Summary
يصف هذه المخطوطة في زويدجي (الزرد إصابة والجهاز الفخ للنمو وتصوير)، وهو جهاز مجزأة تهدف إلى توجيه وكبح جماح اليرقات الزرد. ويسمح التصميم ترانسيكشن الذيل وطويلة الأجل جمع الصور مجهرية الفلورية العالية الاستبانة من التئام الجروح والتجديد.
Abstract
يرقة الزرد كائن حي نموذجا هاما لعلم الأحياء التنموي والتئام الجروح. علاوة على ذلك، اليرقة الزرد نظاما قيماً ليعيش تصوير مجهرية ذات الدقة العالية للظواهر البيولوجية الحيوية في المكان والزمان مع القرار الخلوية. بيد أن الطريقة التقليدية لتغليف [اغروس] لتصوير مباشر يمكن أن تعوق التنمية اليرقات ونمو الأنسجة. ولذلك، يصف هذه المخطوطة في زويدجي (الزرد إصابة والجهاز الفخ للنمو وتصوير)، الذي صمم وملفقة كجهاز مستقلة وظيفيا لتوجيه اليرقات للفحص المجهري عالية الدقة مع السماح زعنفة والذيلية ترانسيكشن داخل الجهاز والتنمية اللاحقة الذيل غير المقيد وإعادة النمو. يسمح هذا الجهاز لإصابة وتصوير طويلة الأجل مع الحفاظ على السلامة. نظراً لأن العفن زويدجي 3D مطبوعة، التفصيل عن هندستها تجعل من تعديلها بسهولة للتطبيقات التصوير الزرد المتنوعة. وعلاوة على ذلك، يوفر زويدجي العديد من المزايا، مثل الوصول إلى اليرقة أثناء التجريب لإصابة أو لتطبيق المواد الكاشفة، توازيها التوجه لليرقات متعددة لتصوير مبسطة، وإعادة استخدام الجهاز.
Introduction
قدرة التجدد الزرد اليرقات دانيو rerio جعلها كائن نموذج مثالي دراسة استجابة الجرح فضلا عن تضميد الجراح وإعادة نمو1،2،،من34. الوصول إلى مجموعة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا والشفافية التشريحية الزرد لمواصلة تعزيز فائدتها للدراسات في فيفو الجرح استجابة الأحداث، فضلا عن عمليات التجدد الأطول أجلاً4. دراسة هذه العمليات البيولوجية استخدام الاستبانة fluorescence الوقت الفاصل بين الفحص المجهري لذلك يطالب جهاز الزرد تصوير مباشر الذي يسمح لحركة الحد الأدنى لليرقة الزرد والاستقرار عالية مع الحفاظ على استمرارية. مفتاح أن يسمح هذا الجهاز لإصابة فعالة حين الشفاء والتجديد تحدث لم يتأثر بالجهاز.
القياسية يعيش التصوير الاستقرار طريقة تضمين اليرقة في [اغروس] أثناء تصوير لايف يحد من النمو والجرح التجديد5 وقد تزيد معدلات الوفاة منذ اليرقات تبدأ في إظهار علامة على نخر الإجهاد وأنسجة القلب بعد أربعة ساعات4. ولذلك، إزالة [اغروس] من المناطق ذات الاهتمام عادة الضرورية للسماح بالنمو الطبيعي والتجديد6، تعريض اليرقات للأضرار المحتملة ك [اغروس] قطع بعيداً. وعلاوة على ذلك، مع تضمين تقنية [اغروس]، المستخدم يجب توجيه اليرقات في وقت قصير قبل أن يقوي [اغروس]5،،من67. سرعة التلاعب اليرقة لا يتطلب مهارة للمستخدم، فإنه أيضا مخاطر الضرر إلى اليرقة. على الرغم من أن قد وصف أساليب لتحقيق استقرار اليرقة لتصوير مباشر للتحايل على هذه العيوب، مثل أجار مخدد الآبار3 أو ديفيتس8، استعمال المحجم سيليكون الشحوم إلى إنشاء دائرة لتصوير مع الأنابيب البلاستيكية أو غيرها المواد6، وانابيب التناوب9، العديد من هذه الأساليب هي العمالة المكثفة، وفوضوي، وغالباً غير القابل ولا تسمح بالتلاعب بالبيئة (المخدرات العلاجات، مما أدى إلى إصابة إلخ.) بعد أن تم تحميل الأسماك.
لذلك، تم تصميم الجهاز زويدجي (الشكل 1) للتغلب على بعض عيوب أجار المتصاعدة للتصوير حية طويلة الأجل من اليرقات الزرد بينما تسمح بالتلاعب بالعينة. زويدجي يتكون من ثلاث دوائر مستقلة شبه مفتوحة (الشكل 1A) للسماح لتحميل، ضبط النفس، مما أدى إلى إصابة والتصوير من 2 إلى 4 أيام بعد الإخصاب الزرد اليرقات. الجهاز ملفقة من "بولي دايمثيل سيلوكسان" (PDMS) وتوضع على كشف غطاء صحن التصوير أسفل الزجاج 60 ملم. تصميم المقدمة هنا المقصود لدراسات الجرح الشفاء، ولكن استخدام تصميم نمطي وتكنولوجيات التصنيع القياسية تجعل تصميم زويدجي قابلة للتعديل وقابلة لمجموعة متنوعة من الإجراءات التجريبية، خاصة بالنسبة للإجراءات التي وتتطلب الحد الأدنى من ضبط النفس مع التلاعب التجريبية وتصوير طويلة الأجل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: وضعت تصميم قاعدة زويدجي لليرقات الزرد التي هي من 2 إلى 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) واتبع المبادئ التوجيهية "مركز الموارد الحيوانات بحوث" جامعة ويسكونسن-ماديسون-
1-تصميم وطباعة 3D من قوالب
- النموذجي PDMS المكون من الجهاز مع الهندسات المطلوبة وسمات في 3D النمذجة البرمجيات 5. إنشاء جمعية لقالب فارغ والجزء PDMS وتوليد قالب سلبي للجزء PDMS عن طريق إنشاء تجويف في قالب المقابلة للجزء بدسم. حفظ القالب كملف.stl للطباعة ثلاثية الأبعاد ( الشكل 2، الخطوة 1.1)-
ملاحظة: يتوفر ملف بتنسيق (.stl) المجسمة لقالب تصميم المقدمة هنا ( الشكل 1) للتحميل في https://morgridge.org/designs/-
قوالب - الطباعة باستخدام طابعة 3D صانعوا ( الشكل 2، الخطوة 1، 2). جعل قوالب متعددة الطباعة واحد، إذا كان ذلك ممكناً، يمكن مصبوب حتى أكثر من جهاز مع دفعة واحدة من PDMS.
