Summary
Dette manuskript beskriver zWEDGI (zebrafisk Wounding og Entrapment enhed for vækst og Imaging), som er en opdelte enhed designet til at orientere og begrænse zebrafisk larver. Design tillader hale transection og langsigtede samling af høj opløsning fluorescerende mikroskopi billeder af sårheling og regenerering.
Abstract
Zebrafisk larve er en vigtig model organisme for både udviklingsmæssige biologi og sårheling. Desuden er zebrafisk larve et værdifuldt system til live høj opløsning mikroskopisk billeddannelse af dynamiske biologiske fænomener i tid og rum med cellulære opløsning. Men den traditionelle metode til Agarosen indkapsling af live imaging kan hindre larve udvikling og væv genvækst. Derfor dette manuskript beskriver zWEDGI (zebrafisk Wounding og Entrapment enhed for vækst og Imaging), som blev designet og fremstillet som et funktionelt opdelte enhed til at orientere larver til høj opløsning mikroskopi samtidig tillader det halefinnen er transection inden for enheden og efterfølgende uhæmmet hale udvikling og re-vækst. Denne enhed tillader sårede og langsigtede imaging samtidig opretholde levedygtighed. Formen zWEDGI er 3D udskrives, i customizability af dens geometrier gør det let modificeret til forskellige zebrafisk billedbehandlingsprogrammer. Desuden, zWEDGI tilbyder mange fordele, såsom adgang til larve under eksperimenter for at have såret eller for anvendelsen af reagenser, sideløbende orientering af flere larver for strømlinet imaging og genbrugelighed af enheden.
Introduction
Den regenerative kapacitet af zebrafisk larver Danio rerio gøre dem en ideel model organisme behandlingen af sår svar samt healing og genvækst1,2,3,4. Adgang til en bred vifte af transgene zebrafisk linjer og zebrafisks anatomiske gennemsigtighed yderligere forbedre deres nytte for i vivo studier af sår svar events samt langsigtede regenerative processer4. Undersøgelse af disse biologiske processer med høj opløsning time-lapse Fluorescens mikroskopi derfor kræver en live imaging zebrafisk enhed, der giver mulighed for høj stabilitet og minimal bevægelse af zebrafisk larve samtidig opretholde levedygtighed. Det er afgørende at enheden giver mulighed for effektiv sårede mens healing og regeneration forekomme upåvirket af enheden.
Live imaging stabilisering standardmetoden til indlejring af larve i Agarosen under live imaging begrænser vækst og sår regenerering5 og kan øge dødelighed, da larverne begynder at vise tegn på hjertesygdomme stress og vævet nekrose efter fire timer4. Derfor, fjernelse af Agarosen fra områder af interesse er ofte nødvendigt at tillade normal udvikling og regeneration6, udsætte larverne til potentielle skader som Agarosen er skåret væk. Derudover skal brugeren med Agarosen indlejring teknik, orientere larver i kort tid før Agarosen størkner5,6,7. Hurtigt manipulere larver ikke kun kræver dygtighed af brugeren, der også risiko for skader på larve. Selv om metoder til at stabilisere larve til live imaging er blevet beskrevet til at omgå disse ulemper, såsom ridged agar wells3 eller puder8, brug af silikone vakuum fedt til at skabe en billeddannelse kammer med PVC rør eller andre materialer6og roterende slanger9, mange af disse metoder er labor intensiv, rodet, ofte ikke-genanvendelig og tillader ikke for miljømæssige manipulation (narkotika behandlinger, såret osv.) efter fiskene er blevet monteret.
Derfor, zWEDGI enheden (figur 1) var designet til at overvinde nogle af ulemperne af agar montering for langsigtet live imaging af zebrafisk larver samtidig tillade manipulation af prøven. ZWEDGI består af tre semi-åbne opdelte kamre (figur 1A) for at give mulighed for lastning, tilbageholdenhed, sårede og billeddannelse af 2-4 dage efter befrugtningen zebrafisk larver. Enheden er fabrikeret fra Polydimethylsiloxan (PDMS) og placeret på cover slip af en 60 mm glas bund imaging parabol. Design præsenteres her var beregnet til sår healing undersøgelser, men brugen af et modulært design og standard fabrikation teknologi gøre zWEDGI designet modificerbare og imødekommenhed over for en række eksperimentelle procedurer, især for procedurer, kræve minimal tilbageholdenhed med eksperimentelle manipulation og langsigtede billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: base zWEDGI design blev formuleret for zebrafisk larver, der er 2-4 dage efter befrugtning (dpf) og følge retningslinjerne fra University of Wisconsin-Madison forskning dyr Ressourcecenter.
1. design og 3D udskrivning af forme
- Model PDMS komponent af enheden med ønskede geometrier og attributter i et 3D-modellering software 5. Oprette en forsamling af en tom mold og PDMS del og generere en negative støbeform til PDMS del ved at skabe et hulrum i formen svarende til PDSM del. Gem mug som en .stl fil til 3D udskrivning ( figur 2, trin 1.1).
