि जख्मी चैंबर में निरोधक सुरंग के माध्यम से रिसाव को दूर (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3F ). या तो बस agarose पर अतिरिक्त tricaine/E3 जोड़ें (घायल, अल्पावधि इमेजिंग, या घाव उपचार अलगाव के लिए) या संस्कृति पकवान भरने के लिए (दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए) । संस्कृति पकवान ढक्कन बदलें वाष्पीकरण को रोकने के लिए । लार्वा इस बिंदु पर imaged किया जा सकता है (जख्मी) या जख्मी ।
< p class = "jove_title" > 5. घायल और इमेजिंग लार्वा

  1. एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर, पूंछ फिन पीछे transect notochord < सुप वर्ग = "xref" > ११ जख्मी चेम्बर (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3जी , एच). अतिरिक्त tricaine/E3 जोड़ें यदि आवश्यक हो और संस्कृति पकवान ढक्कन की जगह ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, विकास के समय ब्याज की खिड़की के आधार पर, लार्वा, घाव हो सकता है की अनुमति दी E3 में ठीक करने के लिए और एक मशीन में बनाए रखा (२८.५ o C) वांछित इमेजिंग समय तक, पर जो बात वे चैनलों में लोड किया जा सकता है के रूप में ऊपर बताई गई.
  2. ६० mm ग्लास नीचे पकवान को समायोजित करेगा कि एक चरण डालने में एक औंधा माइक्रोस्कोप पर anesthetized लार्वा के साथ zWEDGI डिवाइस स्थापित करें । ऊपरी-सबसे चैनल में लार्वा की पूंछ का पता लगाएं, के रूप में वांछित स्थिति में पूंछ पाने के लिए आवश्यक पकवान घूर्णन । विशिष्ट प्रयोग के लिए आवश्यक के रूप में छवि ।
    नोट: zWEDGI widefield प्रतिदीप्ति और लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी सहित उच्च संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए मोटे तौर पर लागू है । इमेजिंग zebrafish लार्वा जब पैरामीटर विचार की एक संख्या हैं, लेकिन विशिष्ट इमेजिंग पैरामीटर साधन, नमूना और प्रयोग निर्भर हैं । यहां, लार्वा पूंछ एक कस्टम बिल्ड multiphoton माइक्रोस्कोप पर imaged था < सुप क्लास = "xref" > 5 , < सुप क्लास = "xref" > 11 निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग: 40X लंबे समय से काम कर रहे दूरी पानी विसर्जन उद्देश्य, ८९० एनएम लेजर उत्तेजना, 445/20 एनएम उत्सर्जन फ़िल्टर और ५१२ x ५१२ संकल्प.
< p class = "jove_title" > 6. प्रयोग का अंत

  1. माइक्रोस्कोप से zWEDGI पकवान हटा दें । zWEDGI को या तो बर्फ के पानी के स्नान पर या 4 हे सी पर रखकर लार्वा को Euthanize और दिल की धड़कन के अभाव के लिए आकलन करें ।
    नोट: क्योंकि लार्वा अलग डिब्बों में बनाए गए हैं, संदंश या पिपेट के साथ आगर पर धीरे से खींच कर लार्वा व्यक्तिगत रूप से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है । आगर सिर क्षेत्र और एंटीबॉडी धुंधला या आरएनए या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए संसाधित के लिए निर्धारण के रूप में अतिरिक्त प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया लार्वा से हटाया जा सकता है ।
  2. लार्वा और आगर को हटाने के बाद, इथेनॉल और आसुत जल के साथ zWEDGI को साफ करें, जैसा कि चरण ४.१ में वर्णित है और शुष्क हवा से उल्टा सेट किया गया है । स्टोर एक शांत, शुष्क स्थान में शामिल किया गया । पुनः स्किम दूध के साथ कोट (चरण ४.२) के रूप में अगले उपयोग करने के लिए पहले की जरूरत है ।
    नोट: zWEDGIs फिर से कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है, जब तक PDMS गिलास से दूर आना शुरू होता है ।

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Representative Results

zWEDGI PDMS microfluidic डिवाइस एक कार्यात्मक compartmentalized चार मुख्य कार्यों को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया डिवाइस है (नीचे सूचीबद्ध) caudal में उपचार और zebrafish लार्वा घाव भरने के लाइव इमेजिंग के साथ जुड़े. PDMS zWEDGI निर्माण के लिए चुना गया था क्योंकि यह न केवल आसानी से उपलब्ध है और एक उद्योग मानक के लिए है, लेकिन यह भी मोल्ड में अच्छी तरह से काम करता है । इसके अतिरिक्त, PDMS डिवाइस पुन: प्रयोज्य और हार्ड या तेज किनारों के शूंय एक बार डिवाइस बना है बनाता है । zWEDGI विशेष रूप से परमिट 1) लार्वा की लोडिंग डिवाइस में, 2) इमेजिंग के लिए उचित अभिविन्यास पर संयम, 3) caudal फिन के घायल, और 4) सूक्ष्म इमेजिंग, नीचे विस्तार से वर्णित.

