Summary
이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치)는 compartmentalized 장치 방향 및 zebrafish 애벌레를 억제 하도록 설계 되었습니다. 디자인 꼬리 transection 및 상처 치유와 재생의 고해상도 형광 현미경 이미지의 장기 수집을 허용합니다.
Abstract
Zebrafish 애벌레 발달 생물학 및 상처 치유에 대 한 중요 한 모형 유기 체 이다. 또한, zebrafish 애벌레 셀룰러 해상도 시간과 공간에 동적 생물 현상의 라이브 고해상도 현미경 이미징에 대 한 중요 한 시스템 이다. 그러나, 애벌레의 개발 및 조직 regrowth 라이브 이미징 agarose 캡슐화의 전통적인 방법 방해 수 있습니다. 따라서,이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치),이 설계 하 고 허용 하는 동안 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 애벌레 하 기능 compartmentalized 장치 조작 꼬리 지 느 러 미 transection 장치 및 후속 억제 꼬리 개발 시간과 다시 성장. 이 장치는 부상 및 생존 능력을 유지 하면서 장기적인 이미징에 대 한 수 있습니다. ZWEDGI 형 3D 인쇄는, 그 형상의 customizability 하기가 쉽게 다양 한 zebrafish 이미징 응용 프로그램에 대 한 수정. 또한,는 zWEDGI 실험 동안 유 충에 부상 또는 시 약의 응용 프로그램에 대 한 액세스와 같은 다양 한 혜택 paralleled 유선형된 이미징에 대 한 여러 애벌레의 방향 및 장치의 재사용성을 제공 합니다.
Introduction
Zebrafish 애벌레 Danio rerio 의 재생 용량 그들에 대 한 응답 상처 치유와 자라나1,2,,34검토 이상적인 모델 유기 체를 확인 합니다. 유전자 변형 zebrafish 라인과 zebrafish의 해부학 투명도 추가의 배열에 대 한 액세스 향상 장기 재생 프로세스4상처 응답 이벤트의 vivo에서 학문에 대 한 그들의 유틸리티. 따라서 고해상도 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이러한 생물 학적 과정의 연구는 생존 능력을 유지 하면서 높은 안정성과 제 브라 유 충의 최소한의 움직임을 허용 하는 라이브 이미징 zebrafish 장치를 요구 한다. 그것은 키 장치 허용 효과적인 부상 치유 하는 동안 재생 발생 장치에 의해 영향을 받지 않습니다.
라이브 영상 중 agarose에서 유 충을 포함의 표준 라이브 영상 안정화 방법 성장 제한 및 재생5 상처와 애벌레 4 후 심장 스트레스와 조직 괴 사의 기호를 표시 하기 시작 이후 사망률을 증가 시킬 수 있습니다. 시간4. 따라서, 관심 영역에서 agarose의 제거는 종종 정상적인 개발을 허용 하는 데 필요한 및 재생6, 애벌레는 agarose로 잠재적인 손상에 노출 버려야. 또한, 기술을 포함 하는 agarose와 사용자 해야 합니다 동양 짧은 시간에 애벌레는 agarose5,,67고형화 하기 전에. 신속 하 게 사용자의 요구 뿐만 아니라 유 충을 조작, 그것은 또한 유 충에 손상을 위험. 라이브 영상에 대 한 유 충을 안정화 하는 방법 등이 천 우물3 또는 divets8, 등 이러한 단점을 우회 하 설명 되었습니다 있지만 실리콘 진공의 사용 PVC 파이프 또는 기타 이미징 챔버를 만드는 그리스 자료6, 그리고 회전 튜브9를 이러한 방법의 많은 집중, 더러 워, 자주 재사용 노동 환경 조작에 대 한 허용 하지 않습니다 (약물 치료, 부상 등.) 물고기를 탑재.
따라서, zWEDGI 장치 (그림 1) 일부는 시료의 조작을 허용 하는 동안 zebrafish 애벌레의 장기 라이브 이미징 장착 한의 단점을 극복 하기 위해 설계 되었습니다. 로드, 구속, 부상 및 2 ~ 4 일 후 수정 zebrafish 애벌레의 이미징에 대 한 세 반 오픈 compartmentalized 챔버 (그림 1A) 허용 하는 zWEDGI에 의하여 이루어져 있었다. 장치입니다 (PDMS)에서 조작 이며 60 m m 유리 하단 이미징 접시의 커버 슬립에 배치. 그러나 여기에 제시 했다 위한 상처 치유 연구, 모듈형 설계 및 표준 제조 기술을 사용 하 여 만들 zWEDGI 디자인 수정 가능 하 고 다양 한 실험 절차, 특히 절차에 대 한 의무가 있는 실험적인 조작 및 장기적인 이미지와 최소한의 자제를 요구 한다.
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Protocol
참고: 기본 zWEDGI 디자인 2 ~ 4 일 후 수정 (dpf)와 매디슨 위스콘신 대학 연구 동물 자원 센터의 지침에 따라 zebrafish 애벌레에 대 한 공식화 했다.
1. 디자인 및 3D 인쇄의 금형
원하는 형상 및 3d 모델링 소프트웨어 5 특성 장치- 모델은 PDMS 구성 요소. 빈 형과 PDMS 부품의 어셈블리를 만들고 PDSM 부분에 해당 하는 금형에는 구멍을 만들어 PDMS 부분에 대 한 부정적인 형을 생성 합니다. 금형 ( 그림 2, 단계 1.1) 3D 인쇄는.stl 파일로 저장.
