Summary
本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害)、オリエント、ゼブラフィッシュ幼虫を抑制するように設計の区画化装置であります。デザインは、離断尾と創傷治癒と再生の高解像度蛍光顕微鏡画像の長期的なコレクションを許可します。
Abstract
ゼブラフィッシュの幼虫は、発生生物学と創傷治癒過程の両方の重要なモデル生物です。さらに、ゼブラフィッシュの幼虫は細胞の分解能で時間と空間の動的な生命現象のライブ高解像度顕微鏡イメージングの貴重なシステムです。しかし、幼虫の発育と組織再生、ライブ イメージングの agarose のカプセル化の伝統的な方法が低下します。したがって、本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害) を設計・製作を確保しながら高分解能顕微鏡の幼虫を方向づけるための機能的区画化装置としてデバイスとその後の気ままな尾開発と再成長内尾鰭断裂。このデバイスは、負傷と生存率を維持しながら長期的なイメージングできます。ZWEDGI 型は、3 D プリントは、そのジオメトリのカスタマイズ性は多様なゼブラフィッシュ イメージング アプリケーションを簡単に変更、です。さらに、zWEDGI は、負傷や試薬の応用実験中に幼虫へのアクセスなど、数多くの利点は並列合理化されたイメージングのための複数の幼虫の方向とデバイスの再利用性を提供しています。
Introduction
ゼブラフィッシュ仔動脈分布の再生能力ように理想的なモデル有機体傷害応答として、癒しと再生1,2,3、4を調べること。アクセス トランスジェニックゼブラフィッシュ ラインおよびゼブラフィッシュの解剖学的なさらなる透明性の配列には、傷応答イベントとして長期的な再生プロセス4の研究生体内でそのユーティリティを強化します。したがって高画質タイムラプス蛍光顕微鏡を使用してこれらの生物学的過程の研究は、生存率を維持しながら高い安定性とゼブラフィッシュ幼虫の最小限の動きは、ライブ イメージング ゼブラフィッシュ デバイスを要求します。それはキー デバイスにより、ヒーリングしながら効果的な負傷のため、再生発生装置によって影響を受けないです。
Agarose のライブ イメージング中に幼虫を埋め込みの標準的なライブ画像安定化方法の成長を制限する傷の再生5と幼虫が 4 の後心臓ストレスと組織壊死の徴候を示し始めるので、死亡率を高める可能性があります。時間4。したがって、関心領域から agarose の除去は正常な開発を許可する必要があります、再生6、agarose として潜在的な損傷に幼虫を公開を切り取る。さらに、技術を埋め込みアガロースとユーザーを方向づけなければならない短い時間で幼虫 agarose5,6,7を固化する前に。急速に幼虫を操作するだけでなくユーザーのスキルが必要です、それはまた幼虫への損傷のリスクします。シリコン真空使用グリース、塩ビ配管その他イメージング室を作成する畝寒天井戸3または divets8など、これらの欠点を回避するためにライブ イメージングのための幼虫を安定させるための方法が記載されているが材料6と回転チューブ9、これらのメソッドの多くの集中的な厄介な多くの場合非再利用可能、労働環境操作を許可しない (薬物治療、負傷など。) 魚がマウントされた後。
したがって、zWEDGI デバイス (図 1) は、寒天試料の操作中ゼブラフィッシュ幼虫の長期のライブ イメージングを使用する実装の欠点のいくつかを克服するために設計されました。ZWEDGI は、荷重、拘束、負傷、2 〜 4 日後受精ゼブラフィッシュ幼虫のイメージングの 3 セミオープン区分室を許可する (図 1 a) で構成されます。デバイスはポリジメチルシロキサン (PDMS) からを作製し、60 mm ガラス下部イメージング皿のカバー スリップの上に配置されます。モジュラー デザインと標準的な製造技術の使用変更に対応しやすく、プロシージャの特に実験プロシージャの様々 な zWEDGI デザインただしここで示した設計は創傷治癒研究、意図されていたこと実験操作と長期的なイメージングの最小限の拘束が必要です。
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Protocol
注: ゼブラフィッシュ幼虫 2 〜 4 日後受精 (dpf)、ウィスコンシン大学マディソン校の研究動物リソース センターのガイドラインに従ってください用基本 zWEDGI デザインに処方されました
。1 です。 設計と金型の 3 d 印刷
目的形状と 3 d モデリング ソフトウェア 5 で属性を持つデバイスの- モデル、PDMS コンポーネント。空白の金型と PDMS 部分のアセンブリを作成し、PDSM 部品に対応する金型のキャビティを作成することによって PDMS 一部の否定的な型を生成します。金型を 3 D プリント ( 図 2 は、手順 1.1) の .stl ファイルとして保存します
