Summary
该协议描述了人类冠状动脉支架植入大鼠的腹部主动脉与apoE-/- 背景使用跨股骨访问。与其他动物模型相比，穆林模型具有吞吐量高、可重复性高、易处理性和外壳性好等优点，分子标记物广泛可用。
Abstract
皮下冠心病干预 （PCI） 结合冠状支架的部署，代表了冠状动脉疾病干预治疗的黄金标准。支架内恢复症 （ISR） 是由支架内新辛蒂莫组织过度增殖决定的，并限制支架的长期成功。各种动物模型被用来阐明支架内复发 （ISR） 背后的病理生理过程，其中猪冠状动脉和兔子胆道模型最常使用。Murine 模型具有吞吐量高、易于处理和外壳、可重复性和分子标记的广泛可用性等优点。非丙蛋白E缺乏（apoE-/-）小鼠模型已广泛用于研究心血管疾病。然而，支架必须小型化才能植入小鼠体内，这涉及到其机械和（潜在）生物特性的重大变化。使用猿类-/-大鼠可以克服这些缺点，因为apoE-/-大鼠允许评估人类大小的冠状动脉支架，同时提供一个异位表型。这使得它们成为在支架植入后研究 ISR 的极好可靠的模型。在这里，我们详细描述了将市售的人类冠状动脉支架植入具有apoE-/-背景的老鼠的腹部主动脉，使用跨股骨访问。
Introduction
皮下冠心病干预（PCI），结合冠状支架的部署，代表了冠状动脉疾病干预治疗的黄金标准1。然而，支架的长期成功可以限制在支架内复发（ISR）的发生，这是由支架2，3内新意组织过度增殖决定的。ISR 可能需要用冠状动脉旁路或重新 PCI 进行重新干预。为研究ISR提出了各种动物模型的建议，每个模型都有优点和缺点。最常用的猪冠状动脉和兔肠动脉模型的主要缺点，虽然在支架植入4、5后出现与人类明显相似的病变，但动物和住房成本高，这带来了后勤困难，特别是在长期研究中，以及处理和设备的限制。此外，猪和兔子细胞蛋白抗体的可用性有限。另一方面，Murine 模型具有吞吐量高、可重复性高、易于操作、外壳等主要优点，因此具有成本效益。此外，有较多的抗体可用。然而，虽然非丙蛋白电子缺乏症（apoE-/-）小鼠已被广泛用于动脉粥样硬化6，7，8的研究，他们不适合研究ISR，因为支架必须小型化植入小鼠，有可能改变支架的机械特性。此外，小鼠主动脉壁测量在幼鼠50μm和老老鼠9中85μm之间，支架必须使用低至2 atm的压力水平进行部署，这可能导致支架10的不良位。然而，大鼠允许植入市售的人类冠状动脉支架，并表现出类似于主动脉支架植入后较大的动物的血管愈合过程，首先由Langeveld等人11日报道。这项技术最初需要跨腹部通道，这就需要对主动脉进行物理收缩，以实现血液流动的暂时中断。为了避免潜在的相关船只伤害和炎症反应，该技术后来通过引入一个跨组织访问，这进一步导致动物12的存活率更高。
由于野生类型大鼠不发展动脉粥样硬化病变13，apoE-/-大鼠已产生使用核酶技术，如转录激活器一样的影响器核糖核酸（TALEN）14，聚类定期间歇短巴林德罗米重复（CRISPR/Cas9）15，和锌手指（ZF）16。自 2011 年以来，ApoE-/-大鼠已上市。提供外来背景，apoE-/-大鼠允许更现实地评估人类大小的冠状动脉支架，特别是关于ISR。
在此，我们通过跨性别访问路线描述该方法，并使用市售的薄支柱钴-铬药物脱脂支架 （DES），但是，它也可用于研究其他支架类型，如裸金属支架 （BMS） 或可生物降解支架。
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Protocol
这些实验是根据德国动物福利法（TSchG）和2010/63/欧盟关于保护用于科学目的的动物的指令进行的。政府动物护理和使用委员会批准了这项研究的正式批准（第87-51.04.A065号议定书：兰德萨姆特·法尔·纳图尔，乌姆韦尔特·德·弗布劳彻舒茨·诺德海因-韦斯特法伦，德国雷克林豪森）。研究协议符合《实验室动物护理和使用指南》。术后疼痛治疗基于德国实验室动物科学协会 （GV-SOLAS） 的建议以及主动兽医疼痛治疗。