Bemærk: En stereolithography format (.stl) fil af skimmel design præsenteres her ( figur 1) er tilgængelig for download på https://morgridge.org/designs/. - Udskriv forme bruger photopolymer 3D printer ( figur 2, trin 1.2). Gøre flere forme i en enkelt udskrivning, hvis det er muligt, så mere end én enhed kan formes med en enkelt batch af PDMS.
Bemærk: De viste eksempel blev trykt i Hi-Res tilstand med en 0.075 mm beam diameter og 0,05 mm lagtykkelse, ved hjælp af photopolymer harpiks 5.- Rene forme med en fin børste, denatureret alkohol i en sprayflaske, og komprimeret luft til forsigtigt krat og fjerne uhærdede harpiks. Fjerne materiale fra regionerne microchannel.
- Post helbrede forme i en UV post kur apparater til 60 min på hver side som uhærdet Opgiv er giftigt for zebrafisk larver 10.
- Sand hulrum side af formen med 200 sandkorn sandpapir på en flad overflade, indtil alle forsegling overflader er i kontakt med sandpapir (lastning kanal geometrier og skimmel omkreds). Let sand med 400 og 600 grus sand papir, gradvis, til at producere glatte flush overflader på tværs af alle geometri belægninger ( figur 2, trin 1.3). Måle dybden af hulrummet efter slibning med et måleur til at kontrollere, at det er tæt på den designede dybde.
- Rene forme og dække diske (1 ¾ tommer diameter x ¼ tommer tyk borsilikatglas eller akryl, et glas dækning pr. mug) ved at placere i en ultralyds renere fyldt med vand i 30 min eller ved skylning under rindende vand.
- Blæse tør med trykluft og rengør både formene og dækker med isopropylalkohol og filtreret trykluft. Brug en ren bænk som et sted til at fabrikere enheder for at minimere forurening fra luftbårne debris. Efterlad den rensede forme og glas dækker i den rene bænk eller et overdækket petriskål indtil det skal bruges.
2. PDMS fabrikation af zWEDGI enhed
- gøre PDMS ved at hælde 184 silikoneelastomer Polydimethylsiloxan (PDMS) i forholdet 5:1 (base til aktivator) ind i en plastik kop. Bland godt i 2 min. med en træ craft stick, omrøring gel over til sig selv, ligesom æltning brød. 5 forme, bruge 10 g af base og 2 g af aktivator.
- De gas blandingen i et vakuum ekssikkator til 25-45 min. indtil alle bobler er væk.
- Fylde hulrummet af hver af de 3D trykte forme med ca. 0,75 mL PDMS ved hjælp af en 10mL sprøjte, indtil formen lidt overløb med en menisken ( figur 2, trin 2.1).
- De gas fyldt formene for 45 min til at fjerne yderligere bobler, som kan have dannet udfyldningen.
- Anvender et glas lukke diskette oven på PDMS-fyldt støber, trykker disc'en ned i en vinkel til at forhindre bobler fra at være fanget ( figur 2, trin 2.2). Tillade overskydende PDMS at blive udvist som glas disc cover anvendes.
- Brug små ratchet klemme holde lukke diskette tæt til formen.
Bemærk: Dette skaber en flad overflade, når PDMS er helbredt og producerer gennem huller, hvor de 3D trykte geometrier er flush med glas dækning slip. Alternativt, for at øge antallet af enheder, der kan blive helbredt på én gang, bygge en multi klemme enhed (fx. figur 2, trin 2.3). - Helbrede PDMS enheden i fastspændt formene på 100 o C i en ovn i 90 min ( figur 2, trin 2.4). Fjern formene fra ovnen og lad den køle indtil de let kan håndteres. Hvis den klemmer enhed er metal, Fjern mug og cover disc samling fra klemmen til at forhindre metal i fortsat at helbrede PDMS som følge af restvarmen.
Bemærk: Enheden er nemmest at fjerne fra formen, mens stadig lidt varm og ikke fuldt helbredt. Når formen er fjernet fra ovnen og lukke diskette er fjernet, kan enheden sidde i et par dage før du går videre til demolding. Hvis enheden er demolded kort efter fjernelse fra hærdning ovnen, placere den i en overdækket petriskål at minimere forurenende stoffer samtidig med at det fuldt hærde.
3. Plasma-bonding zWEDGI til glasfad
- klemme skimmel indeholdende PDMS enheden i en bænk vice så formen ' s geometrier står op, parallelt med den arbejde station bænk.
- Start fjerne PDMS enheden ved at frigive PDMS trække fanen fra formen ved hjælp af flade-tippet pincet. Arbejde omkring omkredsen af formen med pincet (gerne fjerne en kage ud af en pan ( figur 2, trin 3.1)).
- Brug filtreret trykluft og pincet til at forsigtigt trække enheden ud af formen ved at holde ind under fanen pull og blæser luft under enheden. Arbejde langsomt, så luften kan hjælpe separat PDMS fra formen, at tage særlig pleje med tips til pincet omkring sektionerne tynde tunnel.