。 注: ここで示した金型設計 ( 図 1) の光造形 (.stl) 形式ファイル https://morgridge.org/designs/ でダウンロード可能です 。
感光性樹脂 3 D プリンター ( 図 2、ステップ 1.2) を使用して - 印刷金型。複数の金型を作る単一の印刷で可能であれば、ので複数デバイス成形できる PDMS の単一のバッチで
。 注: の例は、0.075 mm ビーム直径と 0.05 mm 層の厚さと、感光性樹脂樹脂 5 を使用して高解像度モードでプリントしました。- 優しくスクラブ、未硬化の樹脂を除去するため細かいブラシ、変性アルコール スプレー ボトルで圧縮空気を使用して金型クリーン。マイクロ地域から任意の材料を削除します 。
- 後未硬化の辞任はゼブラフィッシュ幼虫 10 に有毒であると 60 分それぞれの側に UV ポスト治療装置にはカビを治すです 。
- 砂の平らな面に 200 の屑の紙やすりと金型のキャビティ側まですべてのシール面はサンドペーパー (チャネル形状、金型周囲の読み込み) と接触しています。軽く砂 400 と 600 粒の砂紙で徐々 に、すべてのジオメトリ フェーシング ( 図 2、手順 1.3) でフラッシュの滑らかな表面を生成します。ダイヤル ゲージ設計深度に近いことを確認するとサンディングの後、キャビティの深さを測定します。
- 型をきれいにし、超音波クリーナー 30 分のための水でいっぱいに配置することによって流水の下でフラッシュ ディスク (1 3/4 インチの直径 1/4 インチ厚いホウケイ酸ガラスまたはアクリル ×; 金型ごとカバー 1 つのガラス) をカバーします 。
- 爆破する圧縮空気で乾燥と清潔両方金型をイソプロピル アルコールとフィルター選択された圧縮空気をカバーします。浮遊残骸からの汚染を最小限に抑えるためにデバイスを作製するのに場所としてクリーン ベンチを使用します。洗浄金型とガラスをクリーン ベンチまたは必要になるまで覆われてペトリ皿でカバーを残す 。
2。ZWEDGI デバイスの PDMS 作製
- 注ぐ 184 による確認、PDMS シリコーン エラストマー ポリジメチルシロキサン (PDMS) で、ベースの比率 5:1 (活性化する) プラスチックのカップに。木製クラフト棒で、パンを混練のような自体にゲルをかき混ぜながら 2 分のためによく混ぜます。5 金型を使用するには、ベースと活性剤 2 g 10 g を使用します。
- 解消ガス真空デシケータ 25 時間 45 分のための混合物すべての泡がなくなるまでです 。
- 約 0.75 ml の 10 mL の注射器を使用して金型はわずか半月板 ( 図 2、ステップ 2.1) あふれるまで PDMS の各 3 D 印刷金型の空洞を入力します 。
- 解消ガス充填充填時を形成している可能性があります追加の泡を削除する 45 分用金 。
- ( 図 2、手順 2.2) をトラップから泡を防ぐために斜めにディスクを押し、PDMS 充填型の上にガラスのカバー ディスクを適用します。ガラス ディスク カバーが適用される追放される余分な PDMS を許可します 。 金型のカバー ディスクをしっかりとホールドする
- 使用小型ラチェット クランプします
。 注: これは、平らな面を作成します、PDMS、硬化させるし、3 D プリント ジオメトリのガラス製カバー スリップと同じ高さに穴を生成します。また、一度に治すことができるデバイスの数を増やす、構築マルチ クランプ デバイス (例えば。 図 2、ステップ 2.3). - は、90 分 ( 図 2、ステップ 2.4) 100 o C のオーブンで固定された金型の PDMS 装置を治します。オーブンから金型を除去、簡単に処理できるまでを冷却すること。クランプ装置が金属の場合は金属が残留熱による PDMS を治すため継続するを防ぐためにクランプからカビやカバー ディスク アセンブリを削除します
。 注: デバイスがまだ少し暖かい完全治癒ではないが、金型から削除する最も簡単です。ただし、一度オーブンから、金型を削除カバー ディスクが削除されると、デバイスは離型に進む前に日のカップルのため座ることができます。場合はデバイスは、硬化オーブンから削除した後まもなく demolded は、完全に治すためにそれを可能にしながら汚染物質を最小限に抑えるため覆われてペトリ皿に置きます 。
3。ガラスの皿にプラズマ接合 zWEDGI
- クランプ ベンチ逆に PDMS デバイスを含む金型、金型 ' s 形状、平行で作業駅のベンチに直面して。
- スタート PDMS プル タブをフラット先端ピンセットを使用して、金型から解放することによって PDMS デバイスを削除します。(( 図 2 は、ステップ 3.1) の鍋からケーキを除去する) のようにピンセットで金型の周囲に作業 。
- 使用は、圧縮空気と優しくプル タブにデバイスの下の空気を吹きを金型からデバイスをプルするピンセットにフィルター処理されます。別金型から PDMS を助けるために空気を許可、薄いトンネル セクション周辺特別な注意をピンセットの先端を取ってゆっくり仕事します 。
