Summary
Dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die is een verzuilde apparaat ontworpen bedwingen zebrafish larven te oriënteren. Het ontwerp staat staart transect en op lange termijn collectie van hoge-resolutie fluorescentie microscopie beelden van wondgenezing en regeneratie.
Abstract
De larve van de zebravis is een belangrijk model-organisme voor zowel ontwikkelingsbiologie en wondgenezing. Verder is de larve van de zebravis een waardevolle systeem voor live hoge resolutie microscopische beeldvorming van dynamische biologische fenomenen in ruimte en tijd met cellulaire resolutie. Echter kan de traditionele methode van agarose inkapseling voor levende imaging belemmeren larvale ontwikkeling en weefsel hergroei. Daarom dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die werd ontworpen en gefabriceerd als een functioneel verzuilde apparaat om te oriënteren larven voor hoge resolutie microscopie voorzien in de mogelijkheid caudal fin transect binnen het apparaat, de latere ongebreidelde staart ontwikkeling en de uitgroei. Dit apparaat voorziet verwonden en op lange termijn beeldvorming met behoud van de levensvatbaarheid. Gezien het feit dat de zWEDGI schimmel is 3D afgedrukt, de aanpasbaarheid van de geometrieën maken het eenvoudig aangepast voor uiteenlopende zebrafish beeldbewerkingstoepassingen. De zWEDGI biedt bovendien dat talloze voordelen, zoals toegang tot de larve tijdens experimenten voor verwonding of voor de toepassing van de reagentia, parallel oriëntatie van meerdere larven voor gestroomlijnde beeldvorming en herbruikbaarheid van het apparaat.
Introduction
Het regeneratieve vermogen van zebravis larven Danio rerio laten een ideale modelorganisme voor behandeling van de wond reactie evenals genezing en hergroei1,2,3,4. Toegang tot een array van transgene zebrafish lijnen en zebrafish de anatomische transparantie verder verbeteren hun nut voor in vivo studies van wond reactie evenementen evenals langere regeneratieve processen4. Studie van deze biologische processen met behulp van hoge-resolutie time-lapse fluorescentie microscopie daarom vraagt om een levende zebrafish beeldapparaat die voor een hoge stabiliteit en minimale bewegingen van de larve van de zebravis zorgt met behoud van de levensvatbaarheid. Het is de sleutel dat het apparaat zorgt voor effectieve verwonden terwijl genezing en regeneratie plaatsvinden niet beïnvloed door het apparaat.
De levende imaging stabilisatie standaardmethode voor het insluiten van de larve in agarose tijdens live imaging beperkt groei en regeneratie5 wond en sterftecijfers kan verhogen aangezien larven beginnen te tonen teken van cardiale necrose van de stress en weefsel na vier uur4. Daarom, verwijdering van agarose uit regio's van belang is het vaak nodig om normale ontwikkeling en regeneratie6, bloot de larven tot potentiële schade als de agarose is weggesneden. Bovendien moet de gebruiker met de agarose techniek te embedding, oriënteren van de larven in de korte tijd voordat de agarose5,6,7 stolt. Snel manipuleren van de larve vergt niet alleen de vaardigheid van de gebruiker, het ook risico's van schade aan de larve. Hoewel methoden te stabiliseren de larve voor levende imaging zijn beschreven om te omzeilen deze nadelen, zoals geribbelde agar wells3 of divets8, het gebruik van siliconen vacuüm vet maken een imaging kamer met PVC-buizen of andere materialen6, roterende buis9, veel van deze methoden zijn arbeid intensieve, rommelig, vaak niet herbruikbaar en niet is toegestaan om milieu te manipuleren (drug behandelingen, verwonding enz.) nadat de vis is gemonteerd.
Daarom werd het zWEDGI apparaat (Figuur 1) ontworpen om overwinnen enkele van de nadelen van agar montage voor lange termijn live beeldvorming van zebravis larven terwijl manipulatie van het monster toelaat. De zWEDGI bestaat uit drie halfopen verzuilde kamers (figuur 1A) toe voor het laden, terughoudendheid, verwonding en beeldvorming van 2 tot 4 dagen na bevruchting zebrafish larven. Het apparaat is vervaardigd uit Polydimethylsiloxaan (PDMS) en op de slip van de cover van een 60 mm glas onder imaging schotel geplaatst. Het hier gepresenteerde ontwerp was bedoeld voor wond genezing studies, maar het gebruik van een modulair ontwerp en fabricage van standaard technologieën maken het zWEDGI ontwerp halster en vatbaar voor een verscheidenheid van experimentele procedures, met name voor procedures die vereist minimale terughoudendheid met experimentele manipulatie en op lange termijn denkbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: het base zWEDGI ontwerp werd geformuleerd voor zebrafish larven die 2 tot 4 dagen na bevruchting (dpf) en volg de richtlijnen van de Universiteit van Wisconsin-Madison Research dieren Resource Center.
1. design en 3D printen van schimmels
- Model de PDMS component van het apparaat met de gewenste geometrieën en kenmerken in een 3D modeling software 5. Maak een assemblage van een lege mal en het PDMS deel en het genereren van een negatieve mal voor het PDMS deel door het creëren van een holte in de mal overeenkomt met het deel van de PDSM. Opslaan van de schimmel als een .stl bestand voor afdrukken in 3D ( Figuur 2, stap 1.1).
Opmerking: Het bestand met een stereolithography-indeling (.stl) van het ontwerp van de schimmel die hier gepresenteerd ( Figuur 1) is beschikbaar voor download op https://morgridge.org/designs/. - Print mallen met behulp van een 3D-printer van fotopolymeer ( Figuur 2, stap 1.2). Meerdere mallen maken in een afzonderlijk afdrukbaar, indien mogelijk, dus meer dan één apparaat kan worden gegoten met één enkele batch van PDMS.