1. 基本技术和常见程序
- 使用同源猿-/- 斯普拉格-道利大鼠。使用标准方法17识别每种动物的基因型。
- 将动物保持在相同的条件下（21 °C ± 2 °C，60%± 5% 的湿度，以及 12 小时的光/暗循环），并确保免费获得水和食物。
- 在清洁但非星号条件下执行所有程序。
- 一旦大鼠麻醉，在手术显微镜下执行所有手术，倍数为16倍。
- 使用棉签进行压缩溶血。用乳化铃声溶液浸泡的纱布（5 厘米 x 5 厘米）有助于保持腹股沟湿润。
- 遵守废物处理条例，处理废旧材料。
2. 手术前的准备
- 在开始操作之前准备兽药。除非另有说明，否则请在室温下保留所有解决方案。
- 手术前30分钟，皮下施用 0.03-0.05毫克/千克丁丙诺啡。
- 麻醉大鼠，注射100毫克/千克体重（BW）和8毫克/千克BW西拉辛。
- 使用称重秤评估大鼠的体重。
- 将鼠放在加热垫上，用医用胶带固定上下肢。将大鼠的左后肢完全伸展，并尽可能与脊椎保持一致，从而在股动脉和主动脉之间形成一条直线。这将促进气球安装支架通过主动脉分叉前进。
- 保持麻醉，吸入1.5伏的异氟烷在97.5%的氧气中，流量为2L/min。
注意：允许大鼠自发呼吸，无需管网。 - 应用眼药膏，防止无意识时眼睛损伤。
- 从大鼠腹股沟和下腹部区域剃毛，用波维酮碘溶液对相应的皮肤进行消毒。
- 在开始手术之前，通过捏紧尾尖和分形组织来验证麻醉的深度。
3. 手术
- 在左腹股沟中切开约 0.5+u20121 厘米，以打开皮肤和底层筋膜。
- 在深部进行模糊解剖和探查，直到可以识别脉动的左股动脉。
- 使用非常精细的钳子，通过轻轻取出周围的结缔组织来准备股骨动脉。小心伤害股骨神经和股骨静脉，这是动脉中间。
- 准备大约1厘米的股骨动脉。小心地将钳尖放在容器下，轻轻抬起。
- 线条4-0丝缝合线下动脉的解剖和接近部分，并形成吊索。夹住手术夹的分支之间的两根螺纹吊索的末端。使用手术夹控制动脉。轻轻伸展和抬起吊索，以暂时中断血液流动。
注意：快速工作，以避免可能导致组织损伤的长时间旅游。 - 使用锋利的微剪刀，在股动脉中间进行动脉切除术。
- 通过动脉切除术引入导线。当到达近线吊索时，通过移动手术夹释放螺纹的张力，并将导线进一步向腹部主动脉推进。
注意：使用切割机切割导线以便于操作。 - 将导线的近端放置在隔膜和肾动脉之间。
注意：将导线推进太远会承受主动脉或心脏损伤的风险。我们建议打开腹部，以确保引导线和支架的充分定位，至少对于前几只动物。 - 在导引线上引入一个压接式和气球式冠状动脉支架，尺寸为 2.25 mm x 8 mm（最大 2.5 mm x 8 mm），并将其推进到腹动脉。
- 将支架放在主动脉分叉上方，但放在肾动脉下方。使用充气注射器系统将气球导管充气至 12 atm 15s，从而部署支架。
- 根据制造商对使用支架的建议，放气气球导管并保持负压。
- 在将支架留在原位时，慢慢取出放气导管。
- 在取出导管之前，用手术夹在切口上方的螺纹环上制造张力，再次中断血液流动。然后取出气球导管，直接将容器靠近。
- 将近部和解剖线环系成石灰，以盖住股动脉，并确认动脉切除术的充分血吸虫。辅助动脉将确保进一步灌注到肢体。
- 使用 10-0 非可恢复缝合，关闭动脉的肌肉以及皮肤切口。
4. 支架植入后的动物护理
- 手术后，让老鼠在特殊的重症监护室笼子里恢复60分钟，笼子里有温暖的空气（30\u201235°C）和氧气供应。
- 仔细观察动物，直到完全康复。之后，将老鼠移入普通笼子。提供获得水和食物的辅助通道。