- トンネル拘束ウェッジ プラスチック ( 図 2 は、ステップ 3.2) に触れているので、ガラス底皿のカバーの内側に逆さま PDMS デバイスを配置します 。
- に逆さまに zWEDGI と対応するガラス底皿皿カバー プラズマ クリーナー ガラス内側上向き ( 図 2、ステップ 3.3)。
- プラズマ圧力に達する 500 mTorr まで清掃を避難 。
- セット無線周波数 (RF) 電源高。デバイスを公開し、RF 周波数約 2 分のために料理ゆっくりと逆加圧チャンバー、クリーン ルーム フード デバイスと皿を返します 。
- PDMS デバイス皿カバーから取り外します。
- ガラス底皿 ( 図 2、ステップ 3.4) の中央に慎重にピンセットのバックエンドを使用してそれを配置することでガラスを正しい向きに PDMS zWEDGI を裏返して、軽く押し下げて、PDMS空気の泡が下に挟まれていないことを確認するデバイスです。マイクロ チャンネルの分のジオメトリの周囲の圧力を適用し、( 図 5) のエッジを滑らかに、PDMS
。 メモ: PDMS とガラスとの完全な接触はプラズマ接合からのよりよい付着を確認します。ZWEDGI デバイスは、プラズマ グラスボート 6 ウェル plat など、他の形式の底のガラス皿に結合をすることができます。e ( 図 2). - はクリーン ルーム フードから取り外す前にデバイスの料理をカバーを配置します
。 注: デバイスがガラスに固定されている一度プロトコルを一時停止できる使用の準備ができているまで 。
- ガラス底皿 ( 図 2、ステップ 3.4) の中央に慎重にピンセットのバックエンドを使用してそれを配置することでガラスを正しい向きに PDMS zWEDGI を裏返して、軽く押し下げて、PDMS空気の泡が下に挟まれていないことを確認するデバイスです。マイクロ チャンネルの分のジオメトリの周囲の圧力を適用し、( 図 5) のエッジを滑らかに、PDMS
4。チャネルの準備と読み込み幼虫
注: 一般的なゼブラフィッシュ飼育、ゼブラフィッシュ本、利用可能なあたりオンライン http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html で実施されました。アダルト ゼブラフィッシュと胚は、 1 を前述のように維持されました。AB 型野生菌株を使用しました。機関に従う ’ 生きている幼虫をイメージングの要件について具体的に s 動物ケア プロトコル
。- リンス チャンネル、マイクロ ピペットを使用して処分をリンスするあたり 70% のエタノールを 100 μ L の最小限に抑えてチャンネル トンネルします。エタノールと 2 または 3 回二重蒸留水ですすぎを削除します。乾いた空気で乾燥させて 。
- は、幼虫の皿のガラス基板への付着を最小限に抑えるために室温で 10 分間 (1% の水で希釈濃度) でスキムミルクでチャンネルを入力します。その後、優しく数回洗浄する二重蒸留水中のデバイスが水没します。乾いた空気乾燥させて逆さま
。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。ZWEDGI デバイスのこの準備には、使用する日前にいくつかを行うことができます。室温で覆われる保存します 。
- 100 μ L 2% 溶けて LMP アガロースを 100 μ L 2 と組み合わせることで (LMP) agarose E3 バッファー 11 x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine - 3-アミノ安息香酸エチル) で加温 38 o c. 準備 1% 低溶解点が 1% を維持します。38 o C ゲル化を防ぐためにホット ブロック内でアガロース/tricaine ソリューションです
。 注: 多光子顕微鏡 11、(キャスパー 12) などのいずれかの非色素ゼブラフィッシュ バリアントを使用または 0.2 mM 色素形成を防ぐために N フェニールチオウレアを含む E3 で幼虫を維持 11 色素による近赤外域波長の吸収を最小限に抑えることです
。 注意: N フェニールチオウレアは有毒です。機関に従う ' 処分規則 。
E3 - 麻酔幼虫を含む 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11 を バッファーします。幼虫が動かずとタッチの刺激に応答するまで待機します 。
- には、Tricaine/E3 の数マイクロリットルとチャンネル事前濡れています。
- ピック ワイド オリフィスのピペット チップを使用して単一の幼虫を。( 図 3 a) チャンネルの読み込み中に幼虫を入金します。背側の面は、チャンバーと差し止めトンネル ( 図 3 b) に向かって尾面の直線エッジがよう、チャンバーの幼虫に回転ピペット チップまたは同様のツールを使用します 。