ملاحظة: طباعة المثال الموضح في وضع مرحبا الدقة مع 0.075 مم شعاع 0.05 مم وقطرها طبقة سمك، استخدام الراتنج صانعوا 5.- العفن نظيفة استخدام فرشاة الجميلة، الكحول التشويه والتحريف في زجاجة رذاذ، والهواء المضغوط بلطف فرك وإزالة الراتنج أونكوريد. إزالة أي مواد من مناطق microchannel.
- ما بعد علاج العفن في جهاز الأشعة فوق البنفسجية علاج منصب لمدة 60 دقيقة على كل جانب كما الاستقالة أونكوريد السمية على اليرقات الزرد 10-
- الرمال الجانب تجويف القالب مع 200 الصنفرة حصى على سطح مستو حتى جميع السطوح الختم على اتصال مع الصنفرة (تحميل قناة هندستها ومحيط القالب). خفة الرمال مع 400 و 600 ورقة حصى الرمال، تدريجيا، لإنتاج أسطح ناعمة دافق عبر جميع الأغطية الهندسة ( الشكل 2، الخطوة 1، 3). قياس عمق التجويف بعد الصنفرة مع مؤشر الاتصال هاتفي للتحقق من أن أنها قريبة من عمق مصممة.
- تنظيف العفن وتغطي الأقراص (1 قطرها ¾ بوصة × ¼ بوصة سميكة البورسليكات الزجاج أو اﻷكريليك؛ زجاج واحدة تغطي كل العفن) عن طريق وضع في الموجات فوق الصوتية الأنظف مملوءة بالماء لمدة 30 دقيقة أو عن طريق المسح تحت الماء الجاري.
- ضربة الجافة مع الهواء المضغوط وتنظيف كلا العفن ويغطي مع كحول الأيزوبروبيل ومصفاة الهواء المضغوط. استخدام منضدة نظيفة كمكان لاختلاق الأجهزة لتقليل التلوث الناجم عن الحطام المحمولة جوا. إجازة تغطي قوالب تنظيفها والزجاج في مقاعد البدلاء نظيفة أو طبق بيتري مغطى حتى الحاجة.
2. تصنيع PDMS زويدجي جهاز
- جعل PDMS واسطة 184 صب سيليكون الاستومر بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) بنسبة 5:1 (قاعدة للمنشط) في كوب بلاستيك. المزيج جيدا لمدة 2 دقيقة مع عصا القوارب خشبية، إثارة الجل على نفسه، مثل عجين الخبز. لقوالب 5، استخدام 10 جرام من قاعدة وز 2 من المنشط.
- دي الغاز المخلوط في مجفف فراغ ل 25-45 دقيقة حتى ولت جميع الفقاعات.
- ملء تجويف كل من قوالب المطبوعة 3D مع حوالي 0.75 مل PDMS استخدام حقنه 10 مل حتى العفن تجاوزات طفيفة مع غضروف ( الشكل 2، 2.1 خطوة)-
- الغاز دي قوالب شغلها لمدة 45 دقيقة لإزالة فقاعات الإضافية التي قد شكلت عند ملء-
- تطبيق قرص غطاء زجاج على رأس العفن مليئة PDMS، ضغط القرص إلى أسفل بزاوية لمنع الفقاعات من المحاصرين ( الشكل 2، الخطوة 2، 2). السماح PDMS الزائدة بطردهم كما يتم تطبيقها غطاء القرص من الزجاج-
- استخدام المشبك السقاطة الصغيرة عقد القرص غطاء محكم للعفن.
ملاحظة: وهذا يخلق سطح مستو مجرد PDMS علاجه وتنتج من خلال الثقوب دافق بكشف غطاء الزجاج فيها الهندسات المطبوعة 3D. وبدلاً من ذلك، زيادة عدد الأجهزة التي يمكن علاجها في وقت واحد، بناء جهاز المشبك متعددة (على سبيل المثال. الشكل 2، الخطوة 2، 3)- - علاج الجهاز PDMS في قوالب فرضت على 100 س ج في فرن لمدة 90 دقيقة ( الشكل 2، الخطوة 2، 4). إزالة القوالب من الفرن والسماح لتبرد حتى يمكن معالجتها بسهولة. إذا كان الجهاز لقط المعدن، إزالة التجميع القرص العفن وغطاء من المشبك للحيلولة دون مواصلة علاج PDMS بسبب الحرارة المتبقية المعدن.
ملاحظة: الجهاز أسهل لإزالة من العفن في حين لا يزال قليلاً دافئة ولا يشفي تماما. ومع ذلك، حالما تتم إزالة القالب من الفرن ويتم إزالة غطاء القرص، يمكن الجلوس الجهاز لبضعة أيام قبل الشروع في ديمولدينج. إذا كان الجهاز هو ديمولديد بعد وقت قصير من إزالة من الفرن علاج، ضعه في طبق بيتري مغطاة بتقليل الملوثات بينما يسمح لعلاج تماما.
3. زويدجي البلازما-الترابط إلى "صحن زجاج"
- المشبك العفن التي تحتوي على الجهاز PDMS في مقعد نائب حيث العفن ' تواجه الهندسات s يصل، موازية لمقاعد البدلاء محطة العمل.
- ابدأ لإزالة الجهاز PDMS عن طريق الإفراج عن علامة التبويب سحب PDMS من القالب باستخدام الملقط مسطحة ذات الرؤوس. العمل حول محيط القالب مع الملاقط (مثل إزالة كعكة من عموم ( الشكل 2، الخطوة 3.1))-
- استخدام تصفية الهواء المضغوط وملاقط لسحب الجهاز من العفن بلطف بالضغط على علامة التبويب السحب وتهب الهواء تحت الجهاز. العمل ببطء، السماح للهواء لمساعدة منفصلة PDMS من العفن، وأخذ الرعاية الخاصة مع النصائح من الملاقط حول مقاطع رقيقة النفق.