참고: 금형 디자인 여기에 제시 된 ( 그림 1) 스테레오 리소 그래피 형식 (.stl) 파일은 https://morgridge.org/designs/에서 다운로드할 수. - 인쇄 금형 photopolymer 3D 프린터 ( 그림 2, 단계 1.2)을 사용 하 여. 여러 개의 금형을 만들어 단일 인쇄에 가능 하다 면, 그래서 더 이상의 장치 주조 될 수 있다 PDMS의 단일 일괄 처리로.
참고: 예제는 0.075 m m 빔 직경 및 0.05 m m 층 두께, photopolymer 수 지 5를 사용 하 여 고해상도 모드에서 인쇄 했다.- 깨끗 한 금형을 부드럽게 문질러 제거 uncured 수 지 좋은 브러시, 스프레이 병, 그리고 압축 공기에서 변성 된 알콜을 사용 하 여. 아닌 지역에서 모든 자료를 제거.
- Uncured 사임 zebrafish 애벌레 10 독성으로 양쪽에 60 분 동안 UV 게시물 치료 장치에 금형을 치료 후.
- 모든 씰링 표면을 사 포 (채널 형상 및 금형 경계 로드) 접촉까지 평평한 표면에 200 그 릿 샌드 페이퍼로 금형의 캐비티 쪽 모래. 가볍게 모래 종이로 400 및 600 모래 모래, 점차적으로, 부드러운 플러시 표면 ( 그림 2, 1.3 단계) 모든 형상 향함에 걸쳐 생산 하. 설계 깊이 가까이 있는지 확인 하는 다이얼 표시기와 사 포 후 구멍의 깊이 측정 합니다.
- 금형을 청소 하 고 또는 실행 물 아래 홍 조는 초음파 청소기 30 분 물으로 채워진에 배치 하 여 디스크 (¼ 인치 두께 붕 규 산 유리 또는 아크릴 x 1 ¾ 인치 직경, 한 유리 형 당 커버) 커버.
- 압축 공기 건조 날 려 두 금형을 청소 하 고 이소프로필 알콜와 필터링 된 압축 공기 커버. 공 수 파편에서 오염을 최소화 하기 위해 장치를 조작 하는 곳으로 깨끗 한 벤치를 사용 합니다. 두고 청소 금형과 유리 커버 깨끗 한 벤치 또는 필요할 때까지 덮여 페 트리 접시.
2. ZWEDGI 장치의 PDMS 제조
- 붓는 184에 의해 확인 된 PDMS 실리콘 탄성 중합체입니다 (PDMS) 5:1 (기본 활성기를) 플라스틱 컵으로 비율에서. 빵 반죽 처럼, 자체에 이상 젤 감동 나무 공예 막대기로 2 분 동안 잘 혼합. 5 금형 기지의 고 활성의 2 세대 10 g 사용 하 여.
- 드 가스 혼합물 25-45 분 동안 진공 desiccator에 모든 거품이 사라 때까지.
- PDMS 몰드를 약간 초승달 모양 ( 그림 2, 단계 2.1)와 오버플로 때까지 10 mL 주사기를 사용 하 여의 약 0.75 mL 각 3D 인쇄 된 금형의 캐비티를 채울.
- 드 가스 채울 때 형성 수 있습니다 추가 거품 제거 45 분 채워진된 금형.
- PDMS 가득 금형 위에 유리 커버 디스크 적용, ( 그림 2, 단계 2.2) 갇혀 각도 거품을 방지 하기 위해 디스크를 누르고. 디스크 커버 유리 적용 되어 퇴 학 초과 PDMS 허용.
- 사용 금형에 단단히 커버 디스크를 작은 래치 드 클램프.
참고:이 PDMS은 치료 하 고 3D 인쇄 형상 유리 커버 슬립을 플러시는 구멍을 통해 생산 평평한 표면을 만듭니다. 또는 한 번에 완 치 될 수 있는 장치 수를 늘리려면, 구축 멀티 클램프 장치 (예를 들어. 그림 2, 단계 2.3). - 는 PDMS 장치 100 o C 오븐에서에 클램핑 된 금형에 90 분 ( 그림 2, 단계 2.4)에 대 한 치료. 금형을 오븐에서 제거 하 고 쉽게 처리할 수 있습니다 때까지 시원한를. 클램핑 장치 금속 인 경우에, 금속 치료 PDMS 잔여 열 때문에 계속 하지 않도록 클램프에서 형과 커버 디스크 어셈블리 제거.
참고: 장치는 아직도 약간 따뜻하고 완벽 하 게 치료 하는 동안 금형에서 제거 하는 가장 쉬운. 그러나, 일단 금형 오븐에서 제거 하 고 커버 디스크 제거, 장치 demolding를 진행 하기 전에 며칠에 앉을 수 있습니다. 경우 장치는 경화 오븐에서 제거 직후 demolded는, 그것을 완벽 하 게 치료를 하면서 오염 물질을 최소화 하기 위해 덮여 페 트리 접시에 배치.
3. 유리 접시 플라즈마 결합 zWEDGI
- 클램프 형 벤치 악에서 PDMS 장치를 포함 하 되도록 금형 ' s 형상 직면 하 고, 병렬 작업 역 벤치에.
- 시작 평면 밀고 핀셋을 사용 하 여 금형에서 PDMS 당김 탭을 해제 하 여 PDMS 장치를 제거 하려면. (( 그림 2, 단계 3.1) 팬에서 케이크를 제거) 처럼 핀셋으로 금형의 둘레의 주위에 일.
- 사용 압축 공기 및 핀셋 부드럽게 당김 탭을 잡고 장치에서 공기를 불어 하는 금형 장치를 필터링. 작업 천천히, 수 있도록 공기 별도 금형에서 PDMS, 얇은 터널 섹션 주위는 핀셋의 끝으로 특별 한 돌.