Opmerking: Het voorbeeld werd gedrukt in Hi-Res modus met een 0.075 mm straal diameter en 0,05 mm laagdikte, met behulp van fotopolymeer hars 5.- Schone mallen met een fijne borstel, gedenatureerde alcohol in een spray fles, en samengeperste lucht voorzichtig schrobben en het verwijderen van niet uitgehard hars. Een materiaal verwijderen uit de microchannel-gebieden.
- Na het genezen van de mallen in een UV post genezen toestellen voor 60 min aan weerskanten als niet-uitgeharde ontslag giftig voor zebrafish larven 10 is.
- Zand van de kant van de holte van de mal met 200 grit schuurpapier op een vlakke ondergrond totdat alle afdichting oppervlakken in contact met het schuurpapier zijn (laden kanaal geometrieën en schimmel omtrek). Licht zand met 400 en 600 grit zand papier, geleidelijk, voor de productie van gladde flush oppervlakken over alle geometrie voering ( Figuur 2, stap 1.3). Meet de diepte van de holte na het schuren met een externe indicator om te verifiëren dat het ligt dicht bij de ontworpen diepte.
- Schoon mallen en betrekking hebben op schijven (1 ¾ inch diameter x ¼ inch dik borosilicaatglas of acryl; één glas dekken per schimmel) door te plaatsen in een ultrasone reiniger gevuld met water gedurende 30 minuten of door te spoelen onder stromend water.
- Blazen met perslucht droog en schoon zowel de mallen en dekt met isopropyl alcohol en gefilterde perslucht. Gebruik een schone bankje als een plaats te fabriceren de apparaten om te minimaliseren van verontreiniging van lucht puin. Laat de schoongemaakte mallen en glas dekt in de schone bankje of totdat het nodig is een overdekte petrischaal.
2. PDMS fabricage van zWEDGI apparaat
- maken het PDMS door gieten 184 silicone-elastomeer Polydimethylsiloxaan (PDMS) bij een verhouding van 5:1 (base aan activator) in een plastic beker. Meng goed gedurende 2 minuten met een houten vaartuig stok, roeren de gel over op zichzelf, zoals kneden brood. Voor 5 mallen, 10 g base en activator 2 g te gebruiken.
- Ambtshalve gas mengsel in een vacuüm exsiccator voor 25-45 min totdat alle bubbels verdwenen zijn.
- Vullen de holte van elk van de 3D gedrukte mallen met ongeveer 0,75 mL PDMS met behulp van een spuit van 10mL, totdat de mal loopt enigszins over met een meniscus ( Figuur 2, stap 2.1).
- De gas de gevulde mallen voor 45 min voor het verwijderen van extra bubbels die kunnen hebben gevormd bij het invullen van.
- Toepassing van een glas cover schijf bovenop de PDMS gevulde mal, te drukken op de schijf down onder een hoek om te voorkomen dat bubbels worden gevangen ( Figuur 2, stap 2.2). Toestaan van overtollige PDMS te worden uitgezet als de schijf glasdeel wordt toegepast.
- Gebruik kleine ratchet klem de cover schijf strak vasthouden aan de mal.
Opmerking: Dit maakt een vlakke ondergrond, zodra de PDMS is genezen en produceert via gaten waar de 3D gedrukte meetkundes flush met de glazen cover slip zijn. U kunt ook het vergroten van het aantal apparaten dat tegelijkertijd kan worden genezen, bouwen een multi klem apparaat (bv. Figuur 2, stap 2.3). - Genezen het PDMS apparaat in de geklemd mallen bij 100 o C in de oven gedurende 90 minuten ( Figuur 2, stap 2.4). De mallen Verwijder uit oven en laat afkoelen tot ze gemakkelijk kunnen worden behandeld. Als de klemmen apparaat metaal is, verwijderen de schimmel en dekking schijf montage uit de klem om te voorkomen dat het metaal blijven genezen het PDMS als gevolg van restwarmte.
Opmerking: Het apparaat is het makkelijkst te verwijderen van de schimmel, terwijl nog steeds veel te warm en niet volledig genezen. Echter zodra de mal wordt verwijderd uit de oven en de cover-schijf wordt verwijderd, kan het apparaat zitten voor een paar dagen voordat wij overgaan tot demolding. Als het apparaat is demolded kort na het verwijderen van de uithardende oven, plaatst u deze in een overdekte petrischaal te minimaliseren contaminanten terwijl zodat het volledig genezen.
3. Plasma-bonding zWEDGI aan glazen schotel
- klem de mal met het PDMS apparaat in een bankschroef bank zodat de schimmel ' s geometrieën staan omhoog, parallel aan de werkbank station.
- Start het PDMS apparaat verwijderen door het vrijgeven van het PDMS pull-tabblad uit de mal met behulp van flat-tipped pincet. Werk rond de omtrek van de schimmel met de pincet (zoals het verwijderen van een taart uit een pan ( Figuur 2, stap 3.1)).
- Gebruik gefilterd gecomprimeerde lucht en pincet te Trek voorzichtig aan het apparaat uit de mal door vast te houden aan het pull-tabblad en lucht onder het apparaat blazen. Werken langzaam, waardoor de lucht om te helpen het PDMS van de mal aparte, speciale zorg met de uiteinden van het pincet te nemen rond de dunne tunnel secties.
- Plaats van het PDMS apparaat ondersteboven op de binnenkant van het deksel van een glazen bottomed schotel zodat de beteugeling tunnel segmenten zijn het aanraken van de plastic ( Figuur 2, stap 3.2).