- Placere PDMS enhed op og ned på indersiden af forsiden af et glas bund fad, så de fastholdende tunnel kiler er at røre plastik ( figur 2, trin 3.2).
- Placere dækslet fadet med hovedet zWEDGI og den tilsvarende glas bund fad i en plasma renere med den inderste glas opad ( figur 2, trin 3.3).
- Evakuere plasma rengøring kammer, indtil trykket når 500 mTorr.
- Sæt radio frekvens (RF) magt til høj. Udsætte enheden og parabol til RF frekvens for ca. 2 min. langsomt at presse kammeret og returnere enheden og skålen til en renrums hætte.
- Fjerne PDMS enheden fra parabol dækning. Flip over PDMS zWEDGI til den korrekte orientering på glas ved at placere det omhyggeligt på midten godt af glas bund fad ( figur 2, trin 3.4)
- ved hjælp af den bagerste ende af pincet, let tryk ned på PDMS enheden for at sikre luftbobler er ikke fanget under. Anvende pres omkring de minut geometrier mikro-kanaler og glat PDMS til kanterne ( figur 5 c).
Bemærk: Fuldstændig kontakt mellem PDMS og glas sikrer bedre tilslutning fra plasma limning. ZWEDGI enheden kan være plasma fæstnede på andre glas bund fad formater, såsom et glas bund 6-godt plate ( figur 2 c). - Placer et dække over enhed fadet inden du fjerner fra renrums hood.
Bemærk: Når enhederne har været fast til glas, protokollen kan stoppes midlertidigt indtil de er klar til brug.
- ved hjælp af den bagerste ende af pincet, let tryk ned på PDMS enheden for at sikre luftbobler er ikke fanget under. Anvende pres omkring de minut geometrier mikro-kanaler og glat PDMS til kanterne ( figur 5 c).
4. Kanal forberedelse og lastning larverne
Bemærk: General zebrafisk dyrehold blev gennemført pr. The zebrafisk bog, tilgængelig online på http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Voksen zebrafisk og embryoner blev vedligeholdt som beskrevet tidligere 1. Vildtype AB stamme blev brugt. Følg institutionen ’ s Animal Care protokol for detaljerne vedrørende krav til imaging levende larver.
- Skylles kanaler med et minimum af 100 µL 70% ethanol pr. kanal, ved hjælp af en mikropipette til at skylle gennem den fastholdende tunnel. Fjerne ethanol og skyl 2 eller 3 gange med dobbeltdestilleret vand. Lad lufttørre.
- Fylde kanaler med skummetmælk (ved en koncentration på 1% fortyndes i vand) i 10 min ved stuetemperatur til at minimere overholdelse af larver glas coverslip af fadet. Derefter nedsænkes forsigtigt enheden flere gange i dobbelt destilleret vand til skylning. Lad lufttørre hovedet.
Bemærk: Protokol kan pause her. Denne forberedelse af zWEDGI enhed kan gøres flere dage før brug. Butik dækket ved stuetemperatur. - Forbered 1% lavt smeltepunkt kogepunkt (LMP) Agarosen ved at kombinere 100 µL 2% smeltet LMP Agarosen med 100 µL 2 x Tricaine (0,4 mg/mL Tricaine - ethyl 3-aminobenzoat) i E3 buffer 11 pre varmet til 38 o C. opretholde 1% Agarosen/tricaine løsning på 38 o C i en varm blok at forhindre geldannende.
Bemærk: For multiphoton mikroskopi 11, bruge enten un-pigmenterede zebrafisk varianter (såsom casper 12) eller opretholde larver i E3 indeholdende 0,2 mM N-phenylthiourea at forhindre pigment dannelse 11 at minimere absorberingen af de i nærheden af infrarøde bølgelængder af pigment.
Forsigtig: N-phenylthiourea er giftigt. Følg institutionen ' s regler for bortskaffelse. - Anesthetize larver i E3 buffer indeholdende 0,2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11. Vent, indtil larver er ubevægelig og ikke-responderende på en touch stimulus.
- Våd pre kanaler med et par microliters af Tricaine/E3.
- Pick up en enkelt larve ved hjælp af en bred blænde pipette tip. Indbetal larverne til lastning kanal ( figur 3A). Ved hjælp af en pipette tip eller lignende værktøj, orient larve i salen, lastning, sådan at den dorsale side vender den ranke kanten af lastning kammer og hale vender mod den fastholdende tunnel ( figur 3B).
- Forsigtigt trække væske ud af såret salen, giver mulighed for larve til at flyde ind i fastholdende tunnelen ( figur 3 c). Fjerne det meste af væsken samtidig bevare fugt omkring larver ( figur 3D). Denne proces kan være bistået ved at vippe parabol lidt mod såret kammeret.
- Sted 1% LMP Agarosen i Tricaine/E3 (~ 38 o C) over larve ' s hoved, påfyldning lastning kammer ( figur 3). Tillad Agarosen størkne med larve i den korrekte position. Tilføje Tricaine/E3 til såret kammer, som kræves for at opretholde hydrering. Gentag dette, indlæsning af proces for de resterende 2 kanaler.