- 금지 터널 웨지 ( 2 그림, 3.2 단계) 플라스틱 만지고 있다 그래야 유리 바닥된 접시의 커버의 안쪽에 거꾸로 PDMS 장치 장소.
- 는 거꾸로 zWEDGI와 해당 유리 바닥된 접시 접시 커버에 자리는 플라즈마 청소기 내부 유리 위 ( 그림 2, 단계 3.3).
- 플라즈마 챔버 압력 500 mTorr에 도달할 때까지 청소를 철수.
- 세트 높은 무선 주파수 (RF) 전력. 장치를 노출 하 고 약 2 분에 대 한 RF 주파수로 접시 천천히 드 챔버 압력에 그리고 반환 장치 및 접시는 클린 룸 후드.
- 접시 커버에서 PDMS 장치를 제거. 족집게의 백 엔드를 사용 하 여 신중 하 게
- 유리 하단 접시 ( 그림 2, 3.4 단계)의 센터에 그것을 배치 하 여 유리에 올바른 방향 PDMS zWEDGI 이상의 플립, 가볍게는 PDMS에 눌러 공기 방울 되도록 장치 하지 아래 갇혀 있다. 마이크로 채널의 분 형상 주위 압력을 적용 하 고 ( 그림 5C) 가장자리에는 PDMS 부드럽게.
참고:는 PDMS와 유리 사이의 완벽 한 접촉 플라즈마 결합에서 더 좋은 준수를 보장합니다. ZWEDGI 장치는 플라즈마 유리 바닥 6 잘 같은 다른 바닥 유리 접시 형식에 보 세 수 있습니다.e ( 그림 2C). - 클린 룸 후드에서 제거 하기 전에 장치 접시 커버 장소.
참고: 장치 유리 수정 되었습니다, 일단 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 그들은 사용 하기 위해 준비가 될 때까지.
- 유리 하단 접시 ( 그림 2, 3.4 단계)의 센터에 그것을 배치 하 여 유리에 올바른 방향 PDMS zWEDGI 이상의 플립, 가볍게는 PDMS에 눌러 공기 방울 되도록 장치 하지 아래 갇혀 있다. 마이크로 채널의 분 형상 주위 압력을 적용 하 고 ( 그림 5C) 가장자리에는 PDMS 부드럽게.
4. 채널 준비 및 로드 애벌레
참고: 일반 zebrafish 축산은 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html에서 온라인 Zebrafish 책, 사용할 수 당 실시 했다. 성인 제 브라와 배아 1 위에서 설명한 대로 유지 되었다. 야생 타입 AB 변형 사용 되었다. 기관에 따라 ’ 라이브 애벌레 이미징에 대 한 요구 사항에 관한 구체적인 동물 관리 프로토콜 s.
- 린스는 micropipette는 접근 금지를 통해 린스를 사용 하 여 채널당 100 µ L 70% 에탄올의 최소 채널 터널. 에탄올과 2 또는 3 배 두 배 증류수 린스를 제거 합니다. 건조 공기에 있습니다.
- 접시의 유리 coverslip 애벌레의 준수를 최소화 하기 위해 실 온에서 10 분 (물에 희석 하는 1%의 농도)에 탈지 우유와 함께 채널을 채우기. 그런 다음, 부드럽게 여러 번을 씻어 두 배 증류수에 장치 잠수함. 수 있게 공기 건조 거꾸로.
참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. ZWEDGI 장치의이 준비는 사용 하기 몇 일 전에 할 수 있습니다. 스토어 실 온에서 커버. - 준비 1% 낮은 녹는 포인트 100 µ L 2와 100 µ L 2% 녹아 LMP agarose를 결합 하 여 (LMP) agarose E3 버퍼 11에 x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine-에틸 3-aminobenzoate) 미리 예 열을 38 o c. 1% 유지 38 o C 고 방지 하기 위해 뜨거운 블록에서에서 agarose/tricaine 솔루션.
참고: multiphoton 현미경 11 (예: 캐스퍼 12) 취소 안료 zebrafish 변종 중 하나를 사용 하 여 또는 0.2 m m N-phenylthiourea 색소 형성을 방지를 포함 하는 e 3에서 애벌레를 유지 가까운 적외선 파장의 색소에 의해 흡수를 최소화 하기 위해 11.
주의: N-phenylthiourea 독성이 있다. 기관에 따라 ' 처리에 대 한 s 규칙. - Anesthetize 애벌레 E3에서 버퍼 포함 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11. 애벌레는 움직이지 않는 비 접촉 자극에 응답 될 때까지 기다립니다.
- 사전 Tricaine/e 3의 약간 microliters와 채널 젖은.
- 선택 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 하나의 유 충을
- . 로드 채널 ( 그림 3A)에 애벌레를 입금. 지 면 로드 챔버와 금지 터널 ( 그림 3B)으로 꼬리 얼굴 똑바로 가장자리는 로드 챔버에 유 충을 동양 피 펫 팁 또는 유사한 도구를 사용 하 여.
- 신중 하 게 접근 금지 터널 ( 그림 3C) 흘러 유 충을 허용 부상 약 실에서 액체를 철회. 유 충 ( 그림 3D) 주위 수 분을 유지 하면서 액체의 대부분을 제거 합니다. 이 프로세스는 부상 챔버 쪽으로 약간 접시를 기울이기로 지원 수.