- は、慎重に差し止めトンネル ( 図 3) に流入する幼虫をできるように、負傷商工会議所から羊水を抜き取る。幼虫 ( 図 3 D) の周りの水分を維持しながら、液体のほとんどを削除します。このプロセスは、負傷の商工会議所の方にわずかに皿を傾けることによって支援することができます 。
- Tricaine/E3 で 1 %lmp アガロースを配置 (38 ~ o C) 幼虫に ' s ヘッド、チャンバー ( 図 3E) を充填します。適切な位置で幼虫を固めるための agarose を許可します。水和を維持するために必要に応じて負傷の商工会議所に Tricaine/E3 を追加します。残りの 2 チャネルのプロセスを読み込み、これを繰り返します 。
- 負傷の商工会議所 ( 図 3 f) に差し止めのトンネルを通って浸透する agarose を丁寧に注射針を使用しています。追加 tricaine/E3 (負傷、短期的イメージング、または傷治療の分離) のための agarose だけでいずれかを追加したり、培養皿 (長期用) を記入します。蒸発を防ぐために培養皿のふたを交換します。幼虫をこの時点で (無傷) イメージまたは負傷できます 。
5。負傷とイメージングの幼虫
- 脊索 11 人が負傷した商工会議所 ( 図 3 G, H) の後方の垂直尾翼をトランセクト滅菌メス刃を使用しています。必要な場合追加 tricaine/E3 を追加し、培養皿のふたを置き換えます
。 注: また、関心の発達期間によって、幼虫負傷、E3 で回復を許可して保守できるインキュベーター (28.5 o C) で彼らとしてチャンネルに読み込まれるその時点で目的のイメージングの時間まで上記で説明した 。
- は、60 mm ガラスの下皿を収容する舞台挿入で倒立顕微鏡上に麻酔の幼虫と zWEDGI デバイスをインストールします。目的の位置にしっぽを取得する必要に応じて料理を回転最上位チャネルで幼虫の尾を探します。特定の実験に必要なイメージします
。 注: zWEDGI 高解像度光学顕微鏡検査、蛍光広視野レーザ顕微鏡など広く適用されます。ゼブラフィッシュ幼虫を撮像パラメーターに関する考慮事項の数がありますが、特定パラメーターをイメージングは、楽器、サンプルおよび実験依存。ここでは、幼生の尾を次のパラメーターを利用したカスタム ビルド多光子顕微鏡 5 , 11 にイメージしました: 長い作業距離水浸対物レンズ、890 nm レーザー励起 X 40445/20 nm 発光フィルターと 512 x 512 解像度 。
6。実験の終わり
- 削除顕微鏡から zWEDGI 料理。氷水浴または 4 o C、少なくとも 20 分のために、zWEDGI を配置することによって幼虫を安楽死させるし、ハートビートや循環の有無を評価します
。 注: 幼虫が別々 のコンパートメントに保管されるため、幼虫個別に回復できます鉗子やピペットで寒天を注意深く引いて。寒天は、頭部領域と幼虫用抗体の汚損のための固定など、その他の手順または RNA または蛋白質の抽出のための処理から削除できます 。
- 幼虫と寒天培地を除去した後エタノール zWEDGI と蒸留水、手順 4.1 で説明した清潔で乾燥空気を逆さまにセットします。ストアは、涼しい、乾燥した場所で説明します。スキムミルク (ステップ 4.2) 次の使用前に必要に応じて再コートします
。 注: zWEDGIs 再利用できる複数回、PDMS がガラスから来るだすまで 。
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Representative Results
ZWEDGI PDMS マイクロ流体デバイス癒しとゼブラフィッシュ幼生の再生が負傷した尾鰭のライブ イメージングに関連付けられている (下記参照) 4 つの主要な機能に対応するために設計された機能的区分装置です。PDMS は、それだけ容易に利用可能ではないため、生体適合性、しかしまた金型でうまく動作するための業界標準 zWEDGI 作製に選ばれました。また、PDMS なりますデバイス再利用可能なとハード鋭利な先端のボイド デバイスが形成されます。ZWEDGI は、特にイメージング、3) 尾鰭と 4) 顕微鏡イメージングの負傷の適切な向きで 1) デバイスに幼虫、2) 拘束の読み込みを許可、以下で詳しく説明します。
読み込み
ZWEDGI デザインは、3 つのチャネルで構成されています、それぞれ 1 匹の幼虫 (図 1 b) を抑制するように設計。幼虫の読み込みと初期の向き、オープンのチャンバーは幼虫 (図 3 a) を堆積させるための大形オリフィス ピペット チップに合わせて 3 mm 幅 (図 1 a)。さらに、長さと幅は、差し止めトンネルに向かって尻尾と背側上部 (図 3 b)、正しい向きに幼虫の後続の操作を許可するための十分な部屋を提供します。
拘束