- وضع الجهاز PDMS رأسا إلى داخل غلاف طبق أدنى الزجاج حيث أنه لمس الأوتاد النفق الزجري البلاستيك ( الشكل 2، الخطوة 3.2)- ضع
- غطاء الطبق مع زويدجي رأسا والطبق الزجاج أدنى المقابلة في بلازما أنظف مع الزجاج الداخلية التي تواجه التصاعدي ( الشكل 2، الخطوة 3.3).
- إجلاء البلازما التنظيف الدائرة حتى يصل الضغط إلى 500 متور.
- مجموعة الطاقة تردد الراديو (RF) إلى أعلى. الكشف عن الجهاز والطبق على التردد الترددات اللاسلكية لحوالي 2 دقيقة ببطء إزالة الضغط على الدائرة وإرجاع الجهاز والطبق على غطاء غرفة نظيفة.
- إزالة الجهاز PDMS من تغطية الطبق. اقلب زويدجي PDMS إلى الاتجاه الصحيح على الزجاج بوضعه بعناية على مركز جيد للطبق أسفل الزجاج ( الشكل 2، الخطوة 3.4)
- استخدام نهاية الجزء الخلفي من الملاقط، اضغط على PDMS جروح طفيفة الجهاز ضمان فقاعات الهواء لا محاصرون تحت. تطبيق الضغط حول هندستها دقيقة من القنوات الصغيرة وتذليل PDMS الحواف ( الشكل 5).
ملاحظة: الاتصال الكامل بين PDMS والزجاج يضمن التقيد أفضل من الترابط البلازما. يمكن أن يكون الجهاز زويدجي البلازما المستعبدين إلى تنسيقات أخرى طبق زجاج القاع، مثل بلات 6-جيدا زجاج القاعﻫ ( الشكل 2). - ضع غطاء فوق الطبق الجهاز قبل إزالة من هود غرفة نظيفة.
ملاحظة: بمجرد أن تم إصلاح الأجهزة للزجاج، البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً حتى تكون جاهزة للاستخدام-
- استخدام نهاية الجزء الخلفي من الملاقط، اضغط على PDMS جروح طفيفة الجهاز ضمان فقاعات الهواء لا محاصرون تحت. تطبيق الضغط حول هندستها دقيقة من القنوات الصغيرة وتذليل PDMS الحواف ( الشكل 5).
4. قناة إعداد وتحميل اليرقات
ملاحظة: تربية الزرد العامة أجرى كل كتاب الزرد، متاح على الإنترنت في http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. وأبقى الزرد الكبار والأجنة كما هو موضح سابقا 1. وقد استخدم سلالة البرية نوع AB. تتبع المؤسسة ’ s "بروتوكول رعاية الحيوان" لتفاصيل محددة بشأن الاحتياجات للتصوير اليرقات الحية-
- شطف القنوات مع الحد ني إيثانول 70% 100 ميليلتر كل قناة، استخدام ميكروبيبيتي شطف من خلال التقييد نفق. إزالة الإيثانول وشطف 2 أو 3 مرات بماء مقطر مزدوجة. تسمح للهواء الجاف-
- ملء القنوات مع اللبن المقشود (بتركيز 1% المخفف في الماء) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة التقليل من يرقات التمسك ساترة زجاجية للطبق. ثم، بلطف تغرق الجهاز عدة مرات في الماء المقطر مزدوجة شطف. تسمح للهواء الجاف رأسا على عقب.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يمكن أن يتم إعداد هذا الجهاز زويدجي عدة أيام قبل الاستخدام. مخزن المشمولة في درجة حرارة الغرفة-
الحفاظ على - نقطة تحضير ذوبان منخفضة 1% [اغروس] (LMP) عن طريق الجمع بين 100 ميليلتر 2% ذاب LMP [اغروس] مع 100 ميليلتر 2 x Tricaine (0.4 ملغ/مل تريكيني-إيثيل 3-أمينوبينزواتي) في المخزن المؤقت E3 11 استعد مسبقاً إلى 38 يا جيم 1% [اغروس]/تريكيني الحل في 38 س ج في كتلة ساخنة لمنع التبلور.
ملاحظة: للفحص المجهري مولتيفوتون 11، استخدم أما المتغيرات الزرد المصطبغة الأمم المتحدة (مثل كاسبر 12) أو الحفاظ على اليرقات في E3 الذي يحتوي على 0.2 مم ن-والفنيل لمنع تشكيل الصباغ 11 للتقليل من امتصاص موجات الأشعة تحت الحمراء القريب بواسطة الصباغ-
تنبيه: N-والفنيل السامة. تتبع المؤسسة ' s قواعد للتخلص منها.
اليرقات - أنيسثيتيزي في E3 المخزن المؤقت يحتوي على 0.2 مغ/مل تريكيني (تريكيني/E3) 11. انتظر حتى يرقات بلا حراك وعدم استجابة لحافز لمس. قبل الرطب
- القنوات مع ميكروليتيرس عدد قليل من تريكيني/E3.
- بيك حتى يرقة واحدة باستخدام تلميح ماصة واسعة فوهة. إيداع اليرقات في قناة التحميل ( الشكل 3A). استخدام أداة مماثلة، أو تلميح ماصة توجيه اليرقة في قاعة تحميل أن تواجه الجانب الظهرية استقامة حافة الدائرة تحميل ووجوه الذيل نحو النفق الزجري ( الشكل 3B).