5. 부상 및 이미징 애벌레
- 는 꼬리 지 느 러 미 ( 그림 3 G, H) 부상 챔버에서 notochord 11 후부 transect 살 균 메스 블레이드를 사용 하 여. 필요한 경우 추가 tricaine/e 3를 추가 하 고 문화 접시 뚜껑 교체.
참고: 또는, 관심의 발달 시간대에 따라, 애벌레 부상, E3에서 복구 수 고 수 원하는 영상 시간, 어떤 시점에서 그들은으로 채널에 로드 될 수 있습니다 때까지 인큐베이터 (28.5 o C)에서 유지 위에서 설명한. - 60 m m 유리 하단 접시를 수용할 것 이다 단계 삽입에는 거꾸로 한 현미경에 애벌레를 마 취를 zWEDGI 장치를 설치 합니다. 원하는 위치에 꼬리를 얻을 하는 데 필요한 접시를 회전 위 대부분 채널에서 유 충의 꼬리를 찾습니다. 특정 실험에 필요한 이미지.
참고:는 zWEDGI widefield 형광과 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 포함 하 여 고해상도 가벼운 현미경 검사 법에 대 한 광범위 하 게 적용 됩니다. Zebrafish 애벌레, 이미징 때 매개 변수 고려 수 있다 하지만 특정 매개 변수를 이미징 악기, 샘플 및 종속 실험. 여기, 애벌레 꼬리는 다음 매개 변수를 활용 하 여 사용자 지정 빌드 multiphoton 현미경 5 , 11에 몇 군데: 긴 작업 거리 물 침수 목표, 890 nm 레이저 여기, X 40 445/20 nm 방출 필터 및 512 x 512 해상도.
6. 실험의 끝
- 제거 현미경에서 zWEDGI 접시. 얼음 물 목욕 또는 4 o C 적어도 20 분 동안에 zWEDGI를 배치 하 여 애벌레를 안락사 하 고 하트 비트 및 순환의 부재에 대 한 평가.
참고: 애벌레 별도 구획에 유지 되므로, 애벌레 복구할 수 있습니다 개별적으로 겸 자 또는 피 펫으로는 agar를 살짝 당겨. 한 머리 및 유 충 항 체 얼룩이 지기에 대 한 고정 등 추가 절차에 대 한 사용 또는 RNA 또는 단백질 추출에 대 한 처리에서 제거할 수 있습니다. - 애벌레와 agar의 제거, 다음 에탄올 zWEDGI 청소와 증류수, 4.1 단계에서 설명한 대로 설정 거꾸로 공기 건조. 스토어 건조 위치에 덮여. 다음 사용 하기 전에 필요에 따라 다시 코트 탈지 우유 (4.2 단계)로.
참고: zWEDGIs 다시 사용할 수 있는 여러 번은 PDMS 유리 떨어져 올 때까지.
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Representative Results
ZWEDGI PDMS 미세 장치 관련 된 부상 치유 그리고 zebrafish 애벌레에서 자라나는 꼬리 지 느 러 미의 라이브 영상 (아래)의 주요 기능 4 개를 수용 하도록 설계 된 기능 compartmentalized 장치가 이다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있기 때문에 그리고 업계 표준 금형에서 잘 작동 뿐만 아니라 생체 적합성, PDMS zWEDGI 제작을 위해 선택 되었다. 또한, PDMS 만드는 장치 재사용 가능한 하드 또는 날카로운 모서리의 무효 장치 형성 되 면. zWEDGI 특별히 이미징, 3)의 꼬리 지 느 러 미, 그리고 4) 현미경 이미징, 부상에 대 한 적절 한 방향에서 1) 장치에 애벌레, 2) 자제의 로드를 허용 아래에서 상세히 설명.
로드
ZWEDGI 디자인 3 채널의 구성, 각 (그림 1B) 한 유 충을 억제 하도록 설계 되었습니다. 유 충의 로드 및 초기 방향 오픈 로드 챔버 유 충 (그림 3A) 입금에 대 한 큰 오리 피스 피 펫 팁에 맞게 폭 3 mm (그림 1A)입니다. 또한, 길이 폭 금지 터널 쪽으로 꼬리와 지 느 러 미 위쪽 (그림 3B)와 올바른 방향으로 유 충의 후속 조작을 허용 하도록 충분 한 공간을 제공 합니다.
구속
한 유 충은 채널에 로드 되는, 부상 상공에서 액체의 제거에 의해 금지 터널에 그려진 꼬리 먼저 하거나 부드럽게 피 펫 팁 또는 비슷한 도구 (그림 3C) 곳으로 찔 러 수 있습니다. 0.45 m m, 3mm에서 로드 챔버 (그림 1A), 깔때기 모양의 형상을 원하는 측면 방향 (그림 3C)으로 유 충을 안내합니다. 이미지 개선의 측면에 유 충의 방향 약 선 요리의 유리 바닥으로 꼬리 멈출. 미세 소자는 실리콘 웨이퍼를 사용 하 여 만든, 달리 3D 인쇄 된 금형의 형상 될 필요가 없습니다 z 방향에서. 따라서, 금지 터널은 보상과 항목 높이 0.5 m m ~ 0.3 m m 높이 (그림 1B, 터널의 아이소메트릭 뷰) 출구 보다는 z 축에 테이퍼. 이 끝이 유 충의 지도 및 이미징 표면 커버 유리를 향해 꼬리의 병합을 지원 합니다. 이 기능은 견본은 agarose는 강화 하는 사용자에 대 한 필요가 없다.