- Plaats het deksel van de schotel met ondersteboven zWEDGI en de bijbehorende glas bottomed schotel naar een plasma reiniger met de innerlijke glas naar boven gericht ( Figuur 2, stap 3.3).
- Evacueren van het plasma kamer schoonmaken totdat de druk 500 mTorr tot.
- Set radiofrequentie (RF) macht op hoog. Het apparaat bloot en de schotel op RF frequentie voor ongeveer 2 min. langzaam-het Parlement druk uitoefenen en terugkeren van het apparaat en de schotel naar een cleanroom kap.
- De PDMS apparaat loskoppelen van de deksel van de schotel. Flipover het PDMS zWEDGI naar de correcte oriëntatie op het glas door het zorgvuldig positionering in het midden goed van de glazen bodem schotel ( Figuur 2, stap 3.4)
- met behulp van de back-end van het pincet, licht ingedrukt de PDMS apparaat om luchtbellen zitten niet onder. Toepassing van druk rond de minuut geometrieën van de micro-kanalen en het PDMS gladstrijken met de randen ( figuur 5C).
Opmerking: Complete contact tussen het PDMS en het glas zorgt voor een betere naleving van plasma hechting. Het zWEDGI-apparaat kan worden gebonden op andere glazen bodem schotel indelingen, zoals een glazen bodem 6-well plat plasmae ( figuur 2C). - Een cover op de schotel apparaat plaatst voordat u uit de cleanroom kap verwijdert.
Opmerking: Zodra de apparaten zijn opgelost met glas, het protocol kan worden onderbroken totdat ze klaar voor gebruik zijn.
- met behulp van de back-end van het pincet, licht ingedrukt de PDMS apparaat om luchtbellen zitten niet onder. Toepassing van druk rond de minuut geometrieën van de micro-kanalen en het PDMS gladstrijken met de randen ( figuur 5C).
4. Kanaal van voorbereiding en laden larven
Opmerking: generaal zebrafish veeteelt werd uitgevoerd per The Zebrafish boek, beschikbaar online op http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Volwassen zebravis en embryo's werden onderhouden zoals eerder beschreven 1. De wild type AB stam werd gebruikt. Volg de instelling ’ s Animal Care Protocol voor specifieke informatie over vereisten voor imaging-levende larven.
- Spoelen de kanalen met een minimum van 100 µL 70% ethanol per kanaal, met behulp van een micropipet te spoelen door de beteugeling van de tunnel. Verwijderen van ethanol en spoel 2 of 3 keer met dubbel gedestilleerd water. Laat lucht droog.
- Vullen de kanalen met magere melk (bij een concentratie van 1% verdund in water) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur tot een minimum beperken van de hechting van de larven naar het glas dekglaasje aan van de schotel. Vervolgens onderdompelen zachtjes het apparaat meerdere keren in dubbel gedestilleerd water te spoelen. Laat lucht droog ondersteboven.
Opmerking: Protocol kan hier worden gepauzeerd. Deze voorbereiding van zWEDGI apparaat kan verscheidene dagen vóór gebruik worden gedaan. Opslag die wordt behandeld bij kamertemperatuur. - Voorbereiden 1% smeltende dieptepunt (LMP) agarose door het combineren van 100 µL 2% gesmolten LMP agarose met 100 µL 2 x Tricaine (0,4 mg/mL tricaïne - ethyl 3-aminobenzoaat) in E3 buffer 11 vooraf opgewarmd tot 38 o C. handhaven de 1% agarose/tricaïne oplossing bij 38 o C in een hete blokkeren om te voorkomen dat gelerend.
Opmerking: Multiphoton microscopie 11, gebruik voor beide varianten van de un-gepigmenteerde zebrafish (zoals casper 12) of handhaven van de larven in E3 met 0,2 mM N-phenylthiourea pigment vorming te voorkomen 11 om te minimaliseren van de absorptie van het nabij infrarode golflengten door het pigment.
Let op: N-phenylthiourea is toxisch. Volg de instelling ' s regels voor lozing. - Verdoving larven in E3 buffer met 0,2 mg/mL tricaïne (tricaïne/E3) 11. Wachten tot larven onbeweeglijk en reactieloos op een aanraking prikkel zijn.
- Natte vooraf de kanalen met een paar microliters van tricaïne/E3.
- Pick up een één larve met behulp van een brede opening pipette uiteinde. Stort de larven in het laden kanaal ( figuur 3A). De larve in de zaal laden met behulp van een pipet tip of een soortgelijke tool, oriënteren, zodanig dat de dorsale zijde geconfronteerd met de rechtere rand van de kamer van de laden en de gezichten van de staart naar de beteugeling tunnel ( figuur 3B).
- Trekken zorgvuldig vloeistof uit de verwonding kamer, waardoor de larve stromen naar de beteugeling tunnel ( Figuur 3 c). Allermeest naar de vloeistof verwijderen met behoud van vocht rond de larve ( figuur 3D). Dit proces kan worden bijgestaan door het kantelen van de schotel lichtjes richting de verwonding zaal.
- 1% LMP agarose plaats in tricaïne/E3 (~ 38 o C) over de larve ' s hoofd, vullen de laden kamer ( 3E figuur). Toestaan agarose te stollen met de larve in de juiste positie. Add tricaïne/E3 aan de verwonding kamer moest handhaven hydratatie. Herhaal dit proces voor de resterende 2 kanalen laden.