- 根据临床评估，每6-12小时服用一次术后镇痛，服用0.03-0.05毫克/千克丁丙诺啡（s.c.，500μl NaCl），共72小时。
- 将食物与氯皮多格雷（15毫克/千克）混合，以避免植入支架的血栓形成。
- 为了改善高血糖条件和斑块形成，在出生后6\u20128周开始西方饮食喂养，一直持续到安乐死。如果需要，一群喂养正常老鼠的动物可以作为控制。
5. 组织收集和处理
- 在指定时间点开始组织去除之前，根据 IACUC 指南对动物实施安乐死。在观察期结束时收获被强化的主动脉进行病理分析。
- 通过中线切口打开腹部，取出主动脉的固定部分以及主动脉的相邻非固定部分，每个部分尺寸为 0.5 厘米。
- 将组织放入 4% 缓冲形式素的溶液中，以进行 24 小时的固定。
- 将被强化的动脉组织嵌入塑料中，并按照标准协议18、19进行组织学和免疫化学染色。
6. 组织学分析
- 通过与计算机相连的显微镜，使用适当的图像分析软件，对紧固主动脉的近、中、离部分的顺序部分进行成形分析。
- 使用图形绘图板跟踪外部弹性拉米纳（EEL，在冒险和介质之间）、内部弹性拉米纳（IEL、介质和新因蒂玛之间）和流明的轮廓。从这些值中，使用软件计算 EEL 区域、IEL 区域和流明区域。
- 计算支架内复发 （ISR） 的横截面面积百分比：
- 计算新近面积（Ai）：
- 测量每个支架支柱上的新意厚度 （NIT），作为支柱和流明之间的距离。测量支架支柱之间的NIT，作为 IEL 和流明之间的距离。
注：或者，将NIT计算为
其中PL和PIEL是流明和内部弹性拉米纳周长，分别为20。 - 根据研究的要求进行额外的分析。
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Representative Results
该协议描述了使用跨股骨通道（图1）植入大鼠腹部主动脉的支架。这种动物模型的第一个中心点是，它允许部署人类大小的冠状动脉支架。一个市售的压接和气球安装冠状动脉支架可以放置到大鼠的腹部主动脉。因此，还可以应用与人类相同的支架部署原则。使用大鼠的另一个优点是提供转基因菌株，如apoE-/- 大鼠，这些菌株在商业上是可用的。
我们最近采用这种方法来评估与野生型大鼠21相比，非丙蛋白电子缺乏型大鼠是否更容易发展ISR。在总共42只接受支架植入的雄性大鼠中，有36只大鼠在28天后完成了研究方案（存活率=85.71%）。两只老鼠分别死于血管关闭故障、内出血和支架血栓。由于加工失败，组织受到严重损坏或中断，无法分析来自三种动物的支架。最有可能的是，这发生在锯锯过程中。我们建议在研究开始前进行几次培训，以执行此技术。
在其余33只大鼠中，成功部署了人大小的冠状动脉支架，没有出现不良或血管损伤的迹象（表1）。体重在野生类型猿+/+和 apoE-/-大鼠（530.1 ± 15.94 g 与 513.6 ± 16.45 g）相似。与野生类型猿类+/+大鼠（图2）相比，同源性猿类-/-大鼠发展出明显升高的新近视增生和ISR。虽然apoE-/-背景使动物更容易出现动脉粥样硬化，尤其是在喂养西方饮食时，我们没有观察到大鼠中任何前体动脉粥样硬化斑块，很可能是因为西方饮食直到手术才开始，随后的四周观察期太短，无法进行动脉粥样硬化病变的发展。
图1：使用跨股骨通道将支架植入大鼠腹部主动脉的图景。
（a） 血液流动中断后，通过中间动脉切除术引入导线。（b） 将压接和气球安装的冠状动脉支架引入导线进入股动脉。（c） 气球安装支架被推进到腹部主动脉，在那里它被气球膨胀部署。支架应放置在分叉上方和肾动脉下方。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在西餐喂养的支架植入28天后，Giemsa染色的腹部主动脉的代表光显微图。