유체 로드 챔버 (그림 3D)에서 제거 되 고 꼬리는 부상 챔버 (그림 3E)에 억제 버퍼를 유지 하는 동안 채널 내의 머리를 안정 시키기 위해 낮은 융 점 agarose로 대체 됩니다. 접근 금지 터널을 통해 누설 수 있습니다 최소한의 agarose 부상 챔버 (그림 3 층)에서 쉽게 제거할 수 있습니다. Agarose 부상 챔버에의 부족 억제 자라나 고 꼬리 지 느 러 미5의 개발을 허용합니다.
부상
한 유 충 터널과 agarose에 의해 제 지 하는 머리를 통해 로드 되는, 꼬리 지 느 러 미는 transection 사용할 수 부상 챔버로 밖으로 juts 때문입니다. 세미 원 부상 챔버 수평 대칭에서 1.9 m m은 오프셋입니다. 이 메스 블레이드 꼬리 지 느 러 미, 꼬리 지 느 러 미 (그림 3G) transecting 꼬리에서 아래로 얻을 수 블레이드에 대 한 충분 한 공간이 바로 위에 삽입할 수 있습니다. 7 m m 직경 세미 원의 넓은 부분 꼬리가이 모션에 맞게 부상가 발생 합니다. 유 충을 상처를 사용자 수 있도록, 뿐만 아니라이 한정된 디자인 꼬리 지역5에 화합물의 지역 적용에 대 한 기회를 제공 한다. 세미 분리의이 독특한 기능 상처 치유 과정에 다양 한 약물, 화학 물질, 또는 생물 학적 에이전트의 효과의 지역화 테스트에 대 한 수 것입니다.
이미징
ZWEDGI 장치의 목표는 높은 해상도 허용 하는 현미경 이미징 agarose를 포함 하 여 한 시 빨리 벗어나게 zebrafish 꼬리 핀의 빛. 이러한 이유로, PDMS 장치는 높은 NA 렌즈를 사용 하 여 현미경 검사 법에 대 한 광학 품질 표면의 제공 하는 상용 유리 하단 요리에 보 세. 여기 우리는 zWEDGI의 이미징 기능을 설명 하기 위해 꼬리 지 느 러 미의 콜라겐 섬유의 제 2 고조파 (SHG) 이미징 multiphoton 현미경을 사용 하 여 이미지를 제시. 그러나, 방법 다른 가벼운 현미경 검사 법, confocal 현미경 검사 법을 이용 하는 거꾸로 한 현미경 스테이지 구성 등은 zWEDGI는 적용할 수 있습니다. Agarose 후속 제거 포함의 메서드와 달리 zWEDGI와 꼬리 지 느 러 미 수 쉽게 될 몇 군데 (그림 4A), 즉시 후 상처에 대 한 현미경을 반환 장치 내에서 부상 부상 이전 장치에 이미지 (그림 4B-E)입니다. 이전 작업 확인 SHG를 사용 하 여 상처 치유 과정 중 콜라겐 섬유 조직에 변화. 13 SHG는 특정 유형의 세 레이블 사용 하지 않고 원 교원 질을 포함 하 여 정렬 된 구조를 검출 하기 위하여 사용할 수 있습니다. 14 이미지 품질은 생활 꼬리 지 느 러 미는 zWEDGI에 몇 군데의 고정된 조직5 는 zWEDGI에서 얻은 비슷 했다 다양을 한 장점 제공 합니다. 가장 중요 한 것은, 꼬리 지 느 러 미 치유와 자라나 unhindered agarose 억제5성장 하는 애벌레의 애벌레 생존을 포함 하 여 진행할 수 있습니다. 또한, 부상 유 충 장치에 있는 동안 수행할 수 있습니다, 때문에 사전 및 사후 부상 이미지는 동일한 꼬리 지 느 러 미 (그림 4A)에 수집할 수 있습니다. zWEDGI 기질 (그림 4B)의 구조에서 발생 하는 동적 변경의 더 완전 한 보기를 제공 시간이 지남에 3 차원 데이터의 수집을 허용 합니다. 여기 그림은 SHG 섬유 상처 휴식, 3 차원에서 다음는 zWEDGI 내에서 부상. 부상, 전에 SHG 콜라겐 섬유 (그림 4A) 지 느 러 미 끝에는 notochord에서 바깥쪽으로 방출 발견 했습니다. 계약된 지 느 러 미의 끝 및 일의 중심 사이의 거리를 부상 직후전자 지 느 러 미 상처 휴식으로 증가합니다. 데이터 컬렉션의 3D 자연 공간 개조, Imaris 같은 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 허용 합니다. 이러한 복원 및 후속 회전 옵션 설명 수축와 이미지 모음 (그림 4 B, C, D)의 x y 평면 뿐만 아니라 z 축 (그림 4에서에서 발생 하는 지 느 러 미의 휴식 G J, L O Q-T; 추가 영화 1, 2) 꼬리에로 서 계약의 위쪽으로 컬에서 병합합니다. zWEDGI 24 h5에 꼬리 지 느 러 미 개발 하는 동안 이미지 신경에 confocal 현미경 검사 법의 사용과 같은 더 긴 기간 동안 다른 이미지 형식으로 사용할 수 있습니다. 장치의 금지 단위 줄지어 있다 병렬, 애벌레, 찾을 때 장치를 회전 하려면 필요 하기 때문에 현미경을 설정 하 고 이미지에 대 한 여러 표본 간의 이동는 간단 하 고 수집을 자동화 될 수 있다 여러 애벌레의 시간 경과 이미지 데이터입니다. 몇 군데 수 샘플의 수를 확장 하려면 PDMS zWEDGI 장치 6 잘 플레이트 (그림 2C)와 같이 다른 유리 바닥 형식으로 놓일 수 있다.