- Met behulp van een spuit-naald, verwijder voorzichtig alle agarose die door de matigende tunnel sijpelde in de verwonding kamer ( figuur 3F). Toevoegen van extra tricaïne/E3 ofwel iets meer dan de agarose (voor verwonding, korte termijn imaging of wond behandeling isolatie) of om te vullen de cultuur schotel (voor de weergave van de lange termijn). Vervang het deksel van de schotel cultuur om te voorkomen dat de verdamping. Larven kunnen beeld op dit punt (gewonde) of gewond.
5. Kwetsende en Imaging larven
- met behulp van een steriel scalpel blad, aarde transect de staartvin posterieure aan de chorda 11 in de verwonding zaal ( Figuur 3 G, H). Voeg extra tricaïne/E3 indien nodig en vervangen van het deksel van de schotel cultuur.
Opmerking: Als alternatief, afhankelijk van het venster van de ontwikkelings tijd van belang, larven kunnen worden gewond en toegestaan om te herstellen in de E3 en onderhouden in een incubator (28.5 o C) totdat de gewenste beeldvorming, waarna ze geladen in kanalen als worden kunnen hierboven beschreven. - Het zWEDGI-apparaat met narcose larven op een omgekeerde Microscoop installeren in een stadium invoegen die geschikt is voor de schotel van 60 mm glazen bodem. Zoek de staart van de larve in het meest bovenste kanaal, draaien de schotel zo nodig om de staart in de gewenste positie. Beeld als vereist voor de specifieke experiment.
Opmerking: De zWEDGI geldt in grote lijnen voor hoge-resolutie de lichte microscopie, met inbegrip van widefield fluorescentie en laser scanning microscopie. Er zijn een aantal overwegingen van de parameter wanneer imaging zebrafish larven, maar specifieke imaging parameters zijn instrument, monster en experiment afhankelijk. Hier, de larvale staart was beeld op een maatwerk multiphoton Microscoop 5 , 11 met behulp van de volgende parameters: 40 X lang werkende afstand water onderdompeling doelstelling, 890 nm laser excitatie, 445/20 nm emissie filter en resolutie van 512 x 512.
6. Einde van Experiment
- verwijderen de zWEDGI schotel van Microscoop. Euthanaseren van de larven door het plaatsen van de zWEDGI op een ice waterbad of op 4 o C gedurende ten minste 20 minuten en beoordelen afwezigheid van hartslag en omloop.
Opmerking: Omdat de larven zijn bijgehouden in aparte compartimenten, de larven kunnen worden individueel hersteld door zachtjes te trekken op de agar met pincet of pipet. De agar kan worden verwijderd uit het hoofd regio en de larve gebruikt voor aanvullende procedures, zoals fixatie voor antilichaam kleuring of verwerkt voor RNA of eiwit extractie. - Na verwijdering van de larven en de agar, reinig de zWEDGI met ethanol en gedestilleerd water, zoals beschreven in stap 4.1 en ondersteboven lucht droog. Opslag die wordt behandeld in een koele, droge plaats. Opnieuw jas met magere melk (stap 4.2), desgewenst voorafgaand aan het volgende gebruik.
Opmerking: zWEDGIs kunnen worden hergebruikt meerdere malen totdat het PDMS begint te komen uit de buurt van het glas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het zWEDGI PDMS microfluidic apparaat is een functioneel verzuilde apparaat ontworpen voor vier hoofdfuncties (zie hieronder) live beeldvorming van caudal fin verwonden van genezing en hergroei in de zebravis larven is gekoppeld. PDMS werd gekozen voor de fabricage van zWEDGI omdat het is niet alleen gemakkelijk beschikbaar en een industriestandaard voor biocompatibiliteit, maar ook werken goed in mallen. Bovendien, maakt PDMS het apparaat herbruikbare en leegte van harde of scherpe randen zodra het apparaat wordt gevormd. De zWEDGI toelaat specifiek 1) het laden van de larven in het apparaat, 2) terughoudendheid op de juiste stand voor imaging, 3) verwonding van de caudal fin, en 4) microscopische beeldvorming, in detail hieronder beschreven.
Laden
Het ontwerp van de zWEDGI bestaat uit 3 kanalen, elk ontworpen om een larve (figuur 1B) beperken. Voor het laden en eerste oriëntatie van de larve is de zaal open laden 3 mm breed (figuur 1A) voor een grote opening pipette uiteinde voor het storten van een larve (figuur 3A). Verder, de lengte en breedte bieden voldoende room to permit latere manipulatie van de larve in de juiste stand, met staart naar de beteugeling tunnel en dorsale zijde naar boven (figuur 3B).
Terughoudendheid
Zodra de larve is geladen in het kanaal, kan het getekende staart-als eerste in de beteugeling tunnel door verwijdering van vocht uit de verwonding zaal of zachtjes verschuiven naar de plaats met een pipet tip of een soortgelijke tool (Figuur 3 c). De trechtervormige geometrie van de kamer van de laden (figuur 1A), van 3 mm tot 0,45 mm, begeleidt de larve in gewenste laterale oriëntatie (Figuur 3 c). De oriëntatie van de larve op zijn kant weerhoudt de staart ongeveer parallel met de glazen bodem van de schotel voor verbeterd imaging. In tegenstelling tot microfluidic apparaten gemaakt met behulp van silicium wafers, de geometrie van het 3D gedrukte mallen hoeft niet te worden consistent in de z-richting. Daarom is de beteugeling tunnel bedekt en tapered in de z-as, zodat de hoogte van de ingang groter dan de afslag, van 0.5 mm tot 0,3 mm hoogte (figuur 1B, isometrische weergave van tunnel is). Deze taps toelopende vergemakkelijkt de begeleiding van de larve en afvlakking van de staart naar het glas van de cover imaging oppervlak. Deze functionaliteit elimineert de noodzaak voor de gebruiker om te oriënteren van het specimen agarose weliswaar verharden.