幼虫がチャンネルに読み込まれると、負傷の商工会議所からの流体の除去による抑制のトンネルに描かれた尾最初またはゆっくりピペット チップまたは同様のツール (図 3) を所定の位置に微調整できます。0.45 mm、3 mm からチャンバー (図 1 a) の漏斗状ジオメトリは、希望する横方向 (図 3) に幼虫をガイドします。イメージングを向上、その側に幼虫の向きは皿のガラスの底と平行して約尾を抑制します。シリコンウエハーを使用したマイクロ流体デバイスとは異なり 3 D 印刷金型の形状は必要 z 方向の一貫性はありません。したがって、処分のトンネルは覆われて、入口の高さが 0.5 mm 〜 0.3 mm 高さ (図 1 bトンネルの等角図) からの出口を超えるように z 軸のテーパします。この先を細く幼虫の指導、カバーガラス表面のイメージングに向けた尾の平坦化が容易になります。この機能は、アガロースは硬化中試料の向きをユーザーの必要性を排除します。
流体は、チャンバー (図 3 D) から削除され、尾は負傷の商工会議所 (図 3E) での気ままなバッファーを保持したまま、チャネル内で頭を安定させるために低融点アガロースに置き換えられます。トンネル拘束漏れる可能性のある最小限のアガロースは、負傷の商工会議所 (図 3 f) から簡単に削除できます。負傷の商工会議所の agarose の欠如は、気ままな再生と尾鰭5の開発を許可します。
負傷
幼虫がトンネルと agarose によって拘束されたヘッドによって読み込まれると、それは負傷の商工会議所に突き出たために、尾鰭は断裂の使用。半円形負傷商工会議所は、水平方向の対称性から 1.9 mm にオフセットされます。これにより、メスの刃、ブレードが尾鰭 (図 3) を transecting、尾下方引かれるに十分なスペースを許可する尾鰭のすぐ上に挿入されます。この動きに合わせて尾を負傷する、直径 7 mm の半円の最も幅の広い部分に発生します。幼虫を傷にユーザーを許可する、に加えてこの区分の設計は尾地域5化合物の地域のアプリケーションのための機会を提供します。創傷治癒過程に及ぼす様々 な薬があり、化学薬品、または生物学的エージェントのローカライズ テスト用セミ免震のこのユニークな機能になります。
イメージング
ZWEDGI デバイスの目的は高解像度を許可、アガロースを埋め込むことによって妨げられることゼブラフィッシュ尾びれの顕微鏡イメージングの光します。このため、高 NA レンズを使用して顕微鏡の光学的品質表面を提供するために、市販のガラス底皿に PDMS 装置を接着します。多光子顕微鏡尾鰭コラーゲン線維の第二高調波 (SHG) イメージングを用いた、zWEDGI のイメージング機能を説明するために画像をご紹介します。しかし、zWEDGI は、共焦点顕微鏡、ステージ コンフィグレーションの倒立顕微鏡を利用などの他の光顕的観察方法に適用できます。後続の除去を埋め込む agarose のメソッドとは異なり、zWEDGI 尾鰭 (図 4 a) が負傷した後の傷の顕微鏡にすぐに返されます、デバイス内で負傷する前に視覚化される簡単にイメージング (図 4 bE)。前作では、SHG を用いた創傷治癒過程中にコラーゲン繊維組織の変更が検出されました。13 SHG は外因性ラベルを使用せず、フィブリル型コラーゲンを含む順序の構造の特定の種類を検出するために使用できます。14イメージ固定ティッシュ5が、zWEDGI で得られた類似していた、zWEDGI で画像化された生活尾部フィンの品質は多くの利点を提供します。最も重要なは、尾鰭の癒しと再生を気ままな5を成長の幼虫のような幼虫の生存と埋め込み agarose によって妨げられることがなく続行できます。さらに、幼虫がデバイスにある間、負傷を実行できます、ので前と人が負傷した後の画像は同じ尾鰭 (図 4 a) で収集できます。ZWEDGI は細胞外マトリックス (図 4 b) の構造で発生する動的な変更のより完全なビューを提供する時間をかけて、3 次元データのコレクションを許可します。ここで示した SHG 繊維傷緩和、3 次元で以下の通りです、zWEDGI 内で負傷しました。負傷する前に、SHG はコラーゲン線維は (図 4 a)、フィン先端に脊索から外側に向かって放射を検出しました。契約のフィンの先端と th のセンター間の距離が負傷した直後e ひれ傷緩和と増加します。3 D データ コレクション性は、Imaris などのレンダリング ソフトウェアを使用して、空間の再構成を許可します。これらの再建と以降の回転オプションを示して収縮と画像コレクション (図 4 B C D) の x y 平面のみならず、z 軸 (図 4 フィンの緩和が発生します G J L O Q T;補足的な映画 1、2)尾として契約の状態の上向きのカールから平坦化します。ZWEDGI は、長い期間、24 h5以上尾びれ開発中画像ニューロンに共焦点顕微鏡の使用など他の画像診断装置で使用できます。デバイスの保全ユニットを並べ、平行、幼虫を検索するときは、デバイスを回転する必要がなくなりますので、顕微鏡のセットアップしイメージングのための複数の標本間での移動は簡単で、収集を自動化できます。複数の幼虫のタイムラプス映像データです。イメージを作成することができますサンプルの数を拡張するには、PDMS zWEDGI デバイスは 6 ウェル プレート (図 2) などの他のガラス底形式に配置できます。