लोड

zWEDGI डिजाइन 3 चैनलों के होते हैं, प्रत्येक एक लार्वा को नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया (चित्र 1b) । लोड हो रहा है और लार्वा के प्रारंभिक अभिविन्यास के लिए, खुला लोडिंग चैंबर 3 मिमी चौड़ा (आंकड़ा 1a) एक लार्वा जमा करने के लिए एक बड़े छिद्र पिपेट टिप को समायोजित करने के लिए है (चित्रा 3). इसके अलावा, लंबाई और चौड़ाई पर्याप्त कमरे को सही अभिविन्यास में लार्वा के बाद हेरफेर की अनुमति प्रदान करते हैं, निरोधक सुरंग और शीर्ष की ओर पृष्ठीय पक्ष की ओर पूंछ के साथ (चित्र बी).

संयम

एक बार लार्वा चैनल में लोड किया गया है, यह पूंछ तैयार किया जा सकता है-पहले निरोधक सुरंग में जख्मी कक्ष से द्रव को हटाने के द्वारा या धीरे से एक पिपेट टिप या इसी तरह के उपकरण के साथ जगह में नज (आंकड़ा 3सी). लोड हो रहा है चैंबर के कीप के आकार की ज्यामिति (चित्रा 1a), 3 मिमी से ०.४५ मिमी, के लिए वांछित पार्श्व अभिविन्यास में लार्वा गाइड (चित्र 3सी). इसके पक्ष पर लार्वा के उन्मुखीकरण में सुधार इमेजिंग के लिए पकवान के गिलास नीचे के साथ लगभग समानांतर में पूंछ नियंत्रित । सिलिकॉन वेफर्स का उपयोग कर बनाए गए microfluidic उपकरणों के विपरीत, 3डी प्रिंटेड मोल्ड्स की geometries की आवश्यकता z-दिशा में सुसंगत नहीं है । इसलिए, निरोधक सुरंग शामिल है और z-अक्ष में पतला ऐसी है कि प्रवेश ऊंचाई से बाहर निकलें से बड़ा है, ०.५ mm से ०.३ mm ऊंचाई (चित्र 1b, सुरंग के isometric देखें) । यह पतला लार्वा के मार्गदर्शन की सुविधा और कवर ग्लास इमेजिंग सतह की ओर पूंछ के समतल । इस कार्यशीलता को उपयोगकर्ता के लिए नमूना ओरिएंट जबकि agarose सख्त है की जरूरत समाप्त ।

द्रव लोड हो रहा है चैंबर से हटा दिया जाता है (चित्रा 3 डी) और कम पिघलने बिंदु agarose के साथ प्रतिस्थापित करने के लिए चैनल के भीतर सिर को स्थिर जबकि पूंछ जख्मी चैंबर में बफर में अनर्गल बनाए रखा है (चित्रा 3E) । निरोधक सुरंग के माध्यम से रिसाव हो सकता है कि न्यूनतम agarose आसानी से जख्मी चैंबर (चित्रा 3F) से हटाया जा सकता है. घायल चैंबर में agarose की कमी caudal फिन के अनर्गल पुनर्विकास और विकास के परमिट5।

जख्मी

एक बार लार्वा सुरंग के माध्यम से लोड किया गया है और agarose द्वारा नियंत्रित सिर, caudal फिन transection के लिए उपलब्ध है क्योंकि यह घायल कक्ष में बाहर juts । अर्द्ध चक्र घाव चैंबर क्षैतिज समरूपता से १.९ mm ऑफसेट है । यह स्केलपेल ब्लेड बस caudal फिन के ऊपर डाला जा करने के लिए अनुमति देता है, ब्लेड के लिए पर्याप्त जगह पूंछ भर में नीचे खींचा जा सकता है, transecting caudal फिन (चित्रा 3 जी) । 7 मिमी व्यास अर्द्ध चक्र के व्यापक भाग होता है, जहां पूंछ इस गति को समायोजित करने के लिए घायल हो जाता है । उपयोगकर्ता लार्वा घाव करने के लिए अनुमति देने के अलावा, इस compartmentalized डिजाइन पूंछ क्षेत्र के लिए यौगिकों के क्षेत्रीय आवेदन के लिए अवसर प्रदान करता है5. अर्द्ध अलगाव की इस अनूठी विशेषता विभिन्न दवाओं, रसायनों, या जैविक एजेंटों के घाव भरने की प्रक्रिया पर प्रभाव के स्थानीयकृत परीक्षण के लिए अनुमति देगा ।