Vloeistof wordt verwijderd uit de zaal laden (figuur 3D) en is vervangen door lage smeltpunt agarose te stabiliseren van het hoofd binnen het kanaal, terwijl de staart ongebreidelde in buffer in de verwonding zaal (de 3E figuur) is gehandhaafd. De minimale agarose die door de matigende tunnel lekken kan kan gemakkelijk worden verwijderd uit de verwonding zaal (figuur 3F). Het gebrek aan agarose in de verwonding zaal toelaat ongebreidelde hergroei en ontwikkeling van de caudal fin5.
Verwonding
Zodra de larve is geladen door de tunnel en het hoofd gefixeerd door agarose, is de caudal fin beschikbaar voor transect omdat het kraagt uit in de bedwelmingsruimte verwonden. De semi-cirkel verwonden kamer wordt gecompenseerd 1.9 mm van horizontale symmetrie. Hierdoor kan het scalpel blad moet worden ingevoegd net boven de caudal fin, zodat voldoende ruimte voor het mes naar beneden worden getrokken over de staart, transecting de caudal fin (Figuur 3 g). Het breedste gedeelte van de halve cirkel met een diameter 7 mm treedt op waar de staart is gewond aan deze ontwerpresolutie. Naast waardoor de gebruiker kan de larve van de wond, biedt dit verzuilde ontwerp de mogelijkheid voor regionale toepassing van verbindingen naar de staart regio5. Deze unieke functie van semi-isolatie zou voor het testen van de gelokaliseerde van de gevolgen van verschillende drugs, chemische of biologische agentia op de wond genezingsproces.
Imaging
Het doel van het apparaat zWEDGI is toe te staan hoge resolutie licht microscopie beeldvorming van de zebravis caudal fin, ongehinderd door agarose insluiten. Om deze reden, is het PDMS apparaat gebonden aan een commercieel beschikbare glazen bodem schotel, te bieden een optische kwaliteit oppervlak voor microscopie met behulp van hoge nb lenzen. Hier presenteren we beelden met behulp van multiphoton microscopie voor tweede harmonische (SHG) beeldvorming van collageenvezels in het caudal fin ter illustratie van de beeldvormende mogelijkheden van de zWEDGI. De zWEDGI kan echter worden toegepast op andere lichte microscopie methoden, zoals confocale microscopie, gebruik makend van een omgekeerde Microscoop fase configuratie. Met de zWEDGI, in tegenstelling tot de methode van agarose insluiten met latere verwijdering, kan gemakkelijk de caudal fin beeld worden in het apparaat voordat de verwonding (figuur 4A), gewond binnen het apparaat, daarna onmiddellijk keerde terug naar de Microscoop voor post wond Imaging (figuur 4B-E). Vorige werk geïdentificeerd wijzigingen in de werkorganisatie van de vezel collageen tijdens het genezingsproces van wond met behulp van de SHG. 13 SHG kan worden gebruikt voor het detecteren van bepaalde soorten bestelde structuren, met inbegrip van fibrillar collageen, zonder het gebruik van exogene etiketten. 14 image kwaliteit van de levende caudal vinnen beeld in de zWEDGI vergelijkbaar met die verkregen in vaste weefsel5 maar de zWEDGI was biedt een aantal voordelen. Bovenal de caudal fin genezing en de hergroei kunnen doorgaan met installeren ongehinderd door agarose insluiten met larval survival vergelijkbaar met die van de larven ongebreidelde5gegroeid. Verder, omdat de verwonding kan worden uitgevoerd terwijl de larve in het apparaat, pre- en post verwonden beelden kunnen worden verzameld op de dezelfde caudal fin (figuur 4A). De zWEDGI maakt het verzamelen van 3 dimensionale gegevens na verloop van tijd bieden een vollediger beeld van de dynamische veranderingen in de structuur van de extracellulaire matrix (figuur 4B). Geïllustreerd hier volgt de SHG vezel wond ontspanning, in 3 afmetingen, verwonden binnen de zWEDGI. Voorafgaand aan verwonding, ontdekt de SHG collageenvezels stralen naar buiten van de chorda naar de fin tip, (figuur 4A). Kort na de verwonding van de afstand tussen het uiteinde van de gecontracteerde fin en het centrum van the fin neemt toe met de wond ontspanning. De 3D aard van het verzamelen van de gegevens toelaat de ruimtelijke wederopbouw, met rendering software zoals Imaris. Deze reconstructies, en de opties voor latere draaiing, illustreren de samentrekking en versoepeling van de fin doet zich niet alleen in de x-y vlak voor de foto-collectie (Figuur 4 B, C, D), maar ook in de z-as (Figuur 4 G-J, L-O, Q-T; Aanvullende films 1, 2) Als de staart wordt samengevoegd uit de opwaartse krul van de gecontracteerde staat. De zWEDGI kan worden gebruikt met andere beeldvormende modaliteiten over langere perioden, zoals het gebruik van de confocal microscopie naar afbeelding neuronen tijdens caudal fin ontwikkeling gedurende 24 h5. Omdat de beteugeling eenheden van het apparaat staan opgesteld parallel, waardoor de noodzaak om te draaien van het apparaat bij het lokaliseren van de larven, het opzetten van de Microscoop en verplaatsen tussen meerdere specimen voor imaging is eenvoudig en kan worden geautomatiseerd om te verzamelen time-lapse afbeeldingsgegevens van meerdere larven. Om uit te breiden het aantal monsters dat image kan worden gemaakt, kan het PDMS zWEDGI apparaat geplaatst worden naar andere formaten van glazen bodem, zoals een 6-well plaat (figuur 2C).