- Ved hjælp af en sprøjte nål, forsigtigt fjerne enhver agarosegelelektroforese, der sivede igennem den fastholdende tunnel ind i såret salen ( figur 3F). Tilføj yderligere tricaine/E3 enten bare over Agarosen (for kvæstelse, kort sigt imaging eller sår behandling isolation) eller til at udfylde kultur parabol (for langsigtet imaging). Erstatte kultur parabol låg for at undgå fordampning. Larverne kan være afbildet på dette tidspunkt (unwounded) eller såret.
5. Såret og billedbehandling larverne
- ved hjælp af en steril skalpel klinge, Transekttællinger hale finner og posteriort for notochord 11 i såret salen ( figur 3 G, H). Tilføj yderligere tricaine/E3, hvis det er nødvendigt og erstatte kultur parabol låg.
Bemærk: Alternativt, afhængigt af tidsvinduet udviklingsmæssige af interesse, larverne kan såret, tilladt at inddrive i E3 og opretholdes i en inkubator (28,5 o C) indtil den ønskede imaging tidspunkt, på hvilket tidspunkt de kan indlæses i kanaler som ovennævnte. - Installere enheden zWEDGI med bedøvede larver på en inverteret mikroskop i en fase indsætte, der vil rumme 60 mm glas bund fad. Find halen af larve i øvre-mest kanal, roterende skålen, som skulle få halen i den ønskede position. Billede som krævet for den specifikke eksperiment.
Bemærk: ZWEDGI er generelt gældende for høj opløsning lysmikroskopi, herunder widefield fluorescens og laser scanning mikroskopi. Der er en række parameter overvejelser når imaging zebrafisk larver, men bestemt imaging parametre er instrument, prøve og eksperiment afhængige. Her, larve halen var afbildet på en brugerdefineret bygge multiphoton mikroskop 5 , 11 udnytte følgende parametre: 40 X længe arbejde afstand vand fordybelse mål, 890 nm laser excitation, 445/20 nm emission filter og 512 x 512 opløsning.
6. Slutningen af forsøget
- Fjern zWEDGI fad fra mikroskop. Aflive larverne ved at placere zWEDGI på en ice vandbad eller i 4 o C i mindst 20 min. og vurdere for fravær af hjerteslag og omsætning.
Bemærk: Fordi larverne vedligeholdes i separate rum, larverne kan individuelt inddrives ved forsigtigt at trække på agaren med pincet eller pipette. Agaren kan fjernes fra regionen hoved og larve anvendes til yderligere procedurer, såsom fiksering for antistoffarvning eller forarbejdet til RNA eller protein udvinding. - Efter fjernelse af larver og agar, Rengør zWEDGI med ethanol og destilleret vand, som beskrevet i trin 4.1 og sæt hovedet til luft tørre. Butikken er dækket i et køligt og tørt sted. Re-coat med skummetmælk (trin 4.2) efter behov før næste brug.
Bemærk: zWEDGIs kan genanvendes flere gange, indtil PDMS begynder at komme væk fra glasset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZWEDGI PDMS mikrofluid enhed er et funktionelt opdelte enhed designet til at rumme fire hovedfunktioner (nedenfor) forbundet med live imaging af halefinnen såret healing og genvækst i zebrafisk larver. PDMS blev valgt til zWEDGI fabrikation, fordi det ikke kun er let tilgængelige og en industristandard for biokompatibilitet, men også fungerer godt i forme. Derudover gør PDMS enheden genbruges og blottet for hårde eller skarpe kanter når enheden er dannet. ZWEDGI specifikt tillader 1) indlæsning af larver i enheden, 2) tilbageholdenhed på ordentlig orientering for tænkelig, 3) såret af halefinnen, og 4) mikroskopisk billeddannelse, beskrives mere detaljeret nedenfor.
Lastning
ZWEDGI design består af 3 kanaler, hver designet til at begrænse en larve (figur 1B). Til lastning og indledende orientering af larver er åben lastning kammer 3 mm bred (figur 1A) til at rumme en stor blænde pipette tip til indbetaling af en larve (figur 3A). Yderligere, længde og bredde giver tilstrækkelig plads til at tillade efterfølgende manipulation af larve ind i den rigtige retning, med halen mod fastholdende tunnelen og dorsale side mod toppen (figur 3B).