इमेजिंग

zWEDGI डिवाइस का लक्ष्य zebrafish caudal फिन के उच्च संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, agarose embedding द्वारा बेरोक की अनुमति देने के लिए है । इस कारण से, PDMS डिवाइस एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गिलास नीचे पकवान के लिए बंधुआ है, सूक्ष्म उच्च ना लेंस का उपयोग कर के लिए एक ऑप्टिकल गुणवत्ता की सतह प्रदान करने के लिए । यहाँ हम वर्तमान multiphoton माइक्रोस्कोपी के लिए दूसरी हार्मोनिक (स्वसहायता) इमेजिंग caudal फिन में कोलेजन फाइबर का उपयोग करने के लिए zWEDGI के इमेजिंग क्षमताओं को वर्णन छवियों. हालांकि, zWEDGI ऐसे फोकल माइक्रोस्कोप के रूप में अन्य प्रकाश सूक्ष्म तरीके, करने के लिए लागू किया जा सकता, एक औंधा माइक्रोस्कोप चरण विन्यास का उपयोग. zWEDGI के साथ, बाद में हटाने के साथ embedding agarose की विधि के विपरीत, caudal फिन आसानी से डिवाइस में घायल करने से पहले छवि में किया जा सकता है (चित्रा 4a), डिवाइस के भीतर घायल, तो तुरंत बाद घाव के लिए माइक्रोस्कोप को लौट इमेजिंग (चित्रा 4B-ई) । पिछले काम घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान कोलेजन फाइबर संगठन में परिवर्तन की पहचान की स्वसहायता समूहों का उपयोग । 13 स्वसहायता समूहों fibrillar कोलेजन सहित आदेश दिया संरचनाओं के कुछ प्रकार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, exogenous लेबल के उपयोग के बिना । 14 zWEDGI में imaged रहने वाले caudal पंख की छवि गुणवत्ता है कि निश्चित ऊतक में प्राप्त करने के समान था5 लेकिन zWEDGI लाभ के एक नंबर प्रदान करता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, caudal फिन हीलिंग और regrowth लार्वा के साथ agarose embedding द्वारा रुकावट आगे बढ़ना कर सकते है कि लार्वा के लिए इसी तरह हो अनर्गल5। इसके अलावा, क्योंकि घाव का प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि लार्वा डिवाइस में है, पूर्व और बाद में घायल छवियों को एक ही caudal फिन (चित्र 4a) पर एकत्र किया जा सकता है । zWEDGI समय के साथ 3 आयामी डेटा के संग्रह परमिट, गतिशील extracellular मैट्रिक्स (चित्रा 4B) की संरचना में होने वाले परिवर्तनों का एक और पूरा दृश्य उपलब्ध कराने के. यहां सचित्र स्वसहायता समूहों फाइबर घाव छूट है, 3 आयामों में, zWEDGI के भीतर घायल निंनलिखित । घायल करने से पहले, स्वसहायता समूहों का पता लगाया कोलेजन फाइबर notochord से फिन टिप को विकीर्ण, (चित्र 4a) । शीघ्र ही करार फिन की नोक और वें के केंद्र के बीच की दूरी को घायल करने के बादई पंख घाव छूट के साथ बढ़ जाती है । डेटा संग्रह की 3 डी प्रकृति स्थानिक पुनर्निर्माण अनुमति देता है, जैसे Imaris सॉफ्टवेयर प्रतिपादन का उपयोग कर । ये पुनर्निर्माण, और बाद के रोटेशन विकल्प, संकुचन और फिन की छूट वर्णन छवि संग्रह के एक्स वाई विमान में न केवल (चित्रा 4 बी, सी, डी), लेकिन यह भी जेड अक्ष में (चित्रा 4 में होता है G-J, L-O, Q-T; पूरक फिल्में 1, 2) पूंछ के रूप में अनुबंधित राज्य के ऊपर कर्ल से समतल । zWEDGI अब समय अवधियों पर अंय इमेजिंग विधियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे फोकल माइक्रोस्कोपी के उपयोग के रूप में छवि ंयूरॉंस के लिए 24 ज5से अधिक caudal फिन विकास । क्योंकि डिवाइस निरोधक इकाइयों समानांतर लाइन में खड़ा कर रहे हैं, इस प्रकार की जरूरत को नष्ट करने के लिए डिवाइस जब लार्वा का पता लगाने, माइक्रोस्कोप की स्थापना और इमेजिंग के लिए कई नमूना के बीच चलती सीधा है और स्वचालित इकट्ठा करने के लिए किया जा सकता कई लार्वा की समय-चूक छवि डेटा । नमूनों की संख्या का विस्तार करने के लिए जो imaged किया जा सकता है, PDMS zWEDGI डिवाइस को अन्य ग्लास बॉटम फार्मेट में रखा जा सकता है, जैसे कि 6-वेल प्लेट (figure 2c) ।