그림 1 : 최종 디자인 개략도 (A) 일반적인 레이아웃 및 강조 기능 compartmentalized 챔버의 용어 zWEDGI 장치의 측정 회로도 (B) PDMS 장치 형에서 제거의 아이소메트릭 뷰. (C) 삽입이 보여줍니다 터널 입구와 출구 높이에 변화를 강조. 장치에서 절제 하는 유 충의 (D) 모델. 그림에서 수정 된 이전 기사5 Zebrafish 저널 무단 전재 허가 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 제조 개략도 (A) 1 단계는 3D 모델링 소프트웨어 (1.1)은 다음 3D 인쇄 (1.2)에 있는 장치 형의 디자인으로 시작 합니다. 금형은 자외선 치료 하 고 모래 청소 그래서 제기 기 하 도형도 높이 (1.3). 단계 2 혼합 및 degassed PDMS (2.1)와 금형을 작성 하 고 장치 PDMS (2.2)에서 트랩 공기 거품을 방지 하는 경사에 금형 유리 디스크 적용 포함 한다. 유리와 금형 채워 오븐 100oC에서 적어도 한 시간 (2.4)에 대 한 치료에 대 한 함께 (2.3). 3 단계 몰드 (3.1)에서 PDMS 장치를 제거 하려면 필터링 된 공기 및 평면 밀고 핀셋을 사용 합니다. 장치 이미징 접시 뚜껑 (3.2) 위에 배치 됩니다 하 고 플라즈마 처리 (3.3), 유리 바닥의 유리 바닥 접시 (3.4)에 PDMS 있도록 함께. (B) 완성 된 zWEDGI 장치 이미지 사용에 대 한 준비와 유리 하단 접시에 보 세. (C) 다중 zWEDGI 장치 놓일 수 있다 유리 하단 6 잘 플레이트에 동일한 실험에서 많은 애벌레 이미지 순서. 그림에서 수정 된 이전 기사5 Zebrafish 저널 무단 전재 허가 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 로드 및 zWEDGI (A)에 있는 애벌레의 부상 유 충은 넓은 구멍 피 펫을 사용 하 여 로드 챔버에 로드. (B) 유 충은 로드의 평평한 부분에 대하여 등 쪽 방향 퍼 널 및 금지 터널 쪽으로 꼬리를 챔버. (C) 피 펫 팁에서 흡입을 사용 하 여 개최 입구 부상 챔버에 유 충 이미징에 대 한 올바른 방향에 배치 하는 터널으로 그려집니다. (D) 액체 (E) 에 대 한 유 충을 안정 시키기 위해 머리 지역 agarose의 추가 수 있도록 로드 챔버에서 제거 됩니다. Agarose는 데모 용도로 여기 컬러 레드. 최소한의 agarose 및 부상 챔버로 누출 (F)와 같이 쉽게 제거 될 수 있다. ( G) 일단 유 충은 채널에 절제 된 상처, 메스 블레이드 유 충 위에 삽입 그리고 아래로 꼬리 지 느 러 미, 후부는 notochord 걸쳐 슬라이스. (H) 유 충은 후 상처 이미징에 대 한 준비. (A-H) 바 규모 = 1 밀리미터; (F) 바 규모 = 1 밀리미터; (G) 바 규모 = 1 m m.에서 수정 그림 한 이전 기사5 Zebrafish 저널 무단 전재 허가 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 3D multiphoton 시간 경과 zebrafish 꼬리 지 느 러 미, 사전에 SHG 섬유의 이미징 및 포스트는 zWEDGI에서 부상. 고해상도 이미징 기능을 제공 하는 zWEDGI 디자인,이 경우의 SHG 섬유 조직 (미리 상처) 이전 및 다음 꼬리 지 느 러 미 transection (포스트 상처). 데이터는 4 분 간격으로 z-스택 수집 했다. (A-E) z-스택, 이전 및 4 개의 간격 후 transection에의 투영으로 꼬리 지 느 러 미에 섬유의 SHG를 보여줍니다. Z-프로젝션 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 15 t = 0의 이미징, 약 20 분 후 transection 시작 했다. 이중 화살표는 초기 수축에 따라 상처의 휴식 동안 notochord (길고 흰 선)의 위치에 상대적인 상처 가장자리 (짧은 흰색 라인)의 팁의 거리에서 증가 나타냅니다. (F-J). 원래 데이터의 3D 개조를 기울이면된입니다. (K O). F-제이에 표시 된 기울이면된 3D 재구성의 표면 렌더링 (P-T)입니다. 수축과 이완이 데이터로 평가 될 수 있다 3 차원 공간에서 발생 하는 방법을 보여주는 3 차원 재구성 표면 렌더링의 사이드 뷰는 zWEDGI 꼬리 지 느 러 미 agarose에 의해 제약 되지 않습니다 사용 하 여 수집. (A-E) 바 규모 = 100 미크론; (F-T) 바 확장 =100 미크론입니다. 3D 렌더링 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 수행 했다. 추가 영화 1과 2를 참조 하십시오. 그림에서 수정 된 이전 기사5 Zebrafish 저널 무단 전재 허가 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : ZWEDGI 제작 (A)의 중요 한 단계 없는 거품 형태로 보장 또는 때 유리 디스크에 클램핑 장치에 갇혀, PDMS는 금형에 작성 후 드 고 클램핑 유리 금형에서 PDMS에 적용할 때 경사. 