Figuur 1 : Definitieve ontwerp schema (A) Schema toont de algemene lay-out en metingen van de zWEDGI apparaat, markeren van de terminologie van de functioneel verzuilde kamers. (B) isometrische weergave van PDMS apparaat verwijderd van schimmel. (C) inzet toont tunnel, markeren de verandering in de hoogten van ingang en uitgang. (D) Model van larve op apparaat gefixeerd. Figuur aangepast ten opzichte van een eerder artikel5 met toestemming van de herdruk van zebravis dagboek te publiceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Fabricage schema (A) Stap 1 begint met het ontwerp van de schimmel apparaat in een 3D modeling software (1.1), die vervolgens 3D gedrukte (1.2). De mallen zijn UV licht uitgehard en vervolgens geschuurd en schoongemaakt zodat de verhoogde geometrieën zelfs hoogte (1.3 hebben). Stap 2 omvat vullen van de mallen met gemengde en ontgaste PDMS (2.1) en het toepassen van een glazen schijf over de mal op een inslag ter voorkoming van overvulling luchtbellen in het apparaat PDMS (2.2). De glas- en schimmel zijn geklemd samen (2.3) voor het genezen van in een oven bij 100oC voor minstens een uur (2.4). Stap 3 maakt gebruik van gefilterde lucht en flat-tipped pincet om het PDMS-apparaat van de mal (3.1). Het apparaat wordt dan geplaatst op de top van de beeldvorming deksel van de schotel (3.2) en plasma behandeld (3.3), samen met de glazen bodem, zodat het PDMS vast te houden aan de glazen bodem schotel (3.4). (B) het apparaat klaar zWEDGI gebonden in een glazen bodem schotel en imaging gebruiksklaar. (C) meerdere zWEDGI apparaten kunnen worden geplaatst in een glasplaat onder 6-well om het beeld veel larven in hetzelfde experiment. Figuur aangepast ten opzichte van een eerder artikel5 met toestemming van de herdruk van zebravis dagboek te publiceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Laden en verwonden van larve in zWEDGI (A) Een larve wordt geladen in de zaal van de laden met behulp van een precisiepipet wide-opening. (B) de larve is gericht met de dorsale zijde tegen het platte gedeelte van het laden vergaderzaal trechter en staart naar de beteugeling tunnel. (C) met behulp van de zuigkracht van de punt van de pipet gehouden bij de ingang aan de verwonding kamer, de larve is getrokken in de tunnel, in de goede richting voor imaging plaatst. (D) vloeistof wordt verwijderd uit de zaal laden te voorzien van (E) de toevoeging van agarose rond het hoofd regio te stabiliseren van de larve. Agarose is rood gekleurd hier alleen ter demonstratie. Minimale agarose lekken in de verwonding kamer en kan gemakkelijk verwijderd worden zoals aangegeven in (F). (G) om de wond zodra de larve is terughoudend in het kanaal, een scalpel blad is ingevoegd boven de larve en gesneden naar beneden over de caudal fin, achterste aan de chorda. (H) de larve is nu klaar voor post opgerolde imaging. Schaal bar (A-H) = 1 mm; Schaal bar (F) = 1 mm; Schalen (g) = 1 mm. figuur aangepast ten opzichte van een eerder artikel5 met toestemming van de herdruk van zebravis dagboek te publiceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : 3D multiphoton time-lapse van SHG vezels in de zebravis caudal fin, pre beeldvormings- en na verwonding, in de zWEDGI. Het zWEDGI ontwerp bieden de mogelijkheid om hoge resolutie beeldvorming, in dit geval van SHG vezel organisatie voorafgaand aan (vooraf wond) en na caudal fin transect (na wond). Met 4 min tussenpozen werden gegevens verzameld als z-stacks. (A-E) toont de SHG van vezels in de caudal fin als een projectie van de z-stacks, voorafgaand aan en op vier tijdstippen na transect. Z-projectie werd uitgevoerd met behulp van ImageJ software. 15 t = 0 was het begin van imaging, ongeveer 20 min. na transect. De dubbele pijlen geven de toename van de afstand van het puntje van de rand van de wond (korte witte lijn) ten opzichte van de locatie van de chorda (lange witte lijn) tijdens de versoepeling van de wond na de initiële contractie. (F-J). Gekantelde 3D reconstructie van de oorspronkelijke gegevens. (K-O). Oppervlakte weergave van de gekantelde 3D reconstructie weergegeven in F-J. (P-T). Zijaanzicht van de oppervlakte weergave van 3D reconstructie, illustreren hoe de samentrekking en ontspanning optreden in 3-dimensionale ruimte, die kan worden beoordeeld met deze gegevens verzameld met behulp van de zWEDGI waar de caudal fin niet wordt belemmerd door agarose. Schaal bar (A-E) = 100 micron; Schaal bar (F-T) =100 micron. 