Tilbageholdenhed
Når larve er blevet indlæst i kanalen, kan det være trukket hale-først i den fastholdende tunnel ved fjernelse af væske ud af såret salen eller forsigtigt skubbe på plads med en pipette tip eller lignende værktøj (figur 3 c). Lastning kammer (figur 1A), fra 3 mm til 0,45 mm, tragtformet geometri guider larve ind ønskede laterale orientering (figur 3 c). Orientering af larve på sin side fastholder halen omtrent parallelt med glas bunden af fadet til forbedret imaging. I modsætning til mikrofluid enheder lavet ved hjælp af silicium wafers, 3D trykte formene geometrier behøver ikke at være konsekvent i z-retning. Den fastholdende tunnel er derfor dækket og tilspidset i z-aksen, post højde er større end exit fra 0.5 mm til 0,3 mm højde (figur 1B, isometrisk visning af tunnelen). Denne tilspidset letter vejledning af larve og udfladning af halen mod dækslet glas imaging overflade. Denne funktion eliminerer behovet for brugeren til at orientere modellen, mens Agarosen er hærdning.
Væsken er fjernet fra indlæsning kammer (figur 3D) og erstattes med lavt smeltepunkt Agarosen at stabilisere hoved inden for kanalen, mens halen vedligeholdes uhæmmet i buffer i såret salen (figur 3). Den minimale agarosegelelektroforese, der kan lække gennem tunnelen under fastholdende kan nemt fjernes fra såret salen (figur 3F). Manglen på Agarosen i såret kammeret tillader uhæmmet genvækst og udvikling af halefinnen5.
Såret
Når larve er blevet indlæst gennem tunnelen, og hovedet tilbageholdende ved agarosegelelektroforese, er halefinnen tilgængelig for transection fordi det rager ud ind i såret kammeret. Den semi-cirkel såret kammer opvejes 1,9 mm fra vandret symmetri. Dette tillader skalpel bladet skal indsættes lige over halefinnen, giver tilstrækkelig plads til klingen kan drages nedad på tværs af halen, transecting halefinnen (figur 3 g). Den bredeste del af 7 mm diameter halvcirkel opstår, hvor halen er såret til at rumme denne bevægelse. Ud over at tillade brugeren at sår larve, giver denne opdelte design mulighed for regional anvendelse af forbindelser til halen region5. Denne unikke funktion af semi-isolation ville muliggøre lokaliserede afprøvning af virkningerne af forskellige stoffer, kemikalier eller biologiske agenser på sårheling proces.
Billedbehandling
Målet med zWEDGI enheden er at tillade høj opløsning lys mikroskopi billeddannelse af zebrafisk halefinnen, uhindret ved agarosegelelektroforese indlejring. Af denne grund, er PDMS enhed bundet til et kommercielt tilgængelige glas bund fad, at give en optisk kvalitet overflade til mikroskopi ved hjælp af høje NA linser. Her præsenterer vi billeder ved hjælp af multiphoton mikroskopi for anden harmoniske (SHG) billeddannelse af kollagen fibre i halefinnen til at illustrere zWEDGI imaging funktioner. ZWEDGI kan dog anvendes til andre lysmikroskopi metoder, såsom Konfokal mikroskopi, udnytter en inverteret mikroskop fase konfiguration. Med zWEDGI, i modsætning til metoden til Agarosen integrering med efterfølgende fjernelse, kan halefinnen nemt afbildet i enheden før såret (figur 4A), såret inden for enheden, derefter straks vendte tilbage til mikroskop for efter sår Imaging (figur 4B-E). Tidligere arbejde identificeret ændringer i kollagen fiber organisation under sår helingsprocessen ved hjælp af SHG. 13 SHG kan bruges til at registrere visse typer af bestilte strukturer, herunder fibrillar kollagen, uden brug af eksogene etiketter. 14 billede kvalitet af de levende caudale finner afbildet i zWEDGI var lig opnaaet ved faste væv5 men zWEDGI giver en række fordele. Vigtigst, kan halefinnen healing og genvækst fortsætte uhindret ved agarosegelelektroforese integrering med larve overlevelse svarer til larver vokset uhæmmet5. Yderligere, fordi den sårede kan udføres, mens larver er i enheden, præ- og post såret billeder kan blive indsamlet på den samme halefinnen (figur 4A). ZWEDGI tillader indsamling af 3 dimensionale data over tid, giver en mere komplet billede af de dynamiske ændringer i strukturen i den ekstracellulære matrix (figur 4B). Illustreret her SHG fiber sår afslapning, i 3 dimensioner, efter var blevet såret i zWEDGI. Før såret, opdaget SHG kollagen fibre udstråle udad fra notochord til fin spidsen, (figur 4A). Kort efter sårede afstanden mellem spidsen af den kontraherede fin og center the fin stiger med sår afslapning. Den 3D art af dataindsamlingen tillader den rumlige genopbygning, benytter gengivelse programmel Imaris. Disse rekonstruktioner, og den efterfølgende rotation valgmuligheder, illustrere sammentrækning og afslapning af fin opstår ikke kun i x y planet for samlingen billede (fig. 4 B, C, D), men også på z-akse (figur 4 G-J, L-O, Q-T; Supplerende film 1, 2) som halen flader fra den opadgående krølle i den aftalte stat. ZWEDGI kan bruges sammen med andre billeddiagnostiske modaliteter over længere perioder, såsom brugen af Konfokal mikroskopi til billede neuroner i halefinnen udvikling over 24 h5. Fordi enhedens fastholdende enheder er linet op parallelt, hvilket eliminerer behovet for at rotere enheden når lokalisere larver, opsætning af mikroskopet og bevæger sig mellem flere modellen for billedbehandling er ligetil og kan automatiseres for at indsamle time-lapse billeddata af flere larver. For at udvide antallet af prøver, der kan være afbildet, kan PDMS zWEDGI enheden placeres i andre glas bund formater, tør som en 6-godt plade (figur 2 c).