（a） 野生类型猿+/+大鼠和 （b） 同源性猿类 - /-大鼠。高功率图像：NI=纽因蒂玛，圣=支架支柱，M=图尼卡介质，L=流明。图已复制与修改从科内利森，A等人21。请单击此处查看此图的较大版本。
| 老鼠的数量 | |
| 船舶关闭失败 | 2 |
| 内出血 | 2 |
| 支架血栓 | 2 |
| 组织处理失败 | 3 |
| 圆满完成协议 | 33 |
表1：使用跨股骨通道在大鼠腹部主动脉中植入支架的结果。
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Discussion
本协议描述了将人类大小的冠状动脉支架植入大鼠腹 主动脉。几个技术点值得强调。首先，应避免支架大小和主动脉大小之间的不匹配。放置过小的支架会导致支架失调，而植入对主动脉来说太大的支架则会导致血管过度拉伸、撕裂和损伤。因此，我们建议使用直径在 2.0 到 2.5 毫米之间的支架，并将植入压力保持在建议范围内，而不要过度拉伸支架。最合适的植入压力通常由支架制造商给出。股骨静脉和随后的静脉卡瓦的过度损伤应避免，因为血管壁非常薄，很容易受伤，导致出血，这是很难停止。股动脉通过脉动可与股骨静脉区分，应仔细观察。另一个陷阱是引入导管和/或气球导管时动脉损伤和解剖的可能性。在引入气球导管时，使用丝带用吊索控制和伸展股动脉，可以最大限度地减少动脉解剖。遇到阻力时，必须立即停止推进设备。在这种情况下，拇指和食指之间的小动作将有助于改变设备的方向。根据我们的经验，这是最常见的情况，就在内韧带以下，并进一步上升，当常见的腹腔动脉接近分叉，因为它下降到更深的后腹腔空间在这里。在存活率稳定且有一定经验之前，操作员肯定会有一个学习曲线，平均手术时间约为 20 分钟。
在人类中，支架通常被植入严重狭窄的动脉粥样硬化动脉。虽然一般来说，apoE缺乏使动物更容易患上动脉粥样硬化病变，但我们没有观察到大鼠的任何斑块形成，很可能是因为西方饮食喂养直到支架植入才开始。如果需要将支架植入动脉粥样硬化病变中，西方饮食应在出生后 6+u20128 周开始，一直持续到牺牲。易感菌株中的动脉粥样硬化病变将在高脂肪饮食22的7\u201214周后发展。到目前为止，只公布了有限的关于apoE-/-大鼠的数据。然而，没有研究报告自发病变发展之前，20周23岁。赵等人观察到典型的动脉粥样硬化后，至少24周，斑块负担和病变严重程度持续增加，直到牺牲在72周15。因此，根据文献，大鼠不可能在14-16周大时出现自发性动脉粥样硬化。因此，我们建议使用老老鼠，并尽早开始西方饮食，如果支架植入预先形成的动脉粥样硬化病变是需要的研究。
六只动物在手术中幸存下来。尽管有氯皮多格雷的管理，两只动物死于支架血栓。为了减少支架血栓形成，动物可以用阿司匹林预处理48小时，或术后接受静脉注射阿诺沙帕林。手术前一天引入氯皮多格雷也可以降低血栓形成的风险，但同时加强抗血栓治疗会增加出血的风险。支架血栓是PCI24、25、26的常见并发症，可能有多种原因。在我们的研究中，支架血栓死亡可能是由于气球充气不足和同时支架不适造成的。与植入人体的支架相比，大鼠腹部主动脉的支架部署不由血管造影控制。因此，在手术过程中无法检测和纠正无效的气球膨胀。同样，支架部署可能导致分支容器无意间被遮挡。考虑到在荧光镜控制下使用手术显微镜是不可行的，我们建议打开腹部，以确认支架的精确部署，至少在前几个程序中是这样。支架血栓形成的其他潜在原因可能是炎症反应、严重损伤或血管壁解剖。外科医生必须知道任何临床迹象，表明这些并发症，动物必须检查每一天在整个观察期。