Figure 1
चित्र 1 : अंतिम डिजाइन योजनाबद्ध (एक) योजनाबद्ध सामांय लेआउट और zWEDGI डिवाइस की माप दिखा रहा है, कार्यात्मक compartmentalized कक्षों की शब्दावली पर प्रकाश डाला । (ख) PDMS उपकरण के Isometric दृश्य के रूप में मोल्ड से हटा दिया । (ग) इनसेट सुरंग से पता चलता है, प्रवेश और निकास ऊंचाइयों में परिवर्तन पर प्रकाश डाला । (घ) उपकरण में रोका लार्वा का मॉडल. Zebrafish जर्नल से पुनर्मुद्रण अनुमति के साथ पहले प्रकाशित करें आलेख5 से संशोधित चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : निर्माण योजनाबद्ध (A) चरण 1 3 डी मॉडलिंग सॉफ्टवेयर (१.१) जो तो 3 डी मुद्रित (१.२) है में डिवाइस मोल्ड के डिजाइन के साथ शुरू होता है । मोल्ड्स यूवी लाइट ठीक कर रहे है और फिर रेत से भरा है और तो उठाया geometries भी ऊंचाई (१.३) है साफ । चरण 2 मिश्रित और degassed PDMS (२.१) के साथ molds भरना शामिल है और एक तिरछा पर मोल्ड पर एक गिलास डिस्क लागू करने के लिए उपकरण PDMS (२.२) में हवा के बुलबुले फँसाने को रोकने के । ग्लास और मोल्ड एक साथ clamped है (२.३) में एक ओवन में इलाज के लिए १००oC के लिए एक घंटे (२.४) । चरण 3 फ़िल्टर हवा और फ्लैट इत्तला दे दी चिमटी मोल्ड (३.१) से PDMS डिवाइस को दूर करने के लिए उपयोग करता है । डिवाइस तो इमेजिंग डिश ढक्कन (३.२) के शीर्ष पर रखा गया है और प्लाज्मा इलाज (३.३), ग्लास नीचे के साथ है, PDMS के लिए कांच के नीचे पकवान (३.४) का पालन करने की अनुमति है । (ख) समाप्त zWEDGI डिवाइस एक गिलास नीचे पकवान में बंधुआ और इमेजिंग उपयोग के लिए तैयार है । (ग) एकाधिक zWEDGI उपकरणों एक ही प्रयोग में कई लार्वा छवि के क्रम में एक गिलास नीचे 6 अच्छी तरह से थाली में रखा जा सकता है । Zebrafish जर्नल से पुनर्मुद्रण अनुमति के साथ पहले प्रकाशित करें आलेख5 से संशोधित चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : लोड हो रहा है और zWEDGI में लार्वा के घाव (एक) एक लार्वा लोड हो रहा है एक व्यापक छिद्र पिपेट का उपयोग कर चैंबर में भरी हुई है । (ख) लार्वा पृष्ठीय पक्ष के साथ लोडिंग चैंबर कीप और निरोधक सुरंग की ओर पूंछ के फ्लैट हिस्से के खिलाफ उन्मुख है. (ग) जख्मी कक्ष के प्रवेश द्वार पर आयोजित पिपेट टिप से सक्शन का उपयोग करना, लार्वा सुरंग में खींचा जाता है, इसे इमेजिंग के लिए उचित अभिविन्यास में रखकर । (घ) द्रव लोड हो रहा है चैंबर से हटा दिया जाता है के लिए अनुमति देने के लिए (ङ) सिर क्षेत्र के आसपास agarose के अलावा लार्वा को स्थिर करने के लिए । Agarose लाल रंग है यहां प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए ही । जख्मी चैंबर में मिनिमल agarose लीक और आसानी से हटाया जा सकता है के रूप में दिखाया गया है (F). (छ) घाव करने के लिए एक बार लार्वा चैनल में रोका जाता है, एक स्केलपेल ब्लेड लार्वा के ऊपर डाला जाता है और caudal फिन के पार कटा हुआ, notochord के पीछे । (एच) लार्वा अब पोस्ट-घाव इमेजिंग के लिए तैयार है । स्केल बार (A-H) = 1 mm; स्केल बार (F) = 1 mm; स्केल बार (G) = 1 मिमी. Zebrafish जर्नल से पुनर्मुद्रण अनुमति के साथ पहले प्रकाशित करें आलेख5 से संशोधित चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : 3 डी multiphoton समय चूक zebrafish caudal फिन में स्वसहायता तंतुओं की इमेजिंग, पूर्व और बाद घायल, zWEDGI में । zWEDGI डिजाइन उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए की क्षमता प्रदान करता है, स्वसहायता समूहों फाइबर संगठन पूर्ववर्ती (पूर्व घाव) और निंनलिखित caudal फिन transection (के बाद घाव) के इस मामले में । 4 मिनट के अंतराल पर डेटा z-स्टैक्स के रूप में एकत्र किया गया था । (A-E) caudal फिन में तंतुओं के स्वसहायता के एक प्रक्षेपण के रूप में z-पोट, से पहले और चार अंतराल के बाद transection पर दिखाता है । Z-प्रक्षेपण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था । 