図 1: 最終的な設計図 (A)一般的なレイアウトと機能的区分室の用語を強調表示、zWEDGI デバイスの測定を示す模式図。(B) PDMS のデバイスとしては、金型から削除の等角図。(C)インセットは入口と出口の高さの変化を強調表示トンネルを示しています。(D)デバイスで拘束された幼虫のモデル。図から変更、以前ゼブラフィッシュジャーナルから転載許可を得て記事5を公開します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 試作回路図 (A)ステップ 1 は、3 D モデリング、3 D 印刷 (1.2) は、ソフトウェア (1.1) でデバイス金型の設計から始まります。金型、紫外線硬化し、紙やすりで磨かれる、きれいに上げられたジオメトリは、高さ (1.3) を持っているので。手順 2 に、混合および脱 PDMS (2.1) で金型を充填し、PDMS (2.2) デバイスにおける気泡のトラップを防ぐために斜めに金型にガラス ディスクを適用をします。ガラスと金型をクランプ時間 (2.4) 少なくとも 100oC のオーブンで硬化するため一緒に (2.3)。ステップ 3 は、PDMS デバイス金型 (3.1) から削除するのにフィルターの空気とフラット先端ピンセットを使用します。デバイス画像の皿のふた (3.2) 上に格納されます、ガラス底皿 (3.4) に準拠する PDMS を許可するように、ガラス底と一緒に (3.3)、扱われるプラズマです。(B)完成した zWEDGI デバイスは、ガラス底皿とイメージングの使用の準備ができてを接着します。(C)複数の zWEDGI デバイスは、同じ実験で多くの幼虫をイメージするガラス下部 6 ウェル プレートで配置することができます。図から変更、以前ゼブラフィッシュジャーナルから転載許可を得て記事5を公開します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 読み込みと zWEDGI (A) の幼虫の負傷幼虫は、全体オリフィス ピペットを使用してチャンバーに読み込まれます。(B) 、幼虫は読み込みの平坦な部分に対して背側を向いた漏斗と差し止めトンネルに向かって尾商工会議所します。(C)ピペット先端から吸引を使用してイメージングの適切な向きで配置すること、トンネルに幼虫を描画負傷室に入り口に開催されました。(D) (E)の幼虫を安定させるために頭部の周り agarose の追加を許可するチャンバーから流体が削除されます。アガロースは、デモンストレーションのみを目的のため、ここで赤い色です。最小限の agarose 負傷の商工会議所にリーク、 (F) に示すように、簡単に削除することができます。(G)幼虫はチャネルで拘束された後に、メスの刃は幼虫の上に挿入、脊索の後方、尾鰭の間でダウン スライスします。(H)幼虫は後巻きイメージングのため準備が整いました。スケール バーの (A ~ H) = 1 mmスケール バーの (F) = 1 mmスケール バーの (G) = 1 ミリメートル。 図から変更、以前ゼブラフィッシュジャーナルから転載許可を得て記事5を公開。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: SHG 繊維ゼブラフィッシュの尾鰭、前の画像と、zWEDGI で負傷後 3 D 多光子タイムラプス。この場合 SHG 繊維組織の尾鰭の前 (前巻) およびフィン (後の傷) の断裂、zWEDGI デザインが高分解能イメージングのための能力を提供します。データは、z スタックとして 4 分間隔で収集されました。(A ・ E)は、z スタック前に、4 つの間隔後離断での投影として尾鰭で繊維の SHG を示しています。Z 投影は、ImageJ ソフトウェアを使用して行った。15 t = 0 イメージング、約 20 分後離断のスタートとなった。二重矢印、創初期収縮の緩和の間に脊索 (長い白い線) の位置からの相対傷痕 (短い白線) の先端の距離の増加を示します。(F J)。元のデータの 3次元復元を傾いた。(K O)。F j. に示すように傾斜の三次元の表面のレンダリング(P T)。どのようにこのデータを評価することができます 3 次元空間で発生する収縮と弛緩を示す三次元表面のレンダリングのサイドビューは、尾鰭が agarose によって拘束されていない、zWEDGI を使用して収集。スケール バーの (A ~ E) = 100 ミクロン。スケール バーの (F T) =100 ミクロンです。3 D レンダリングは、イメージング ソフトウェアを使用して行った。また、補足的な映画の 1 と 2 を参照してください。図から変更、以前ゼブラフィッシュジャーナルから転載許可を得て記事5を公開します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ZWEDGI 作製 (A) の重要なステップ泡フォームがないことを確認またはガラス ディスクにクランプするときにデバイスに閉じ込められてしまう、ドガの PDMS が金型に格納された後、金型で PDMS にそれを適用するとき、クランプのガラスを傾斜します。