大鼠腹部主动脉直径在1.8毫米至3.0毫米之间，视动物的体重27，28而定。通过更小的股骨和腹腔动脉推进笨重的支架可能会导致刺激性撕裂和血管壁损坏。因此，此技术仅限于植入较小的支架（直径在 2.0 至 2.5 毫米之间），以避免主动脉血管壁过度拉伸或损伤。
另一个限制是必须把股骨动脉结为连结，以便在手术后实现血栓转移，从而可能带来下肢缺血的风险。然而，先前的研究表明，在29号大鼠的股动脉结缘后，辅助动脉以及微血管解剖的适应能力能够维持下肢灌注，在观察期间，我们的大鼠均未表现出下肢缺血的临床症状。尽管如此，调查人员还是应该意识到这种潜在的风险，因为肢体缺血不仅代表术后死亡的潜在原因，而且还可能诱发全身炎症反应，从而可能偏向结果。
虽然大鼠一般是一种具有成本效益的动物模型，但使用转基因动物会 增加成本。另一个限制是，在大鼠中形成动脉粥样硬化斑块需要相当长的时间。此外，主动脉和冠状动脉之间还有一些重要的血动力学差异值得密切关注。与冠状动脉相比，主动脉的切变应力更高，并且不存在导致血流湍流的分叉。这减少了肌发育增生和恢复的程度。
恢复是限制冠状动脉支架长期成功的主要因素之一。各种动物模型被用来研究恢复性病理生理学，每个模型都有各自的优点和缺点。与其他动物模型相比，大鼠具有吞吐量高、处理方便、外壳方便、可重复性和成本效益好等优点，同时允许植入人大小的冠状动脉支架。兰格维尔德等人11日报告了第一个关于大鼠腹部主动脉紧咬的方案。然而，这种模型需要跨腹部通道来引入支架，支架与主动脉的物理收缩相关，以实现血流的暂时中断。由此产生的操纵和船舶伤害可能会引起炎症反应，这不仅可能导致并发症，而且还会发音ISR12。后来，小山田等人修改了协议，通过普通的伊利亚克动脉12引入支架。他们比较了两种不同方法（横动脉和跨腹动脉）之间的存活率，发现跨腹部部署支架的动物的死亡率显著提高（57%对11%，p<0.05）。老鼠最常见的死于血栓在切口/缝合点，这是灾难性的，当发生在腹部主动脉12。进一步减少创伤和模仿植入技术在人类更密切，我们使用跨女性访问引入支架，并报告死亡率为14%。两只老鼠分别死于血管关闭故障、内出血和支架血栓。然而，最近的研究表明，即使有30、31的跨主动脉，在植入大鼠腹主动脉后，死亡率也低至6%。尽管如此，在Nevzati等人将镁支架植入大鼠主动脉30后进行的一项研究中，综合发病率和死亡率仍为13.4%。虽然没有船舶关闭故障或内部出血的报告在他们的系列，支架血栓在10.5%的老鼠30明显。另一方面，水瓶座等人在用流转器治疗侧壁动脉瘤后，没有报告任何支架血栓形成，然而，这项研究使用了更薄的支架支柱装置，并给31只大鼠进行了双抗板治疗。我们试图在支架血栓形成和出血风险之间取得平衡，并在研究中施用了氯皮多格雷和肝素。虽然这可能降低了支架血栓形成的风险，这在4.76%的老鼠中发生，但它也可能是出血风险相对较高的原因（9.52%的老鼠），无论是由于内出血或血管关闭失败。
在这里，我们演示了将药物脱毛支架植入大鼠腹部主动脉，但同样，这种方法可用于评估其他类似大小的支架设备，例如裸金属支架或生物可吸收血管支架。
总之，腹主动脉支架植入后研究ISR的一个可靠和可重复的模型。该模型可以扩展到使用老老鼠，它们更有可能自发地产生动脉粥样硬化病变，并通过测试用于人类冠状动脉干预的其他设备。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢安吉拉·弗伦德夫人在嵌入和幻灯片生产方面提供的宝贵技术援助。我们还要感谢实验室动物科学和实验外科研究所的塔杜斯·斯托平斯基先生在兽医工作中的有见地的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
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