15 टी = 0 इमेजिंग की शुरुआत थी, लगभग 20 मिनट के बाद transection । दोहरे तीर घाव बढ़त की नोक की दूरी में वृद्धि का संकेत (छोटी सफेद रेखा) प्रारंभिक संकुचन के बाद घाव की छूट के दौरान notochord (लंबी सफेद रेखा) के स्थान के सापेक्ष । (F-J)। मूल डेटा के 3 डी पुनर्निर्माण झुका । (K-O)। झुका हुआ 3d पुनर्निर्माण के भूतल प्रतिपादन एफ जे में दिखाया गया है । (पी टी). 3 डी पुनर्निर्माण सतह प्रतिपादन की ओर विचार, चित्रण कैसे संकुचन और छूट 3 आयामी अंतरिक्ष में होते हैं, जो इस zWEDGI का उपयोग कर एकत्र डेटा के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है, जहां caudal फिन agarose द्वारा विवश नहीं है । स्केल बार (A-E) = १०० माइक्रोन; स्केल बार (F-T) =१०० माइक्रोन । 3d रेंडरिंग इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया था । पूरक फिल्में भी देखें 1 और 2. Zebrafish जर्नल से पुनर्मुद्रण अनुमति के साथ पहले प्रकाशित करें आलेख5 से संशोधित चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : zWEDGI निर्माण के महत्वपूर्ण कदम (क) कोई बुलबुले के रूप में सुनिश्चित करने के लिए या डिवाइस में फंस जब ग्लास डिस्क पर clamping, degas के बाद PDMS मोल्ड में भर दिया गया है और जब यह मोल्ड में PDMS के लिए आवेदन clamping गिलास तिरछा । इसके अलावा, लोड हो रहा है और घायल कक्षों पर "चमकती" से PDMS को रोकने के लिए, अच्छी तरह से geometries की सतहों को सुनिश्चित करने के लिए डिवाइस के ऊपर रेत के लिए सुनिश्चित करें कि फ्लश जब कांच पर clamping कर रहे हैं । (B) जब डिवाइस ओवन में पर्याप् त रूप से ठीक हो जाता है, तो PDMS और मोल्ड के बीच हवा की जेब यह संकेत देती है कि डिवाइस को निकालना आसान हो जाएगा । डिवाइस आसानी से दूर नहीं करता है, तो यह अपर्याप्त इलाज समय या तापमान या मोल्ड ही पर्याप्त रूप से यूवी ठीक नहीं था, PDMS के अवशिष्ट राल दूषण में जिसके परिणामस्वरूप के कारण होने की संभावना है । (ग) जब प्लाज्मा उपचार के बाद ग्लास नीचे पकवान के लिए डिवाइस आवेदन, चिमटी के पीछे अंत के साथ प्रकाश दबाव लागू करते हैं, सुरंग क्षेत्रों में शुरू करने और जावक डिवाइस के किनारे की ओर काम कर रहे । यदि डिवाइस अच्छी तरह से बंधन नहीं है, के रूप में डिवाइस और कांच के बीच हवा की जेब से संकेत दिया, प्लाज्मा बंधन में समय की मात्रा को लंबा और यह सुनिश्चित करें कि PDMS और कांच की सतह के बीच कोई धूल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
पूरक फिल्म 1: caudal फिन में multiphoton समय चूक की छवियों के दौरान विश्राम के बाद घाव भरने के लिए 3 डी की सतह प्रतिपादन । caudal पंख में तंतुओं के स्वसहायता समूहों के घाव भरने के बाद समय के साथ zstacks के रूप में imaged (फिल्म के शुरू में घाव के बाद लगभग 20 मिनट है) zWEDGI में । Z-स्टैक को खंगाला गया और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सरफ़ेस प्रदान किया गया । पूंछ को तीन आयामी दिखाने झुका । पूर्वकाल को छोड़ दिया है । चलचित्र चित्रा 4 (K-O) में अभी भी छवियां से मेल खाती है । स्केल बार = ५० माइक्रोन । फिल्म डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 2
पूरक फिल्म 2: की ओर देखने के 3d सतह प्रतिपादन multiphoton समय चूक की छवियों caudal फिन में स्वसहायता तंतुओं की छूट के बाद जख्म । caudal पंख में तंतुओं के स्वसहायता समूहों के घाव भरने के बाद समय के साथ zstacks के रूप में imaged (फिल्म के शुरू में घाव के बाद लगभग 20 मिनट है) zWEDGI में । Z-स्टैक को खंगाला गया और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सरफ़ेस प्रदान किया गया । साइड देखने के लिए z-अक्ष में गतिशील परिवर्तन के कब्जे पर जोर दिखाया । पूर्वकाल को छोड़ दिया है । फिल्म चित्रा 4 (पी टी) में अभी भी छवियों से मेल खाती है । स्केल बार = ४० माइक्रोन । फिल्म डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