- بعناية سحب السائل من قاعة إصابة، مما يتيح اليرقة في التدفق إلى النفق الزجري ( الشكل 3). إزالة معظم السائل مع الحفاظ على رطوبة حول اليرقة ( 3D الشكل). هذه العملية يمكن أن يساعده إمالة الطبق قليلاً نحو الدائرة مما أدى إلى جرح-
- وضع 1% LMP [اغروس] في تريكايني/E3 (~ 38 س ج) عبر اليرقة ' الرأس s، شغل الدائرة تحميل ( 3E الشكل). يسمح [اغروس] ترسيخ مع اليرقة في الموضع الصحيح. إضافة تريكيني/E3 للدائرة مما أسفر عن إصابة حسب الحاجة للحفاظ على الماء. كرر هذه العملية عملية للقنوات المتبقية 2 تحميل-
- استخدام إبرة حقنه، بعناية إزالة أي [اغروس] التي تسربت من خلال النفق تقييدي في الدائرة مما أسفر عن إصابة ( الشكل 3F). إضافة إضافية تريكيني/E3 أما ما يزيد قليلاً على [اغروس] (لإصابة، تصوير قصير، أو عزل المعاملة الجرح) أو لملء الطبق الثقافة (لتصوير طويلة الأجل). استبدال غطاء صحن الثقافة لمنع التبخر. يمكن تصويرها في هذه النقطة (المعافين) اليرقات أو جرح-
5. اليرقات مما أدى إلى إصابة والتصوير
- باستخدام شفرة مشرط معقم، قطاع زعنفة الذيل الخلفي ل notochord 11 في الدائرة مما أسفر عن إصابة ( الشكل 3 ز، ح). إضافة tricaine/E3 إضافية إذا لزم الأمر، واستبدال غطاء صحن الثقافة-
ملاحظة: بدلاً من ذلك، تبعاً للإطار الزمني الإنمائية ذات الاهتمام، يرقات يمكن أصيب بجروح، ويسمح باسترداد في E3 وصيانتها في حاضنة (28.5 س ج) حتى وقت التصوير المطلوب، عندها يمكن تحميلها إلى قنوات الموصوفة أعلاه.
إدراج - تثبيت الجهاز زويدجي مع تخديره اليرقات إلى مجهر مقلوب في مرحلة التي سوف تستوعب الطبق أسفل الزجاج 60 ملم. قم بتحديد موقع ذيل اليرقة في قناة العلوي، وتدوير الطبق حسب الحاجة للحصول على الذيل في الموضع المطلوب. الصورة كما هو مطلوب للتجربة محددة.
ملاحظة: زويدجي قابل للتطبيق على نطاق واسع للفحص المجهري الخفيفة عالية الدقة، بما في ذلك ويديفيلد الأسفار والليزر الفحص المجهري. وهناك عدد من الاعتبارات المعلمة عند التصوير اليرقات الزرد، ولكن التصوير معلمات محددة الصك وعينه وتعتمد التجربة. هنا، تم تصويرها الذيل اليرقات على بناء مخصصة مجهر مولتيفوتون 5 ، 11 استخدام المعلمات التالية: 40 × طويلة العامل مسافة الماء الغمر الهدف، 890 الإثارة الليزر شمال البحر الأبيض المتوسط، 445/20 نانومتر تصفية الانبعاثات والقرار 512 × 512-
6. نهاية التجربة
- إزالة الطبق زويدجي من المجهر. Euthanize اليرقات عن طريق وضع زويدجي في حمام الماء المثلج أو في 4 س ج لمدة 20 دقيقة على الأقل، وتقييم لغياب نبضات القلب والدورة الدموية.
ملاحظة: لأن يتم الحفاظ على اليرقات في أماكن منفصلة، اليرقات يمكن فردياً استردادها عن طريق سحب بلطف على أجار بالملقط أو ماصة. يمكن إزالة في أجار من منطقة الرأس واليرقه المستخدمة لإجراءات إضافية، مثل تثبيت لتلطيخ جسم أو معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين. - بعد إزالة اليرقات واجار، تنظيف زويدجي مع الإيثانول والمقطر المياه، كما هو موضح في الخطوة 4، 1 وتعيين رأسا على عقب للهواء الجاف. مخزن مشمولة في مكان بارد وجاف. إعادة معطف مع اللبن المقشود (الخطوة 4.2) حسب الحاجة قبل استخدام المقبل.
ملاحظة: زويدجيس يمكن إعادة استخدامها عدة مرات، حتى تبدأ PDMS القادمة بعيداً عن الزجاج-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الجهاز موائع جزيئية PDMS زويدجي جهاز مستقلة وظيفيا مصممة لاستيعاب المهام الرئيسية الأربعة (المذكورة أدناه) المرتبطة بتصوير لايف والذيلية الزعنفة إصابة الشفاء وإعادة النمو في اليرقات الزرد. واختير PDMS لتصنيع زويدجي لأنها ليست متاحة بسهولة إلا ومعيار الصناعة لتوافق مع الحياة، ولكن أيضا يعمل جيدا في قوالب. بالإضافة إلى ذلك، يجعل PDMS الجهاز القابل لإعادة الاستخدام وخالية من الحواف الصلبة أو الحادة حالما يتم تشكيل الجهاز. زويدجي على وجه التحديد يسمح 1) تحميل اليرقات في الجهاز، وضبط النفس 2) في التوجه السليم للتصوير، 3) مما أدى إلى إصابة زعنفة والذيلية، وتصوير 4) المجهرية، ووصف بالتفصيل أدناه.
تحميل
تصميم زويدجي يتكون من ثلاث قنوات، تم تصميم كل منها لكبح جماح يرقة واحدة (الشكل 1B). للتوجه اليرقة التحميل والأولية، قاعة مفتوحة تحميل 3 مم (الشكل 1A) لاستيعاب تلميح ماصة فوهة كبيرة لإيداع يرقة (الشكل 3A). علاوة على ذلك، الطول والعرض يتيح مجالاً كافياً للسماح بالتلاعب اليرقة اللاحقة في الاتجاه الصحيح، مع ذيل نحو النفق تقييدي والظهريه الجانبية نحو الأعلى (الشكل 3B).
ضبط النفس
مجرد اليرقة تم تحميلها في القناة، ويمكن أول ذيل مرسومة داخل النفق تقييدي بإزالة السائل من الدائرة مما أسفر عن إصابة أو دفع برفق في مكانة مع تلميح ماصة أو أداة مماثلة (الشكل 3). هندسة الدائرة تحميل (الشكل 1A)، من 3 مم إلى 0.45 ملم، على شكل القمع وأدلة اليرقة في الاتجاه الأفقي المطلوب (الشكل 3). التوجه لليرقة على جانبها يقيد الذيل تقريبا بالتوازي مع أسفل الطبق الزجاج لتحسين التصوير. خلافا لأجهزة موائع جزيئية باستخدام رقائق السيليكون، الهندسات قوالب المطبوعة 3D لا يلزم أن يكون متسقا في الاتجاه-z. ولذلك، تغطي النفق تقييدي ومدبب في محور ع أن ارتفاع الدخول أكبر من الخروج، من 0.5 مم إلى ارتفاع 0.3 مم (الشكل 1B، عرض متساوي القياس من النفق). هذا مستدق يسهل توجيه اليرقة وتسطيح الذيل نحو تصوير سطح الزجاج غطاء. هذه الوظيفة ويلغي الحاجة للمستخدم لتوجيه العينة بينما [اغروس] تقوية.