3D renderings werden uitgevoerd met behulp van beeldbewerkingssoftware. Zie ook aanvullende films 1 en 2. Figuur aangepast ten opzichte van een eerder artikel5 met toestemming van de herdruk van zebravis dagboek te publiceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Kritische stappen van zWEDGI fabricage (A) Om te zorgen dat geen enkele vorm van bubbels of krijgen gevangen in het apparaat wanneer klemmen op de glazen schijf, ontgas nadat PDMS is ingevuld in de mallen en schuin het klemmen glas wanneer u het toepast op het PDMS in de mal. Bovendien, ter voorkoming van PDMS van "opvlammen" over het laden en verwonden chambers, zorg ervoor dat het zand van de bovenkant van het apparaat grondig om ervoor te zorgen zijn de oppervlakken van de geometrieën flush als klemmen op het glas. (B) wanneer het apparaat voldoende in de oven genezen is, luchtzakken tussen de PDMS en schimmel aangegeven dat het apparaat wel gemakkelijk te verwijderen. Als het apparaat niet gemakkelijk wordt verwijderd, is het most likely is te wijten aan onvoldoende genezen tijd of temperatuur of de schimmel zelf was niet voldoende UV-genezen, resulterend in residuele hars besmetting van het PDMS. (C) wanneer u het apparaat op de glazen bodem schotel na plasma behandeling toepast, oefen lichte druk uit met de back-end pincet, beginnend bij de tunnel regio's en naar buiten te werken aan de rand van het apparaat. Als het apparaat is niet goed, zoals aangegeven door de luchtzakken tussen het apparaat en het glas obligatie, de hoeveelheid tijd in het plasma bonder verlengen en zorgen ervoor dat er geen stof het PDMS en glazen oppervlak wordt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende film 1: 3D-oppervlak rendering van multiphoton tijd lapse beelden van SHG vezels in de caudal fin tijdens ontspanning na verwonding gekanteld. De SHG van vezels in de caudal fin beeld als zstacks na verloop van tijd na verwonding (begin van de film is ongeveer 20 min na verwonding) in de zWEDGI. Z-stacks werden gereconstrueerd en oppervlak weergegeven met behulp van beeldbewerkingssoftware. Staart schuin om te laten zien van drie dimensionaliteit. Anterieure is aan de linkerkant. Film komt overeen met stilstaande beelden in Figuur 4 (K-O). Schaal bar = 50 micron. Gelieve Klik hier om de film downloaden.
Aanvullende Movie 2: zijaanzicht van 3D oppervlakte rendering van multiphoton tijd lapse beelden van SHG vezels in de caudal fin tijdens ontspanning na verwonding. De SHG van vezels in de caudal fin beeld als zstacks na verloop van tijd na verwonding (begin van de film is ongeveer 20 min na verwonding) in de zWEDGI. Z-stacks werden gereconstrueerd en oppervlak weergegeven met behulp van beeldbewerkingssoftware. Zijaanzicht aangetoond dat het benadrukken van de vangst van dynamische veranderingen in de z-as. Anterieure is aan de linkerkant. Film komt overeen met stilstaande beelden in Figuur 4 (P-T). Schaal bar = 40 micron. Gelieve Klik hier om de film downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van het apparaat zWEDGI is 3D time-lapse imaging door te stabiliseren en de vis binnen de kleine afstand van de doelstelling van een hoge-resolutie Microscoop kunt vastleggen. Met inachtneming van deze ontwerp-specificaties, is het ook een verbetering over traditionele agar gebaseerde voorbereiding voor levende imaging. Er zijn drie essentiële stappen (zie hieronder) in de fabricage van de zWEDGI, die, indien niet correct gedaan, in defecte apparaten resulteren kan:
PDMS voorbereiding (figuur 5A)
Voorkom bubbels en ontgas de mallen na PDMS is toegevoegd. Controleer of alle bubbels zijn afgeschaft na ontgassing en zorgvuldige aandacht aan de toepassing van de glas-schijf besteden. De glas-schijf moet worden toegepast op een inslag om ervoor te zorgen dat de lucht niet is wordt gevangen onder en binnen het PDMS. Stof kan een probleem zijn tijdens de meeste stappen van het proces. Geen stof, uitvoering van elke reiniging stap grondig en delen opslaan in een schone kap tussen stappen. Mallen voor overtollige hars die tot een ruw oppervlak voorafgaand aan UV-uithardende leiden kan controleren. Bij schuren, zorg ervoor dat de contacten van de schuurpapier alle geometrieën om ervoor te zorgen dat alle oppervlakken zijn flush (Figuur 2, stap 1.3). Altijd schoon met isopropyl alcohol en lucht vlak voor het vullen van de mallen met PDMS. Wanneer de extra PDMS uit de mal te knijpen, zorgen de klemmen strak houdt de schimmel en glazen cover samen (Figuur 2, stap 2.3).
Apparaat verwijderen van schimmel (figuur 5B)
Zorg ervoor dat de oven is ten minste 100 o C en de genezing tijd is ten minste 1-1,5 uur. Als de PDMS niet voldoende genezen is, kan het moeilijk te verwijderen van de schimmel. Andere mogelijkheden voor niet te verwijderen zijn niet mengen de PDMS reagentia lang genoeg, met behulp van onjuiste verhoudingen van base en verharder of overgebleven hars overblijft in de mal na 3D printing die verontreinigt dan het PDMS. Na verwijdering uit de oven, luchtzakken tussen het apparaat en de schimmel (figuur 5B) geven aan dat het apparaat gemakkelijk worden verwijderd.
Naleving van PDMS glassbottom schotel (figuur 5C)
Slechte naleving van de glazen schotel kan voortvloeien uit stof, sprake van een convergentiefout of onvoldoende duur van plasma behandeling. Bij het plaatsen van het apparaat op het glas, tip van de schotel op een hoek en centreer de PDMS op de cirkel van de glazen om ervoor te zorgen dat het niet raakt de randen van de put. Als het apparaat niet voldoet, zorgvuldig drukt u op het apparaat op de glazen slip met de back-end van het pincet, begint bij de delicate tunnel-regio en op naar buiten aan de randen te drukken. Als het apparaat nog steeds niet naleeft, experimenteren door het verhogen van de tijd in het plasma reiniger in stappen van één minuut.