zWEDGI डिवाइस का उद्देश्य स्थिर और एक उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप उद्देश्य के छोटे से काम दूरी के भीतर मछली ओरिएंट द्वारा 3 डी समय चूक इमेजिंग पर कब्जा करने के लिए है । इन डिजाइन विनिर्देशों की बैठक के दौरान, यह भी लाइव इमेजिंग के लिए पारंपरिक आगार आधारित तैयारी पर एक सुधार है । वहां तीन महत्वपूर्ण कदम (नीचे) zWEDGI के निर्माण में हैं, जो, अगर सही ढंग से नहीं किया, दोषपूर्ण उपकरणों में परिणाम कर सकते हैं:

PDMS तैयारी (चित्र 5 ए)

बुलबुले को रोकने के लिए, degas मोल्ड्स के बाद PDMS जोड़ा गया है । जांच करें कि सभी बुलबुले degassing के बाद समाप्त किया गया है और कांच डिस्क के आवेदन करने के लिए सावधान ध्यान देना । कांच डिस्क एक तिरछा पर लागू किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि हवा के नीचे और PDMS के भीतर फंस नहीं किया जा रहा है । धूल प्रक्रिया के अधिकांश चरणों के दौरान एक समस्या हो सकती है । धूल को रोकने के लिए, प्रत्येक सफाई कदम अच्छी तरह से पूरा करने और कदम के बीच एक साफ हुड में भागों की दुकान । अतिरिक्त राल है कि एक किसी न किसी सतह यूवी इलाज करने से पहले बना सकते है के लिए molds की जांच करें । जब रेत, सुनिश्चित करें कि रेत कागज संपर्क सभी geometries सुनिश्चित करने के लिए कि सभी सतहों फ्लश कर रहे है (चित्रा 2, चरण १.३) । हमेशा isopropyl शराब और PDMS के साथ मोल्ड भरने से पहले सही हवा के साथ साफ । जब मोल्ड से बाहर अतिरिक्त PDMS निचोड़, सुनिश्चित clamps कसकर मोल्ड और ग्लास कवर एक साथ पकड़ (चित्रा 2, चरण २.३) ।

मोल्ड से डिवाइस निकालना (चित्रा 5B)

सुनिश्चित करें कि ओवन कम से १०० है हे सी और इलाज के समय कम से कम 1-१.५ ज है । यदि PDMS पर्याप्त रूप से ठीक न हो तो मोल्ड से निकालना मुश्किल हो सकता है । को दूर करने में विफलता के लिए अंय संभावनाओं PDMS रिएजेंट लंबे समय पर्याप्त मिश्रण शामिल नहीं है, आधार और कठोर या बचे हुए राल के गलत अनुपात का उपयोग कर 3 डी मुद्रण के बाद मोल्ड में शेष है जो तो PDMS दूषित । ओवन से हटाने पर, डिवाइस और मोल्ड (चित्रा 5B) के बीच हवा की जेब से संकेत मिलता है कि डिवाइस आसानी से निकाल दिया जाएगा ।

ग्लास-बॉटम्ड डिश (figure 5C) के लिए PDMS का पालन

कांच डिश के लिए गरीब पालन धूल, ग़लत संरेखण, या प्लाज्मा उपचार के अपर्याप्त लंबाई से परिणाम हो सकता है । जब कांच पर डिवाइस रखकर, एक कोण पर पकवान टिप और ग्लास सर्कल पर PDMS केंद्र यकीन है कि यह अच्छी तरह के किनारों को छूने नहीं है बना । डिवाइस का पालन नहीं करता है, तो ध्यान से चिमटी के पीछे के अंत के साथ कांच पर्ची पर डिवाइस प्रेस, नाजुक सुरंग क्षेत्र में शुरू और किनारों के लिए जावक दबाकर । डिवाइस अभी भी पालन नहीं करता है, तो एक मिनट की वृद्धि में प्लाज्मा क्लीनर में समय बढ़ाने के द्वारा प्रयोग.