تتم إزالة من الدائرة تحميل (الشكل 3D) السائل ويتم استبداله بنقطة انصهار منخفضة [اغروس] استقرار الرأس داخل القناة مع الاحتفاظ الذيل غير المقيد في المخزن المؤقت في قاعة مما أسفر عن إصابة (الشكل 3E). يمكن بسهولة إزالة [اغروس] الحد الأدنى التي قد تسرب من خلال النفق زجري من الدائرة مما أسفر عن إصابة (الشكل 3F). الافتقار إلى [اغروس] في قاعة مما أسفر عن إصابة يسمح بنمو غير المقيد وتطوير fin والذيلية5.
مما أدى إلى إصابة
مرة واحدة تم تحميل من خلال النفق ورأسه مقيدة من [اغروس] اليرقة، fin والذيلية تتوفر ترانسيكتيون لأنها ناتئة إلى قاعة مما أسفر عن إصابة. ويقابل الدائرة مما أدى إلى إصابة نصف دائرة 1.9 مم من التماثل الأفقي. وهذا يسمح شفرة المبضع المراد إدراجها فقط فوق fin والذيلية، مما يتيح مساحة كافية للنصل استخلاص إلى الأسفل عبر الذيل، ترانسيكتينج fin والذيلية (الشكل 3). يحدث الجزء أوسع من دائرة نصف قطرها 7 ملم حيث جرح الذيل لاستيعاب هذه الحركة. بالإضافة إلى السماح للمستخدم بالجرح اليرقة، يوفر هذا التصميم المجزأة الفرصة للتطبيق الإقليمي للمركبات ل منطقة الذيل5. هذه الميزة الفريدة لعزله شبه سيسمح للتجارب مترجمة من آثار مختلف المخدرات أو المواد الكيميائية أو البيولوجية في عملية التئام الجرح.
تصوير
ويهدف الجهاز زويدجي للسماح بدقة عالية ضوء التصوير المجهري زعنفة والذيلية الزرد، دون عائق بالتضمين [اغروس]. ولهذا السبب، هو الرهينة الجهاز PDMS إلى صحن أسفل زجاج متاحة تجارياً، لتوفر سطح جودة بصرية للفحص المجهري باستخدام عدسات نا عالية. نقدم هنا الصور باستخدام الفحص المجهري مولتيفوتون للتصوير (SHG) النغمة التوافقية الثانية من ألياف الكولاجين في فنلندا والذيلية لتوضيح قدرات التصوير زويدجي. بيد زويدجي يمكن تطبيقها على الأساليب الخفيفة الميكروسكوب الأخرى، مثل الفحص المجهري [كنفوكل]، الاستفادة مجهر مقلوب مرحلة تكوين. مع زويدجي، خلافا للأسلوب [اغروس] التضمين مع إزالة اللاحقة، يمكن بسهولة تصويرها fin والذيلية في الجهاز قبل إصابة (الشكل 4A)، أصيب بجروح داخل الجهاز، ثم أعيد على الفور إلى المجهر للجرح بعد تصوير (الشكل 4 باء-E). العمل السابق التعرف على التغييرات في تنظيم ألياف الكولاجين أثناء عملية شفاء الجرح باستخدام SHG. 13 SHG يمكن استخدامها للكشف عن أنواع معينة من الهياكل المطلوبة، بما في ذلك الكولاجين فيبريلار، دون استخدام العلامات الخارجية. 14 صورة نوعية زعانف والذيلية الحية المصورة في زويدجي كانت مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في الأنسجة الثابتة5 ولكن في زويدجي يوفر عددا من المزايا. الأهم من ذلك، يمكن المضي في شفاء زعنفة والذيلية ونمو دون عائق بتضمينها مع بقاء اليرقات شبيه بيرقات نمت غير المقيد5[اغروس]. علاوة على ذلك، لأنه يمكن إجراء جرح بينما اليرقة في الجهاز، يمكن جمع صور ما قبل وما بعد إصابة في نفس والذيلية fin (الشكل 4 أ). يسمح زويدجي جمع بيانات الأبعاد 3 مع مرور الوقت، تقديم وجهة نظر أكثر اكتمالا من التغيرات الدينامية الحاصلة في هيكل المصفوفة خارج الخلية (الشكل 4 باء). يتضح هنا هو SHG استرخاء الألياف الجرح، في ثلاثة أبعاد، في أعقاب إصابة داخل زويدجي. قبل إصابة، اكتشف SHG ألياف الكولاجين تشع إلى الخارج من نوتوتشورد إلى طرف الزعنفة، (الشكل 4 أ). بعد وقت قصير من إصابة المسافة بين الحافة زعنفة المتعاقد عليها ومركز الزعنفة ه يزيد مع استرخاء الجرح. تسمح طبيعة جمع البيانات 3D تعمير المكانية، استخدام تقديم البرامج مثل إيماريس. إعادة البناء هذه، وخيارات الاستدارة اللاحقة، توضح أن الانكماش والاسترخاء زعنفة يحدث ليس فقط في الطائرة x y من مجموعة الصور (الشكل 4 ب، ج، د)، ولكن أيضا في المحور z (الرقم 4 ي ز، س لام، ف ر؛ أفلام تكميلية 1، 2) كما الذيل يسطح من حليقة التصاعدي للدولة المتعاقدة. يمكن استخدامها في زويدجي مع طرائق أخرى للتصوير على مدى فترات زمنية أطول، مثل الاستخدام [كنفوكل] الفحص المجهري للخلايا العصبية الصورة أثناء تطوير fin والذيلية على مدى 24 ساعة5. نظراً لأن وحدات تقييدي للجهاز هي اصطف التوازي، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى تدوير الجهاز عند تحديد موقع اليرقات، إعداد المجهر والانتقال بين عينات متعددة لتصوير بسيط ويمكن أن يكون آليا لجمع بيانات الوقت الفاصل بين صورة يرقات متعددة. لتوسيع عدد العينات التي يمكن تصويرها، يمكن وضع الجهاز زويدجي PDMS إلى تنسيقات أخرى زجاجية القاع، مثل لوحة 6-جيدا (الشكل 2).