Figur 1 : Endelige Design skematisk (A) Skematisk viser generelle layout og målinger af den zWEDGI enhed, fremhæve terminologi for funktionelt opdelte afdelinger. (B) isometrisk visning af PDMS enhed som fjernes fra formen. (C) Inset viser tunnel, fremhæve ændringen i ind- og udgang højder. (D) Model af larve tilbageholdende i enheden. Figur ændres fra en tidligere udgiver artikel5 med genoptryk tilladelse fra zebrafisk Journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Fabrikation skematisk (A) Trin 1 begynder med design af formen enhed i en 3D-modellering software (1,1) som er derefter 3D trykte (1,2). Formene er UV-lys helbredt og derefter slebet og rengøres så de hævet geometrier har endda højde (1.3). Trin 2 indebærer fyld formene med blandet og afgassede PDMS (2.1) og anvende en glas disk over mug på en drejning til at forhindre fældefangst luftbobler i enheden PDMS (2.2). Glas og mug er fastspændt sammen (2.3) til hærdning i ovn ved 100oC i mindst en time (2.4). Trin 3 anvender filtreret luft og flade-tippet pincet til at fjerne enheden PDMS fra mold (3.1). Enheden placeres derefter på toppen imaging parabol låget (3.2) og er plasma behandlet (3.3), sammen med glas bund, at tillade PDMS at tiltræde glas bund fad (3.4). (B) den færdige zWEDGI enhed bundet i en glas bund fad og klar til billedbehandling brug. (C) flere zWEDGI enheder kan placeres i et glas bundplade 6-godt for at billede mange larver i det samme eksperiment. Figur ændres fra en tidligere udgiver artikel5 med genoptryk tilladelse fra zebrafisk Journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Lastning og såret af larve i zWEDGI (A) En larve er indlæst i læsning kammer ved hjælp af wide-blænde pipette. (B) larve er orienteret med den dorsale side op mod den flade del af lastning kammer tragt og hale mod fastholdende tunnelen. (C) ved hjælp af suge fra pipette tip afholdt ved indgangen såret afdeling, larve er trukket ind i tunnelen, placere den i ordentlig orientering til billedbehandling. (D) væske er fjernet fra indlæsning kammer at give mulighed for (E) tilsætning af Agarosen rundt hoved regionen til at stabilisere larve. Agarosen er farvet rød her kun til demonstration. Minimal Agarosen siver ind i såret kammeret og let kan fjernes, som vist i (F). (G) for at sår når larve er tilbageholdende i den engelske kanal, en skalpel blade er indsat over larve og skåret ned på tværs af halefinnen, posterior til notochord. (H) larve er nu klar til post såret imaging. Skalere bar (A-H) = 1 mm; Skalere bar (F) = 1 mm; Skalere bar (G) = 1 mm. figur ændres fra en tidligere udgiver artikel5 med genoptryk tilladelse fra zebrafisk Journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : 3D multiphoton tid bortfalder imaging SHG fibre i zebrafisk halefinnen, før og efter såret i zWEDGI. ZWEDGI design giver mulighed for høj opløsning imaging, i dette tilfælde af SHG fiber organisation foregående (pre sår) og det efterfølgende caudale fin transection (efter sår). Dataene blev indsamlet som z-stakke med 4 min. mellemrum. (A-E) viser SHG af fibre i den halefinne som en projektion af z-stakke, forud for og ved fire mellemrum efter transection. Z-projektion blev udført ved hjælp af ImageJ software. 15 t = 0 var starten på imaging, ca 20 min efter transection. Dobbelt pilene angiver stigningen i afstanden af spidsen af sår kant (korte hvide linje) i forhold til placering af notochord (lange, hvide linje) under afslapning af sår efter den første sammentrækning. (F-J). Vippes 3D rekonstruktion af de oprindelige data. (K-O). Overflade præstationen af den hældende 3D rekonstruktion vist i F-J. (P-T). Visninger af 3D rekonstruktion overflade rendering, illustrerer, hvordan sammentrækning og afslapning forekommer i 3-dimensionelle rum, som kan vurderes med denne data indsamlet ved hjælp af zWEDGI hvor halefinnen er ikke begrænset ved agarosegelelektroforese. Skalere bar (A-E) = 100 mikron; Skalere bar (F-T) =100 mikron. 