また、PDMS の読み込みを「点滅」を防ぐし徹底的に確保するため機器の上部を砂にように室が負傷したジオメトリのサーフェスがフラッシュするとき、ガラスのクランプします。(B)デバイスは、十分にオーブンで硬化させる、PDMS と金型との間の空気のポケットはデバイスを削除する簡単なことを示しています。デバイスで簡単に取れない場合最も不十分な硬化時間がある可能性や温度や金型自体はなかった十分に UV 硬化、PDMS の残留樹脂汚染の結果します。(C)ガラス底皿プラズマ治療後デバイスを適用すると、ピンセット、トンネルの領域から開始して、デバイスのエッジに向かって外側のバック エンドと光の圧力を適用されます。デバイスがデバイスとガラスの間の空気のポケットによって示されるように、よく接着しない場合プラズマ ボンダーで時間を長くし、PDMS とガラス表面の間にほこりがないことを確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足映画 1: 傾斜緩和後負傷中に尾鰭の SHG 繊維の多光子時間経過画像の 3 D 表面レンダリングします。尾鰭が負傷した後時間の経過と共に zstacks として撮像における線維の SHG (ムービーのスタートは負傷後、約 20 分)、zWEDGI で。Z スタックが再建され、表面は、イメージング ソフトウェアを使用してレンダリングされます。3 つの次元を示すために尾が傾いています。前方左側にあります。映画は、図 4 (K ・ O) で静止画像に対応します。スケールバー = 50 ミクロン。映画をダウンロードするここをクリックしてください。
補足映画 2: 緩和後負傷中に尾鰭の SHG 繊維の多光子時間経過画像の 3 D 表面レンダリングのサイドビュー 。尾鰭が負傷した後時間の経過と共に zstacks として撮像における線維の SHG (ムービーのスタートは負傷後、約 20 分)、zWEDGI で。Z スタックが再建され、表面は、イメージング ソフトウェアを使用してレンダリングされます。Z 軸のダイナミックな変化のキャプチャーを強調して示す側面図です。前方左側にあります。映画は、図 4 (P T) で静止画像に対応します。スケール バー = 40 ミクロン。映画をダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
ZWEDGI デバイスの目的は、安定化と高分解能対物レンズの小さな作業距離内にある魚の定位によるイメージング 3 D タイムラプスをキャプチャすることです。これらの仕様を満たしながらそれはまた、以上改善ライブ イメージングのための伝統的な寒天製剤です。正しく行われていない場合によって、欠陥のあるデバイスを zWEDGI の作製 (下記参照) の 3 つの重要な手順があります。
PDMS 準備 (図 5 a)
気泡を防ぐためには、金型をドガ PDMS が追加された後。すべての泡が脱ガス後解消されているし、ガラス ディスクのアプリケーションに注意を払うことを確認してください。ガラス ディスクは、斜め下と、PDMS 内に空気がトラップされていないことを確保するために適用する必要があります。ほこりは、プロセスの手順のほとんどの間に問題をすることができます。ほこりを防ぐためには、徹底的に各クリーニングの手順を完了し、ステップ間のクリーン フード パーツを格納します。UV 硬化前に大まかな表面を作成可能性があります余分な樹脂用金型を確認してください。研磨するとき (図 2、手順 1.3) をようにすべての表面のすべてのジオメトリは、砂のペーパーの連絡先にフラッシュを確認します。常にイソプロピル アルコールを清掃や PDMS の金型の充填の前に空気します。金型から余分な PDMS を絞るときはクランプはしっかりと金型を保持して、ガラス蓋を一緒にことを確認 (図 2は、ステップ 2.3)。
金型 (図 5 b) からデバイスを削除します。
確認、オーブンは少なくとも 100oC 硬化時間は、少なくとも 1 〜 1.5 時間です。PDMS の硬化が十分にではない、金型から削除する困難なことです。3 D 印刷をし、PDMS を汚染後に金型に残って残りの樹脂や硬化剤ベースの不正確な比率を使用して、十分長く PDMS 試薬を混合しない他を削除する失敗の可能性があります。オーブンから取り出すときにデバイスと鋳型 (図 5 b) の間の空気のポケットはデバイスが簡単に削除されることを示します。
ガラス底皿 (図 5) PDMS の付着
ほこり、ずれ、またはプラズマ処理の不十分な長さからガラスの皿は服薬アドヒアランス不良があります。ガラス上にデバイスを配置するときの角度で料理をヒントし、井戸の縁に触れないようにガラス サークルに PDMS を中心します。デバイスが満たしていない場合は、ピンセット、繊細なトンネル地域で始まり、端に外側に押してのバック エンドとガラス スリップにデバイスを慎重に押して。まだデバイスが満たしていない場合は、1 分単位でクリーナー プラズマの時間を増やすことで実験します。