الشكل 1 : التصميم النهائي التخطيطي (A) التخطيطي يظهر التخطيط العام وقياسات الجهاز زويدجي، وتسليط الضوء على المصطلحات المستخدمة دوائر مستقلة وظيفيا. (ب) عرض متساوي القياس PDMS الجهاز بإزالتها من القالب. (ج) يظهر اقحم النفق، وتسليط الضوء على التغير في مستويات الدخول والخروج. (د) نموذج ليرقة مقيدة في الجهاز. تعديل الرقم من قبل نشر المادة5 مع إذن طبع من المجلة الزرد . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تصنيع التخطيطي (A) الخطوة الأولى تبدأ بتصميم القالب الجهاز في 3D النمذجة البرمجيات (1.1) الذي هو ثم 3D المطبوعة (1.2). القوالب من ضوء الأشعة فوق البنفسجية الشفاء ثم غطى بالرمل وتنظيفها حتى الهندسات التي آثارها حتى ارتفاع (1.3). تتضمن الخطوة 2 ملء في القوالب مع PDMS مختلطة ويطرد (2.1) وتطبيق قرص زجاج على العفن في وجهة نظر لمنع محاصرة فقاعات الهواء في الجهاز PDMS (2.2). التي فرضت على الزجاج والعفن (2.3) معا لعلاج في فرن في 100سج لمدة ساعة على الأقل (2.4). الخطوة 3 يستخدم الهواء التي تمت تصفيتها ومسطحة ذات الرؤوس ملاقط لإزالة الجهاز PDMS من العفن (3.1). الجهاز ثم يوضع على رأس غطاء صحن التصوير (3.2) وهو تعامل البلازما (3-3)، جنبا إلى جنب مع أسفل الزجاج، للسماح PDMS على التمسك بالطبق أسفل الزجاج (3، 4). (ب) الجهاز زويدجي الانتهاء المستعبدين في صحن أسفل زجاج وعلى استعداد لاستخدام التصوير. (ج) يمكن وضع أجهزة زويدجي متعددة في لوحة 6-جيدا أسفل زجاج من أجل صورة يرقات كثيرة في نفس التجربة. تعديل الرقم من قبل نشر المادة5 مع إذن طبع من المجلة الزرد . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحميل وجرح اليرقة في زويدجي (أ) يرقة تم تحميله إلى الدائرة تحميل باستخدام ماصة واسعة الفوهة. (ب) تتجه اليرقة مع الجانب الظهرية ضد الجزء المسطح من التحميل دائرة القمع والذيل نحو النفق تقييدي. (ج) استخدام الشفط من طرف ماصة عقد عند المدخل إلى الدائرة مما أسفر عن إصابة يسترعى اليرقة داخل النفق، وضعه في الاتجاه السليم للتصوير. (د) تتم إزالة السائل من قاعة التحميل للسماح (ﻫ) الإضافة [اغروس] حول منطقة الرأس على استقرار اليرقة. [اغروس] هو اللون الأحمر هنا لأغراض العرض التوضيحي فقط. الحد الأدنى [اغروس] تسرب في الدائرة مما أدى إلى إصابة ويمكن إزالتها بسهولة كما هو موضح في (F). (ز) للجرح بمجرد اليرقة مقيدة في القناة، المدرجة أعلاه اليرقة شفرة المبضع وشرائح لأسفل عبر fin والذيلية، اللاحق نوتوتشورد. (ح) اليرقة جاهز الآن لتصوير ما بعد جرح. مقياس بار (أ-ح) = 1 مم؛ مقياس بار (F) = 1 مم؛ مقياس بار (ز) = 1 مم. الرقم معدلة من قبل نشر المادة5 مع إذن طبع من المجلة الزرد . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الفاصل الزمني مولتيفوتون 3D التصوير من ألياف SHG في فنلندا والذيلية الزرد، قبل وبعد إصابة، في زويدجي- تصميم زويدجي يوفر القدرة على التصوير بدقة عالية، وفي هذه الحالة SHG الألياف المنظمة السابقة (قبل الجرح) وعقب والذيلية زعنفة ترانسيكشن (بعد الجرح). تم جمع البيانات مداخن z على فترات 4 دقيقة. ويبين (ألف-هاء) SHG الألياف في fin والذيلية كإسقاط z-المكدسات، قبل وفي ترانسيكتيون بعد انتهاء فترات أربع. ض-الإسقاط أجرى باستخدام البرمجيات إيماجيج. 15 t = 0 وكان بدء التصوير، بحوالي 20 دقيقة ترانسيكتيون بعد. السهم المزدوج تشير إلى أن الزيادة في مسافة غيض حافة الجرح (خط أبيض قصيرة) بالنسبة لموقع نوتوتشورد (خط أبيض طويل) أثناء استرخاء الجرح بعد انكماش الأولية. (وي). إمالة التعمير ثلاثية الأبعاد للبيانات الأصلية. (K-O). التقديم السطحية لتعمير 3D إمالة سيظهر في واو-ياء (ع-ر). آراء الجانب التقديم التعمير 3D السطحية، التي توضح كيفية حدوث الانكماش والاسترخاء في مساحة ثلاثية الأبعاد، والتي يمكن تقييمها باستخدام هذه البيانات المجمعة باستخدام زويدجي حيث لا تقيدها fin والذيلية [اغروس]. مقياس بار (ألف-هاء) = 100 ميكرون؛ تغيير حجم شريط (و-T) =100 ميكرون. أجريت اﻷداءات ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج التصوير. انظر أيضا تكميلية أفلام 1 و 2. تعديل الرقم من قبل نشر المادة5 مع إذن طبع من المجلة الزرد . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : "خطوات حاسمة" لتصنيع (A) زويدجي لضمان لا شكل فقاعات أو الحصول على المحاصرين في الجهاز عندما تحامل على القرص الزجاج، ديغا بعد PDMS قد تم شغلها في قوالب وانحدار الزجاج لقط عند تطبيقه على PDMS في القالب. وبالإضافة إلى ذلك، لمنع PDMS من "الوميض" على التحميل وإصابة الدوائر، تأكد من الرمال في الجزء العلوي من الجهاز دقة لضمان أسطح هندستها عند تدفق لقط على الزجاج. (ب) عندما يشفي الجهاز بما فيه الكفاية في الفرن، جيوب هوائية بين PDMS والعفن وتشير إلى أنه سيكون من السهل لإزالة الجهاز. إذا كان لا يؤدي إلى إزالة الجهاز بسهولة، الأكثر احتمالاً بسبب علاج عدم كفاية الوقت أو درجة الحرارة أو القالب نفسه لم يكن على نحو كاف الأشعة فوق البنفسجية-الشفاء، أسفر عن تلوث راتنج المتبقية PDMS. (ج) عند تطبيق الجهاز للطبق أسفل الزجاج بعد المعالجة بالبلازما، تطبيق الضغط الخفيف مع نهاية الجزء الخلفي من ملاقط، بدءاً من منطقة النفق والعامل إلى الخارج نحو حافة الجهاز. إذا كان الجهاز لا السندات أيضا، كما يتبين من جيوب هوائية بين الجهاز والزجاج، إطالة مقدار الوقت في بندر البلازما وضمان عدم وجود لا الغبار بين سطح PDMS والزجاج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الفيلم 1: إمالة التقديم السطحي ثلاثي الأبعاد صور انقضاء الوقت مولتيفوتون من ألياف SHG في فنلندا والذيلية أثناء الاسترخاء بعد إصابة. SHG الألياف في fin والذيلية تصويرها زستاكس مع مرور الوقت بعد إصابة (بداية الفيلم حوالي 20 دقيقة بعد إصابة) في زويدجي. ض-مداخن أعيد وتقديمها السطح باستخدام برامج التصوير. الذيل يميل إلى إظهار ثلاثة أبعاد. الأمامي من اليسار. فيلم يناظر الصور لا تزال في الشكل 4 (كس). شريط المقياس = 50 ميكرون. اضغط هنا لتحميل الفيلم-
تكميلية الفيلم 2: منظر جانبي للتقديم السطحي ثلاثي الأبعاد صور انقضاء الوقت مولتيفوتون من ألياف SHG في فنلندا والذيلية أثناء الاسترخاء بعد إصابة. SHG الألياف في fin والذيلية تصويرها زستاكس مع مرور الوقت بعد إصابة (بداية الفيلم حوالي 20 دقيقة بعد إصابة) في زويدجي. ض-مداخن أعيد وتقديمها السطح باستخدام برامج التصوير. أظهرت أن يؤكد القبض على التغيرات الدينامية في محور ع عرض الجانب. الأمامي من اليسار. فيلم يناظر الصور لا تزال في الشكل 4 (ع-ر). شريط المقياس = 40 ميكرون. اضغط هنا لتحميل الفيلم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وغرض الجهاز زويدجي هو التقاط الفاصل الزمني 3D التصوير بتحقيق الاستقرار وتوجيه الأسماك ضمن المسافة العمل الصغيرة من هدف مجهر عالي الدقة. اجتماع هذه مواصفات التصميم، مع أنها أيضا تحسنا على إعداد التقليدية المستندة إلى أجار للتصوير الحي. هناك ثلاث خطوات حاسمة (أدناه) في تصنيع زويدجي، التي، إذا لم تفعل بشكل صحيح، يمكن أن يسفر عن الأجهزة المعيبة:
إعداد PDMS (الشكل 5 ألف)
لمنع حدوث فقاعات، ديغا في القوالب بعد إضافة PDMS. تحقق من أن كافة الفقاعات قد ألغيت بعد ولﻵﻻت وإيلاء اهتمام دقيق لتطبيق القرص الزجاج. ويجب تطبيق القرص الزجاج في وجهة نظر لضمان أن الهواء هو عدم الوقوع تحت وداخل PDMS. يمكن أن يكون الغبار مشكلة خلال معظم الخطوات العملية. لمنع الغبار وإتمام كل خطوة التنظيف جيدا وتخزين أجزاء في غطاء نظيفة بين الخطوات. تحقق من قوالب راتنج الزائدة التي قد تنشئ سطح خشن قبل علاج الأشعة فوق البنفسجية. عند الرملي، تأكد من أن تدفق الرمل ورقة جهات الاتصال يتم هندستها كافة لضمان أن جميع الأسطح (الشكل 2، الخطوة 1، 3). دائماً نظيفة مع كحول الأيزوبروبيل والهواء الحق قبل ملء القوالب مع PDMS. عند الضغط PDMS إضافي من العفن، ضمان المشابك أحكام عقد العفن والزجاج غطاء معا (الشكل 2، الخطوة 2، 3).
إزالة الجهاز من العفن (الشكل 5B)
ضمان الفرن هو على الأقل من 100 o ج ووقت العلاج على الأقل 1-1.5 ح. إذا كان لا يتم علاجه في PDMS بما فيه الكفاية، يمكن أن يكون من الصعب إزالتها من القالب. وتشمل الإمكانيات الأخرى للفشل في إزالة عدم خلط الكواشف PDMS طويلة بما يكفي، باستخدام نسب غير صحيحة للقاعدة ومقوي أو الراتنج بقايا المتبقية في القالب بعد 3D الطباعة الذي يلوث ثم PDMS. عند إزالة من الفرن، وجيوب هوائية بين الجهاز والعفن (الشكل 5B) تشير إلى أنه سيتم إزالة الجهاز بسهولة.
انضمام PDMS إلى الطبق زجاجية (الشكل 5)
قد يؤدي ضعف التمسك بزجاج صحن من الغبار أو اختلالها طول غير كاف للمعالجة بالبلازما. عند وضع الجهاز على الزجاج، نصيحة الطبق بزاوية ومركز PDMS على دائرة الزجاج مع التأكد من أنها لا تلمس حواف البئر. إذا كان الجهاز لا يتقيد، بعناية اضغط الجهاز على كشف الزجاج مع نهاية الجزء الخلفي من الملاقط، بدءاً من منطقة النفق الحساسة والضغط الخارجي للحواف. إذا كان الجهاز لا يزال لا يتقيد، التجربة عن طريق زيادة الوقت في البلازما أنظف بتزايدات دقيقة واحدة.