3D puds blev udført ved hjælp af software til billedbehandling. Se også supplerende film 1 og 2. Figur ændres fra en tidligere udgiver artikel5 med genoptryk tilladelse fra zebrafisk Journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kritisk trin af zWEDGI fabrikation (A) For at sikre ingen bobler form eller fanget i enheden når fastspænding på glas-disken, degas efter PDMS har været fyldes i forme og Skråkant fastspænding glas, når du anvender det til PDMS i formen. Derudover for at forhindre "blinkende" PDMS over lastning og sårede kamre, Sørg for at sand toppen af enheden grundigt for at sikre er overfladen i den religiøse arkitekturs geometri flush når fastspænding på glasset. (B) når enheden er tilstrækkeligt helbredt i ovnen, luft lommer mellem PDMS og skimmel angiver at indretning vil være let at fjerne. Hvis enheden ikke fjerner nemt, det er mest sandsynligt på grund af utilstrækkelig helbredelse tid eller temperaturen eller formen selv var ikke tilstrækkeligt UV-hærdet, hvilket resulterer i resterende harpiks kontaminering af PDMS. (C) når du anvender enheden til bunden glasfad efter plasma behandling, anvende let tryk med bagenden af pincet, starter kl tunnelen regioner og arbejder udad mod kanten af enheden. Hvis enheden ikke obligation godt, som det fremgår af luftlommer mellem enheden og glasset, forlænge mængden tid i plasma bonder og sikre, at der er ingen støv mellem PDMS og glas overflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: skrå 3D overflade gengivelse af multiphoton gang lapse billeder af SHG fibre i halefinnen under afslapning efter sårede. SHG fibre i halefinnen afbildet som zstacks over tid efter såret (starten af filmen er ca 20 min efter sårede) i zWEDGI. Z-stakke blev rekonstrueret og overflade gengives ved hjælp af software til billedbehandling. Hale vippet vise tre dimensionalitet. Anterior er til venstre. Film svarer til stillbilleder i figur 4 (K-O). Skalalinjen = 50 mikron. Venligst klik her for at downloade film.
Supplerende Movie 2: Side visning af 3D-overflade gengivelse af multiphoton gang lapse billeder af SHG fibre i halefinnen under afslapning efter sårede. SHG fibre i halefinnen afbildet som zstacks over tid efter såret (starten af filmen er ca 20 min efter sårede) i zWEDGI. Z-stakke blev rekonstrueret og overflade gengives ved hjælp af software til billedbehandling. Side Se vist at understrege erobringen af dynamiske ændringer i z-aksen. Anterior er til venstre. Film svarer til stillbilleder i figur 4 (P-T). Skalalinjen = 40 mikrometer. Venligst klik her for at downloade film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med zWEDGI enheden er at fange 3D tid bortfalder imaging af stabiliserende og orientere fisk inden for en høj opløsning mikroskop mål lille arbejde afstand. Mens opfylder disse specifikationer, er det også en forbedring over traditionelle agar-baserede forberedelse til live imaging. Der er tre vigtige trin (nedenfor) i fabrikation af zWEDGI, som, hvis det ikke gøres korrekt, kan resultere i defekte enheder:
PDMS forberedelse (figur 5A)
For at undgå boblerne, degas formene efter PDMS er blevet tilføjet. Kontroller at alle bobler er ryddet efter afgasning og betale meget opmærksom på anvendelsen af glas-disken. Glas-disken skal anvendes på en drejning til at sikre at luften ikke er at være fanget under og inden for PDMS. Støv kan være et problem i de fleste trin i processen. Forhindre støv, komplet hver rengøring trin grundigt og gemme dele i en ren hood mellem trin. Kontrollere forme for overskydende resin, der kan skabe en ru overflade før UV-hærdning. Når slibning, Sørg for, at de sand papir kontakter alle geometrier til at sikre, at alle overflader er flush (figur 2, trin 1.3). Altid rene med isopropylalkohol og luft lige før påfyldning formene med PDMS. Når klemme den ekstra PDMS ud af formen, sikre klemmerne tæt hold formen og glas dækning sammen (figur 2, trin 2.3).
At fjerne enheden fra mold (figur 5B)
Sikre ovn er mindst 100 o C og helbredelse tid er mindst 1-1,5 time. Hvis PDMS ikke er tilstrækkeligt helbredt, kan det være vanskeligt at fjerne fra formen. Andre muligheder for at fjerne omfatter ikke blande PDMS reagenser længe nok, brug af forkert nøgletal base og hærder eller sidesten harpiks tilbage i formen efter 3D printing, som derefter forurener PDMS. Efter udtagning fra ovnen angiver luftlommer mellem enhed og mug (figur 5B), at enheden fjernes nemt.
Overholdelse af PDMS glas-bund fad (figur 5 c)
Dårlig overholdelse af glasfad kan skyldes støv, forskydning eller utilstrækkelig længde af plasma behandling. Når du placerer enheden på glasset, tip fad i en vinkel og center PDMS på glas cirklen og sørg for det rører ikke kanten af brønden. Hvis enheden ikke overholder, forsigtigt Tryk på enheden på glas slip med bagenden af pincet, begyndende ved regionen delikat tunnel og trykke på ydre kanter. Hvis enheden stadig ikke overholder, eksperimentere ved at øge tid i plasma renere i intervaller på ét minut.