Terwijl de larven in het apparaat kunnen worden beeld voor een korte periode van tijd (minuten) zonder het gebruik van agar, met het oog op de lange termijn live-imaging de regio caudal fin, wordt agar geplaatst op de kop in de zaal laden nadat de vis geladen is. Hoewel deze toepassing agar niet van invloed zijn op de wond genezing reactie of de levensvatbaarheid van de larven5 lijkt, kon dit het beïnvloeden van de studie van meer anterior regio's van de larven. Hoewel wij hebben geweest kundig voor afbeelding larven voor maximaal 60 uur hebben wij niet onderzocht of levensvatbaarheid met langere imaging tijden zou worden beïnvloed. Bovendien, is het specifieke ontwerp hier gepresenteerd geoptimaliseerd voor de leeftijd 2 tot 4 dagen post bevruchting (dpf) larven liggend op hun zijden voor staart transect en wond genezing imaging. Andere ontwikkelingsstadia, oriëntaties en experimentele protocollen mogelijk veranderingen in het ontwerp. De opzettelijke functionele modulariteit van het ontwerp maakt het echter gemakkelijk vatbaar voor dergelijke veranderingen.
Bovendien vereist de fabricage van dit apparaat toegang tot een 3D-printer en andere apparatuur, zoals PDMS en een plasma reiniger, mogelijk beperken van de toegankelijkheid van het apparaat aan sommige gebruikers en microfluidic materialen. Echter, deze methode van schimmel fabricage werd gekozen aangezien 3D afdrukmogelijkheden, samen met microfluidics fabricage, zijn steeds vaker op academische campussen. Daarnaast zijn er aanbieders voor 3D printing beschikbaar, zoals de technologie snel ontwikkelt en de kosten van printers afneemt.
Gezien de verzuilde ontwerp en functionaliteit, biedt de zWEDGI verbeteringen over de huidige techniek voor time lapse foto collectie met agar insluiten. Ten eerste doet agarose de staart-regio in de zWEDGI, wondgenezing en regeneratie aan vooruitgang ongeremd toe te staan terwijl het voortbestaan van de larven in het zWEDGI is vergelijkbaar met ingesloten en ingesloten besturingselementen5niet omringen. Ten tweede, het gebruik van hoge resolutie 3D printen om de mallen fabriceren toe de zWEDGI hebben unieke glooiende geometrieën om te oriënteren van de larve in drie dimensies met betrekking tot de beeldvorming vliegtuig. Hiermee verwijdert u de afhankelijkheid van de tijd van het manipuleren van de larven naar een juiste stand, zoals de agar verhardt. Een derde belangrijk voordeel van het zWEDGI ontwerp is het open kamer ontwerp dat toelaat de staart en hoofd regio's toegankelijk voor experimentele manipulatie. Dit is van bijzonder belang voor wond genezing studies, maar dit maakt de zWEDGI ook een potentieel nuttig instrument voor andere manipulaties. Het compartimentaire ontwerp van de inrichting, biedt bovendien de mogelijkheid voor regionale toepassing van verbindingen tijdens experimenten. De semi-isolaten van apparaat het hoofd van de staart vanwege het verschil van de verspreiding van de buffer (in de verwonding kamer) en agarose (in de laden kamer)5, waardoor toepassing van verbindingen terwijl het bestuderen van de wondgenezing of andere biologische processen. Bovendien, omdat de larven zijn gemonteerd in afzonderlijke kanalen, individuele larve kan worden geïdentificeerd en opgehaald na imaging voor extra verwerking zoals RNA of eiwit zuivering of antilichaam labeling. En ten slotte, omdat het apparaat is gemaakt voor PDMS die heeft zijn gebonden aan de bottomed schotel van glas, het apparaat is herbruikbare zodra de larven zijn verwijderd.
In vooruit, zal het modulaire ontwerp en het gebruiksgemak van de fabricage van de zWEDGI leent zich goed voor modificatie voor gewijzigde functionaliteit. Op dit moment de compartimentaire geometrieën speciaal is gebouwd voor de experimenten van het verwonden en imaging beschreven, waarbij het brede toepassing voor live beeldvorming van de wondgenezing. De larve ligt echter direct op het glas, zodat geen materiaal (d.w.z. PDMS), die kan interfereren met beeldvorming, bestaat tussen de larve en de beeldvorming oppervlak. Daarom, andere regio's van de larven, zoals de stam, would bereikbaar voor imaging. Daarnaast kan het ontwerp van de 3D gedrukte mal van de zWEDGI gemakkelijk worden gewijzigd voor andere ontwikkelingsstadia, verschillende oriëntaties van de larve en gevarieerde behandelingen. Deze kenmerken maken het dan ook een waardevol instrument voor het vastleggen van tijd vervallen microscopie van evenementen over een verscheidenheid van tijdschema's. Het gebruik van andere glazen bodem schotel formaten kan leiden tot grotere PDMS apparaten en ruimte voor meer kanalen. Gegeven de toenemende toegankelijkheid aan 3D druktechnieken fabricage en de daaropvolgende gebruiksgemak wijziging voor een verscheidenheid van experimentele protocollen, kan de zWEDGI blijken te zijn een krachtig hulpmiddel in het rijk van hoge resolutie levende imaging microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen primaire projectfinanciering uit het Morgridge Instituut voor onderzoek en het laboratorium voor optische en computationele instrumentatie. We erkennen ook financiering van NIH # R01GM102924 (AH en KWE). KH, JMS, RS, AH en ESP KWE bedacht en ontworpen van de studie. KH en JMS uitgevoerd alle experimenten met steun van DL, KP en RS. KH, JS, RS, AH en ESP KWE bijgedragen aan het schrijven van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