في حين يمكن تصويرها اليرقات في الجهاز لفترات قصيرة من الوقت (بالدقائق) دون استخدام أجار، هدف طويل الأجل العيش-تصوير منطقة زعنفة والذيلية، أجار يوضع على رأسه في قاعة تحميل بعد السمك قد تم تحميلها. على الرغم من أن هذا التطبيق لاجار لا يبدو أن تؤثر على الجرح شفاء استجابة أو بقاء اليرقات5، يمكن أن يؤثر هذا الدراسة من أكثر المناطق الأمامية من اليرقات. على الرغم من أن استطعنا إلى صورة يرقات ليصل إلى 60 ح وقد درسنا لا سواء أن أثرت البقاء مع أوقات أطول في التصوير. بالإضافة إلى ذلك، كان الأمثل تصميم خاصة المقدمة هنا لسن 2 إلى 4 أيام اليرقات التسميد (إدارة الشرطة الاتحادية) الكذب على الجانبين ترانسيكتيون الذيل والجرح الشفاء تصوير. مراحل النمو، والتوجهات والبروتوكولات التجريبية الأخرى قد يتطلب إدخال تعديلات على التصميم. ومع ذلك، نمطية الوظيفية المتعمد للتصميم يجعلها سهولة قابلة لمثل هذه التعديلات.
وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب تصنيع هذا الجهاز الوصول إلى طابعة 3D وغيرها من المواد موائع جزيئية والمعدات، مثل PDMS وبلازما أنظف، ويحتمل أن تحد من إمكانية الوصول إلى الجهاز لبعض المستخدمين. ومع ذلك، تم اختيار هذا الأسلوب من تلفيق العفن نظراً لقدرات الطباعة 3D، جنبا إلى جنب مع التصنيع ميكروفلويديكس، أصبحت أكثر انتشارا في حرم الأكاديمية. بالإضافة إلى ذلك، هناك موفري خدمة 3D الطباعة المتاحة، كما التكنولوجيا تتطور بسرعة وتكلفة طابعات النقصان.
نظراً لتصميم مجزأة ووظيفة، زويدجي يقدم تحسينات على الأسلوب الحالي لمجموعة الصور مرور الوقت استخدام التضمين أجار. أولاً، لا تحيط [اغروس] منطقة الذيل في زويدجي، تسمح بالتئام الجروح والتجديد للتقدم غير مأهولة بينما بقاء اليرقات في زويدجي قابل للمقارنة إلى عناصر التحكم المضمنة وغير المضمنة5. ثانيا، يسمح استخدام الطباعة 3D عالية الدقة اختﻻق القوالب زويدجي أن يكون الهندسات المنحدرة فريدة من نوعها لتوجيه اليرقة في الأبعاد الثلاثة فيما يتعلق بالطائرة التصوير. يؤدي هذا إلى إزالة التبعية الوقت التلاعب اليرقات إلى اتجاه سليم كما أجار يصلب. ثالث مهم هو الاستفادة تصميم زويدجي تصميم الدائرة المفتوحة التي يسمح بالذيل والرأس من المناطق لتكون في متناول للتلاعب التجريبية. وهذا من مصلحة محددة للجرح شفاء الدراسات، ولكن هذا أيضا يجعل من زويدجي أداة يمكن أن تكون مفيدة للمعالجات الأخرى. وعلاوة على ذلك، يغلب تصميم الجهاز، ويتيح الفرصة للتطبيق الإقليمي للمركبات أثناء التجريب. يعزل الجهاز شبه الرأس من الذيل بسبب الفارق نشرها من المخزن المؤقت (في قاعة مما أسفر عن إصابة) و [اغروس] (في قاعة تحميل)5، السماح للتطبيق للمركبات أثناء الدراسة التئام أو البيولوجية الأخرى العمليات. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن اليرقات تقام في قنوات منفصلة، اليرقة الفردية يمكن تحديدها واستردادها بعد انتهاء التصوير لمعالجة إضافية مثل تنقية الحمض النووي الريبي أو البروتين أو وصفها بالضد. وأخيراً، نظراً لأن الجهاز مصنوع من PDMS التي قد تم المستعبدين للطبق الزجاج أدنى، الجهاز القابل لإعادة الاستخدام بمجرد إزالة اليرقات.
في التحرك إلى الأمام، لتصميم وحدات وسهولة تلفيق زويدجي سوف تصلح جيدا للتعديل لتغيير وظيفة. حاليا، يتم بناؤها الهندسات يغلب خصيصا للتجارب مما أدى إلى إصابة والتصوير الموصوفة، يعطيها التطبيق الواسع لتصوير مباشر لالتئام الجروح. ومع ذلك، تكمن اليرقة مباشرة على الزجاج، مثل وجود أية مواد (أي PDMS)، التي قد تتداخل مع التصوير، بين اليرقة وتصوير سطح. ولذلك، من مناطق أخرى من اليرقات، مثل الجذع، سيتمدينار يكون موجوداً للتصوير. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل تصميم القالب المطبوع 3D من زويدجي سهولة لاستيعاب مراحل النمو الأخرى، وتوجهات مختلفة من اليرقة والعلاجات المتنوعة. هذه السمات تجعل من ذلك أداة قيمة لالتقاط الوقت الفاصل مجهرية من الأحداث عبر مجموعة متنوعة من المقاييس الزمنية. يمكن أن تتيح استخدام تنسيقات أخرى طبق أسفل الزجاج أكبر PDMS الأجهزة ومساحة للمزيد من القنوات. ونظرا لتزايد إمكانية الوصول إلى تقنيات تصنيع 3D الطباعة وسهولة التعديل اللاحق لمجموعة متنوعة من البروتوكولات التجريبية، قد يثبت زويدجي أن تكون أداة قوية في مجال حية مجهرية التصوير عالية الدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب تود أن تقر تمويل المشاريع الأولية من معهد مورجريدجي للأبحاث والمختبر الضوئية و "الأجهزة الحاسوبية". نعترف أيضا بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة # R01GM102924 (AH وكوي). خ، دائرة الخدمات الطبية المشتركة، وجمهورية صربسكا، آه وكوي تصور وتصميم الدراسة. خ، ودائرة الخدمات الطبية المشتركة أجرى تجارب جميع مع دعم من DL وعملية كيمبرلي وجمهورية صربسكا. خ، شبيبة، وجمهورية صربسكا، آه وكوي أسهم في كتابة المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