Mens larverne kan være afbildet i enheden for korte perioder af tid (minutter) uden brug af agar, med henblik på langsigtede live-imaging regionen halefinnen er agar placeret på hovedet i læsning kammer efter at fisken er blevet indlæst. Selv om denne anvendelse af agar ikke synes at påvirke sårheling svar eller levedygtighed af larver5, kan dette påvirke undersøgelse af flere forreste periferi af larverne. Selv om vi har kunnet billede larver for op til 60 h har vi ikke undersøgt, om levedygtighed ville blive påvirket med længere imaging gange. Derudover var særlige design præsenteres her optimeret til alder 2-4 dage post befrugtning (dpf) larver liggende på deres sider for hale transection og sårheling billeddannelse. Andre udviklingsstadier, retningslinjer og eksperimenterende protokoller kan kræve ændringer i design. Men den forsætlige funktionelle modularitet af design gør det let imødekommenhed over for sådanne ændringer.
Derudover kræver fabrikation af denne enhed adgang til en 3D printer og andre mikrofluid materialer og udstyr, såsom PDMS og en plasma renere, potentielt begrænse tilgængeligheden af enheden for nogle brugere. Men denne metode af mug fabrikation blev valgt da 3D trykning kapaciteter, sammen med mikrofluidik fabrikation, bliver mere udbredt på akademiske campusser. Derudover er der udbydere for 3D printing tilgængelige, efterhånden som teknologien udvikler sig hurtigt og omkostningerne af printere falder.
I betragtning af dens opdelte design og funktionalitet, tilbyder zWEDGI forbedringer over den nuværende teknik for gang lapse billedsamling benytter integrering af agar. Først, omgiver Agarosen ikke halen region i zWEDGI, tillader sårheling og regenerering at fremskridt uhæmmet mens overlevelse af larver i zWEDGI kan sammenlignes med integreret og integreret kontrol5. For det andet, brug af høj opløsning 3D udskrivning til at fabrikere formene tillader zWEDGI at have unikke skrånende geometrier til at orientere larve i tre dimensioner med hensyn til billedbehandling flyet. Dette fjerner tid afhængighed af manipulere larver til en ordentlig orientering så agaren hærder. Et tredje vigtigt fordel af zWEDGI design er åben kammer design der tillader hale og hoved regioner skal være tilgængelige for eksperimenterende manipulation. Dette er af særlig interesse for sårheling undersøgelser, men dette gør også zWEDGI en potentielt nyttig værktøj for andre manipulationer. Afdelingsmæssig udformningen af enheden, giver desuden mulighed for regional anvendelse af forbindelser under eksperimenter. Enheden semi-isolater hovedet fra halen på grund af diffusion differentiale buffer (i såret kammer) og Agarosen (i læsning kammer)5, tillader anvendelse af forbindelser samtidig med at studere sårheling eller andre biologiske processer. Derudover fordi larverne er monteret i separate kanaler, individuelle larve kan identificeres og hentes efter imaging til yderligere forarbejdning såsom RNA og protein oprensning eller antistof mærkning. Og endelig, fordi enheden er lavet af PDMS, der har været bundet til glas bund fad, enheden er genanvendelige når larverne er blevet fjernet.
I bevæger sig fremad, egner modulært design og lethed af fabrikation af zWEDGI sig godt til modifikation ændret funktionalitet. I øjeblikket, er de mangelfulde geometrier bygget specielt til de såret og billedbehandling eksperimenter beskrevet, giver det brede program for live imaging af sårheling. Men larve ligger direkte på glasset, således at ingen materiale (dvs. PDMS), som kan interferere med billedbehandling, der findes mellem larve og billedbehandling overfladen. Derfor, andre regioner af larverne, såsom stammen, would være tilgængelige for billeddannelse. Desuden kan design af 3D trykte formen af zWEDGI let ændres til at rumme andre udviklingsstadier, forskellige orienteringer larve og varierede behandlinger. Disse egenskaber gør det derfor et værdifuldt værktøj til at indfange tid bortfalder mikroskopi af begivenheder over en bred vifte af tidsskalaer. Brug af andre glas bund fad formater kan give mulighed for større PDMS enheder og plads til flere kanaler. Givet den stigende tilgængelighed til 3D udskrivning fabrication teknikker og den efterfølgende brugervenlighed ændring for en række forskellige eksperimentelle protokoller, zWEDGI kan vise sig for at være et effektivt redskab i realm af høj opløsning live imaging mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende primære projektfinansiering fra det Morgridge Institut for forskning og laboratoriet for optisk og beregningsmæssige Instrumentation. Vi anerkender også midler fra NIH # R01GM102924 (AH og KWE). KH, JMS, RS, AH og KWE udtænkt og designet af undersøgelsen. KH og JMS udførte alle eksperimenter med støtte fra DL, KP og RS. KH, JS, RS, AH og KWE bidraget til skrivning af håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