또한, 로드 하는 동안 "깜박임"에서 PDMS를 방지 챔버, 부상 하 고 있는지 철저 하 게 보장 하기 위해 장치의 상단을 모래는 형상의 표면은 플러시 때 유리에 클램핑. (B) 장치는 오븐에서 충분히 완 치, PDMS와 금형 사이의 공기 주머니 표시 장치 제거 쉽게 될 것입니다. 장치를 쉽게 제거 하지 않습니다, 그것은 가장 가능성이 부족 한 치료 시간이 또는 온도 나 금형 자체 아니었다 적절 하 게 UV 치료, 결과 PDMS의 잔여 수 지 오염에. (C) 플라즈마 처리 후 유리 하단 접시에 장치를 적용, 핀셋, 터널 지역에서 시작 하 고 장치의 가장자리를 향해 밖으로 작동의 백 엔드 가벼운 압력을 적용. 장치 장치와 유리 사이의 공기 주머니에 의해 표시 된 대로 잘 접착 하지 않는 플라즈마 성에 시간을 길게 하 고 PDMS와 유리 표면 사이 먼지 거기 확인 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1: 휴식 후 부상 하는 동안 꼬리 지 느 러 미에 SHG 섬유의 multiphoton 시간 경과 이미지의 3 차원 표면 렌더링을 기울이면. 부상 후 시간이 지남에 따라 zstacks로 몇 군데 꼬리 지 느 러 미에 섬유의 SHG (영화의 시작은 부상 후 약 20 분)는 zWEDGI에서. Z-스택을 재구성 했다 고 표면 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 렌더링. 꼬리 기울어져 3 차원 보기를. 앞쪽 왼쪽입니다. 영화 스틸 이미지 그림 4 (K-O)에 해당합니다. 눈금 막대 = 50 미크론. 는 영화를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2: 휴식 후 부상 하는 동안 꼬리 지 느 러 미에 SHG 섬유의 multiphoton 시간 경과 이미지의 3 차원 표면 렌더링의 측면 보기. 부상 후 시간이 지남에 따라 zstacks로 몇 군데 꼬리 지 느 러 미에 섬유의 SHG (영화의 시작은 부상 후 약 20 분)는 zWEDGI에서. Z-스택을 재구성 했다 고 표면 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 렌더링. 측면 보기 동적 변화는 z 축에서의 캡처를 강조 하기 위해 표시 된. 앞쪽 왼쪽입니다. 영화 스틸 이미지 그림 4 (P-T)에 해당합니다. 눈금 막대 = 40 미크론. 는 영화를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
ZWEDGI 장치의 목적은 안정화와 고해상도 현미경 목표의 작은 작업 거리 물고기 방향을 이미징 3D 시간 경과 잡으려고. 이러한 설계 사양을 충족 하는 동안 그것은 또한 개선 라이브 이미징에 대 한 전통적인 천 기반 준비 에입니다. 제대로 하지 발생할 수 있습니다 결함이 있는 장치는, zWEDGI의 제작에는 3 개의 중요 한 단계 (아래 참조) 있습니다.
PDMS 준비 (그림 5A)
거품 방지, PDMS 추가 된 후 금형을 드. 모든 거품 기체 제거 후 제거 되었습니다 확인 하는 유리 디스크의 응용 프로그램에 주의 지불 합니다. 유리 디스크 공기는 되지 트랩 되 고 있음을 아래와 PDMS 되도록 경사에 적용 되어야 합니다. 먼지 과정의 대부분 단계 중 문제가 될 수 있습니다. 먼지를 방지 하려면 철저 하 게 청소 각 단계를 완료 하 고 단계 사이의 깨끗 한 후드 부분을 저장 합니다. UV 경화 전에 거친 표면을 만들 수 있는 과잉 수 지에 대 한 금형을 확인 합니다. Sanding 때 모래 종이 연락처 모든 표면 수 있도록 모든 구조는 (그림 2, 1.3 단계) 플러시 되었는지 확인 합니다. 항상 이소프로필 알코올로 청소 하 고 바로 PDMS와 금형을 작성 하기 전에 공기. 금형 추가 PDMS를 당기고 때 확인는 클램프 단단히 금형을 보유 하 고 함께 커버 유리 (그림 2, 단계 2.3).
몰드 (그림 5B)에서 장치를 제거
확인 오븐은 100 이상 o C와 치료 시간 적어도 1-1.5 h입니다. PDMS은 충분히 치료 하지, 그것은 금형에서 제거할 어려울 수 있습니다. 다른 가능성을 제거 하는 실패에 대 한 자료와 경화제 또는 3D 인쇄는 다음는 PDMS 오염 후 금형에 남은 남은 수 지의 잘못 된 비율을 사용 하 여 충분히, PDMS 약을 혼합 하지 포함 됩니다. 오븐에서 제거, 시 형 (그림 5B)와 공기 주머니 장치 쉽게 제거 될 것 이다 나타냅니다.
유리 바닥 접시 (그림 5C) PDMS의 준수
유리 접시에 불 쌍 한 부착 먼지, 부정합, 또는 플라즈마 처리의 부족 한 길이에서 발생할 수 있습니다. 유리에 장치를 배치할 때 각도에서 요리 팁 그리고 센터 그것 다는 것을 확인 하는 유리 원형에 PDMS 우물의 가장자리를 만지지 않는다. 장치를 준수 하지 않는 경우 핀셋, 섬세 한 터널 지역에서 시작 하 고 바깥쪽 가장자리에 누르면의 백 엔드 신중 하 게 유리 슬립에 장치를 누릅니다. 장치가 여전히 준수 하지 않습니다, 1 분 단위로 청소기는 플라즈마에 시간을 증가 하 여 실험.