短時間 (分) 長期ライブ イメージング尾鰭地域の目的のための寒天を使用せずにデバイスで幼虫のイメージを作成することができますしながら、寒天は、魚が読み込まれた後、チャンバーの頭に配置されます。創傷治癒応答または5幼虫の生存率に影響を与えるは、寒天のこのアプリケーションは表示されません、この幼虫の前方より多くの地域の研究に影響でした。我々 は 60 h までの幼虫をイメージすることができたがない行った撮像時間が長くなると生存率、影響されるかどうか。さらに、ここで示した特定の設計は、年齢 2 〜 4 日ポスト受精 (dpf) 幼虫尾離断と創傷治癒のイメージングの側面に横になっている最適化されました。発達段階、方向のための実験プロトコルは、デザインに変更を必要があります。デザインの意図的な機能モジュールを容易にこのような変化に従順になります。
さらに、このデバイスの作製には、3 D プリンターとマイクロ流体材料、PDMS、プラズマ クリーナー、潜在的には、デバイスをいくつかのユーザーのアクセシビリティを制限するなどの設備へのアクセスが必要です。ただし、この方法で金型製作はマイクロ加工と共に、3 D 印刷機能、学術のキャンパスでより普及しているなっているので選ばれました。また、3 D 技術が急速に発展するにつれ、印刷、プリンターの減少のコスト サービス プロバイダーがあります。
ZWEDGI、仕切られたデザインと機能を考えると、寒天を埋め込むを使用して時間経過イメージ コレクションの現在の手法に比べて強化されています。まず、アガロースは創傷治癒と奔放に再生可能に、zWEDGI の幼虫の生存期間が埋め込まれ、埋め込まれていないコントロール5に匹敵する、zWEDGI の尾地域を囲むしません。第二に、金型を作製する高解像度の 3 D プリンターの使用は、画像平面に対して 3 つの次元の幼虫の向きをユニークな傾斜したジオメトリを持っている zWEDGI をことができます。これは寒天が固まるように適切な向きに幼虫を操作するための時間依存性を削除します。尾と実験操作のためにアクセスできるようにする頭部領域を許可する第 3 重要な zWEDGI 設計の利点は開いた区域デザイン。これは創傷治癒の研究の特定の関心が、これはまた、他の操作のための潜在的に有用ツール、zWEDGI。デバイスのコンパートメントの設計はさらに、化合物の実験中の用途地域のための機会を提供します。デバイス半分離 (負傷商工会議所) でバッファーと (チャンバー) の agarose の5、創傷治癒や他の生物を勉強しながら化合物のアプリケーションを許可する拡散の微分のための尾から頭処理します。さらに、幼虫は別のチャネルでマウントされているため個々 幼虫は識別することができますおよび RNA やタンパク質の精製などの追加の処理や抗体の分類の後画像を取得します。そして最後に、ガラス底皿に結合されている PDMS のデバイスのため、デバイスは再利用可能な幼虫を取り外した後。
進んだら、モジュラー設計と、zWEDGI の製作が容易に向いている変更された機能のための変更。現在、コンパートメントのジオメトリは、創傷治癒のライブ イメージングのための広範なアプリケーションを与えること、負傷とイメージング実験のための具体的に構築されています。しかし、幼虫は、幼虫と撮像面の材料 (すなわちPDMS)、イメージングを妨げる可能性が存在しないように、ガラス上に直接あります。そのため、幼虫は、トランク、ウーなどの他の地域ld は、イメージングのためにアクセスできます。さらに、zWEDGI の 3 D 印刷金型の設計は、他の発達段階、幼虫と様々 な治療法のさまざまな方向に合わせて容易に変更できます。これらの属性は、したがってそれにさまざまな時間スケールでのイベントの時間経過観察をキャプチャするための貴重なツールをします。その他ガラス底皿形式の使用より大きい PDMS 装置とより多くのチャネルのためのスペースが許可されます。さまざまな実験的プロトコルの 3 D 印刷加工技術と変更その後やすさ増加アクセシビリティを考えると、zWEDGI は、高解像度のライブ イメージング顕微鏡の領域で強力なツールであること証明するかもしれない。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、プライマリ プロジェクトの光の計算の計測研究所の Morgridge 研究所から資金調達を認めたいと思います。我々 はまた、NIH # R01GM102924 から資金を認める (AH と近鉄)。KH、JMS、RS、AH、KWE 構想し、研究に設計されています。KH と JMS DL、KP、RS からのサポートとすべての実験を実行します。KH、JS、RS、AH、KWE は原稿の執筆に貢献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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