जबकि लार्वा, आगर के उपयोग के बिना समय (मिनट) के संक्षिप्त अवधि के लिए डिवाइस में imaged किया जा सकता है, लंबी अवधि के लाइव-इमेजिंग caudal फिन क्षेत्र के प्रयोजन के लिए, आगर लोडिंग चैंबर में सिर पर रखा गया है के बाद मछली लोड किया गया है । हालांकि आगर के इस आवेदन में घाव भरने प्रतिक्रिया या लार्वा की व्यवहार्यता को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है5, यह लार्वा के और अधिक पूर्वकाल क्षेत्रों के अध्ययन को प्रभावित कर सकता है । हालांकि हम करने के लिए ६० घंटे के लिए छवि लार्वा करने में सक्षम है हम जांच नहीं किया है कि व्यवहार्यता अब इमेजिंग समय के साथ प्रभावित किया जाएगा । इसके अतिरिक्त, विशेष रूप से डिजाइन यहां प्रस्तुत की उंर 2 से 4 दिनों के बाद निषेचन (dpf) पूंछ transection और घाव हीलिंग इमेजिंग के लिए उनके पक्ष पर झूठ बोल लार्वा के लिए अनुकूलित किया गया था । अंय विकास के चरणों, झुकाव और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल डिजाइन करने के लिए परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, डिजाइन की जानबूझकर कार्यात्मक मॉड्यूलर बनाता है यह आसानी से ऐसे परिवर्तन के लिए उत्तरदाई ।

इसके अलावा, इस उपकरण का निर्माण एक 3 डी प्रिंटर और अंय microfluidic सामग्री और ऐसे PDMS और एक प्लाज्मा क्लीनर के रूप में उपकरण, के लिए उपयोग की आवश्यकता है, संभावित कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए डिवाइस की पहुंच सीमित । हालांकि, मोल्ड निर्माण के इस विधि 3 डी मुद्रण क्षमताओं के बाद से चुना गया था, microfluidics निर्माण के साथ, अकादमिक परिसरों पर अधिक प्रचलित होते जा रहे हैं । इसके अतिरिक्त, वहां 3 डी मुद्रण के लिए सेवा प्रदाताओं उपलब्ध हैं, के रूप में प्रौद्योगिकी तेजी से विकसित और प्रिंटर की लागत कम हो जाती है ।

अपने compartmentalized डिजाइन और कार्यशीलता को देखते हुए, zWEDGI समय चूक छवि संग्रह के लिए वर्तमान तकनीक पर सुधार प्रदान करता है का उपयोग करते हुए आगर एंबेडिंग । सबसे पहले, agarose zWEDGI में पूंछ क्षेत्र घेर नहीं है, घाव भरने और पुनर्जनन प्रगति करने के लिए अनुमति, जबकि zWEDGI में लार्वा की उत्तरजीविता एम्बेडेड और unएम्बेडेड नियंत्रण के लिए तुलनीय है5. दूसरे, उच्च संकल्प 3 डी मुद्रण के उपयोग के लिए molds बनाना zWEDGI अद्वितीय ढलान geometries को इमेजिंग विमान के संबंध में तीन आयामों में लार्वा ओरिएंट है की अनुमति देता है । यह आगर सख्ती के रूप में एक उचित अभिविन्यास करने के लिए लार्वा जोड़ तोड़ की समय निर्भरता को हटा. zWEDGI डिजाइन का एक तीसरा महत्वपूर्ण लाभ खुला चैंबर डिजाइन कि पूंछ और प्रमुख क्षेत्रों परमिट प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए सुलभ हो रहा है । यह घाव भरने के अध्ययन के लिए विशिष्ट ब्याज की है, लेकिन यह भी zWEDGI अंय जोड़तोड़ के लिए एक संभावित उपयोगी उपकरण बनाता है । उपकरण के कंपार्टमेंट डिजाइन, इसके अलावा, प्रयोग के दौरान यौगिकों के क्षेत्रीय आवेदन के लिए अवसर प्रदान करता है । उपकरण अर्द्ध क्योंकि बफर के प्रसार अंतर की पूंछ से सिर अलग (घायल कक्ष में) और agarose (लोडिंग चैंबर में)5, यौगिकों के आवेदन की अनुमति है जबकि घाव भरने का अध्ययन या अन्य जैविक प्रक्रियाओं. इसके अलावा, क्योंकि लार्वा अलग चैनल में बढ़ रहे हैं, व्यक्तिगत लार्वा की पहचान की जा सकती है और आरएनए या प्रोटीन शुद्धि या एंटीबॉडी लेबलिंग जैसे अतिरिक्त प्रोसेसिंग के लिए पोस्ट-इमेजिंग प्राप्त कर सकते हैं । और अंत में, क्योंकि डिवाइस PDMS से बना है कि कांच तली हुई डिश के लिए बंधुआ गया है, एक बार लार्वा हटा दिया गया है डिवाइस पुन: प्रयोज्य है ।