애벌레 수 천, 장기 라이브 이미징 꼬리 지 느 러 미 지역 목적을 위해 사용 하지 않고 시간 (분)의 짧은 기간에 대 한 장치에 몇 군데 될 동안 한 천 물고기 로드 된 후 로드 챔버에 머리에 배치 됩니다. Agar의이 응용 프로그램은 상처 치유 응답 또는 애벌레5의 생존 능력에 영향을 미칠 나타나지 않습니다, 하지만이 애벌레의 더 앞쪽 영역의 연구 충격 수 있습니다. 우리 이미지 애벌레 최대 60 h에 대 한 수 있다 비록 우리 하지 생존 더 이미징 시간 영향 될 것 이라고 여부 조사가 있습니다. 또한, 여기에 제시 된 특정 디자인 나이 2 ~ 4 일 게시물 수정 (dpf) 애벌레 꼬리 transection 및 상처 치유 이미징에 대 한 그들의 측면에 누워 위해 최적화 되었다. 다른 발달 단계, 방향 및 실험 프로토콜 디자인을 변경 해야 합니다. 그러나, 디자인의 의도적인 기능 모듈화를 하면 쉽게 그러한 변경 의무가 있습니다.
또한,이 소자의 제작 3D 프린터 및 다른 미세 재료 및 장비, PDMS 등 청소기, 잠재적으로 일부 사용자에 게 장치에의 접근을 제한 하는 플라즈마에 대 한 액세스를 필요 합니다. 그러나, 금형 제조의이 방법 때문에 3D 인쇄 기능, 마이크로 제조, 함께 대학 캠퍼스에 더 널리 되 고 있다 선정 되었다. 또한, 3D 기술이 빠르게 개발로 사용할 수, 인쇄 및 프린터 감소의 비용에 대 한 서비스 공급자입니다.
Compartmentalized 디자인과 기능을 감안할 때는 zWEDGI agar 포함을 사용 하 여 시간 경과 이미지 컬렉션에 대 한 현재 기술 개선을 제공 합니다. 첫째, agarose 꼬리 지역 zWEDGI, 상처 치유 및 진행 억제에 재생을 허용 하는 애벌레는 zWEDGI에서의 생존은 임베디드 라는 컨트롤5를 비교 하는 동안에 주위 하지 않습니다. 둘째, 금형 제작을 고해상도 3D 인쇄를 사용 하 여 3 차원 영상 평면을 기준에 유 충 하 고유 경사진 형상을 zWEDGI 수 있습니다. 이 적절 한 방향에 애벌레는 agar 견고로 조작의 시간 종속성을 제거 합니다. 제 3 중요 한 zWEDGI 디자인의 혜택은 오픈 챔버 디자인은 꼬리와 머리 지역 실험적인 조작에 대 한 액세스를 허용 합니다. 이것은 연구, 치유 하는 상처에 대 한 특정 관심의 하지만이 또한는 zWEDGI 다른 조작에 대 한 잠재적으로 유용한 도구. 장치의 compartmental 디자인 게다가, 지역 동안 응용 프로그램 화합물의 실험에 대 한 기회를 제공 한다. 장치 세미 분리 (부상 실)에서 버퍼 및 (에 로드 챔버) agarose5, 상처 치유 또는 다른 생물학을 공부 하는 동안 화합물의 응용 프로그램을 수 있도록 보급 미분 때문에 꼬리에서 머리 처리합니다. 또한, 애벌레 별도 채널에 탑재 되어 있기 때문에 개별 유 충 확인 될 수 있다 고 RNA 또는 단백질 정화와 같은 추가 처리 또는 항 체 라벨 포스트 이미지 검색. 그리고 마지막으로, 때문에 장치가 유리 바닥된 접시에 접착 된 PDMS, 장치는 재사용 가능한 유 충 제거 되었습니다 일단.
앞으로 이동, 모듈형 설계 및는 zWEDGI의 제조의 용이성 됩니다 빌려 자체 잘 변경 된 기능에 대 한 수정. 현재, compartmental 형상 부상 및 이미징 실험 설명, 그것을 주는 상처 치유의 라이브 이미징에 대 한 광범위 한 응용 프로그램을 위해 특별히 만들어집니다. 그러나 유 충 (즉, PDMS), 이미징 방해할 수도, 아무 소재 유 충 및 이미징 표면 사이 존재 하는 유리에 직접 있다. 따라서, 트렁크, 함께 나누고 같은 애벌레의 다른 지역ld는 이미징에 대 한 액세스할 수 있습니다. 또한,는 zWEDGI의 3D 인쇄 형의 디자인 다른 발달 단계, 유 충과 다양 한 치료의 다른 방향에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 이러한 특성은 따라서 그것은 시간의 척도의 다양 한 이벤트의 시간 경과 현미경을 캡처에 대 한 유용한 도구를 확인 합니다. 다른 유리 하단 접시 형식의 사용 큰 PDMS 장치 및 더 많은 채널에 대 한 공간에 대 한 허용 됩니다. 다양 한 실험 프로토콜에 대 한 3D 인쇄 제조 기술 및 후속 수정 용이성 증가 접근을 감안할 때, zWEDGI는 높은 해상도 라이브 영상 현미경의 영역에서 강력한 도구가 될 수 증명할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 기본 프로젝트 자금 광학 및 전산 장비에 대 한 연구 및 실험실을 위한 Morgridge 학회에서 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 NIH # R01GM102924에서 자금 인정 (아와 KWE). KH, JMS, RS, 아 KWE 잉태와 설계 연구. KH와 JMS DL, KP와 RS에서 지 원하는 모든 실험을 수행. KH, JS, RS, 아와 KWE 원고 쓰기에 공헌 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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