आगे बढ़ने में, मॉड्यूलर डिजाइन और zWEDGI के निर्माण में आसानी बदल कार्यशीलता के लिए संशोधन के लिए ही अच्छी तरह से उधार दे देंगे । वर्तमान में, कंपार्टमेंट geometries विशेष रूप से घायल और इमेजिंग प्रयोगों के लिए बनाया जाता है, यह घाव भरने की लाइव इमेजिंग के लिए व्यापक आवेदन दे रही है । हालांकि, लार्वा कांच पर सीधे ही होता है, जैसे कि कोई सामग्री (यानी PDMS), जो इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, लार्वा और इमेजिंग सतह के बीच मौजूद है । इसलिए, लार्वा के अन्य क्षेत्रों, जैसे ट्रंक, would इमेजिंग के लिए सुलभ हो । इसके अलावा, zWEDGI के 3 डी मुद्रित मोल्ड के डिजाइन को आसानी से अंय विकास चरणों, लार्वा और विभिंन उपचार के विभिंन झुकाव को समायोजित संशोधित किया जा सकता है । ये गुण इसलिए समय तराजू की एक किस्म से अधिक घटनाओं की समय चूक माइक्रोस्कोपी पर कब्जा करने के लिए यह एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाते हैं । अंय ग्लास नीचे पकवान स्वरूपों का उपयोग अधिक चैनलों के लिए बड़ा PDMS उपकरणों और अंतरिक्ष के लिए अनुमति दे सकता है । 3 डी मुद्रण निर्माण तकनीक और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक किस्म के लिए संशोधन के बाद आसानी के लिए बढ़ती पहुंच को देखते हुए, zWEDGI उच्च संकल्प लाइव इमेजिंग माइक्रोस्कोपी के दायरे में एक शक्तिशाली उपकरण साबित हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक अनुसंधान के लिए Morgridge संस्थान और ऑप्टिकल और अभिकलनी इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए प्रयोगशाला से प्राथमिक परियोजना धन स्वीकार करना चाहते हैं । हम भी NIH # R01GM102924 (आह और KWE) से धन स्वीकार करते हैं । KH, JMS, रू, आह और KWE की कल्पना की और अध्ययन डिजाइन किया । KH और JMS ने डीएल, केपी और आरएसी से समर्थन के साथ सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया । KH, जे एस, आरएस, आह और KWE ने पांडुलिपि के लेखन में योगदान दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software Dassault Systemes SPX0117-01 Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer 3D Systems Inc. 23200-902 3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin 3D Systems Inc. 24075-902 3D Systems Inc.
denatured alcohol Sunnyside 5613735 Menards
UV post cure apparatus 3D Systems Inc. 23363-101-00 3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves Ansell 92-600 McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper  Norton 66261139359, 54, 52 MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter McMaster-Carr MIL-G-47033 McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner Branson 1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70% Hydrox 54845T43 McMaster-Carr
10oz clear plastic cup WNA Masterpiece 557405 Amazon
6"craft stick Perfect Stix Craft WTD-500 Amazon
Name Company Catalog Number Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit  Dow-Corning 4019862 Ellworth Adhesives 
10mL syringe Becton Dickinson 305219 Vitality Medical Inc
desiccator Bel-Art Scienceware F42027-0000 Amazon
4 in ratcheting bar clamp Pittsburgh 68974 Harbor Freight
lab oven Quincy Lab Inc. 20GC Global Industrial
tweezer set Aven 549825 McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle Innotech TA-N2-2000FT Cleanroom Supply
vacuum bench vise Wilton Tool Group 63500 MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D60-30-1.5-N Cellvis
plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 Harrick Plasma
Name Company Catalog Number Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200 Gilson F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) Pharmco-aaper 111000200
Transfer pipette Fisherbrand 13-711-5A Fisher Scientific
powdered skim milk 2902887 MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea Sigma-Aldrich P7629 Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) C-FINQ-UE Western Chemical
low melting point agarose Sigma-Aldrich A0701 Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator) Fisher Scientific 11-718-2 Fisher Scientific
E3 buffer 
large orifice pipette tip, 200 uL Fisherbrand 02-707-134 Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL Fisherbrand 21-197-8E Fisher Scientific
#15 scalpel blade  Feather 2976 Amazon
25G syringe needle BD  BD305122 Fisher Scientific
Name Company Catalog Number Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software Bitplane

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References

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इंजीनियरिंग अंक १२८ घाव भरने zebrafish multiphoton माइक्रोस्कोपी संयम डिवाइस लार्वा दीर्घकालिक इमेजिंग
Zebrafish लार्वा के प्रयोगात्मक हेरफेर में सुधार के लिए दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग डिवाइस
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Huemer, K., Squirrell, J. M.,… More

Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., Pelkey, K., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (128), e56340, doi:10.3791/56340 (2017).

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