Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Implantation menschlicher koronarer Stents in die Bauchaorta von Ratten mit einemApoE-/- Hintergrund unter Verwendung eines transfemoralen Zugangs. Im Vergleich zu anderen Tiermodellen bieten murine Modelle die Vorteile eines hohen Durchsatzes, der Reproduzierbarkeit, der einfachen Handhabung und des Gehäuses sowie einer breiten Verfügbarkeit molekularer Marker.
Abstract
Perkutane koronare Intervention (PCI), kombiniert mit dem Einsatz eines koronaren Stents, stellt den Goldstandard in der interventionellen Behandlung von koronaren Herzerkrankungen dar. In-stent Restenose (ISR) wird durch eine übermäßige Proliferation von Neointimgewebe innerhalb des Stents bestimmt und begrenzt den langfristigen Erfolg von Stents. Eine Vielzahl von Tiermodellen wurden verwendet, um pathophysiologische Prozesse zu klären, die der In-Stent-Restenose (ISR) zugrunde liegen, wobei die Schweinekoronare und die Kaninchen-Iliasarterienmodelle am häufigsten verwendet werden. Murine-Modelle bieten die Vorteile eines hohen Durchsatzes, einfacher Handhabung und Gehäuse, Reproduzierbarkeit und einer breiten Verfügbarkeit molekularer Marker. Das Apolipoprotein E-Mangel (ApoE-/- ) Mausmodell wurde häufig verwendet, um Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu studieren. Stents müssen jedoch miniaturisiert werden, um mäusen implantiert zu werden, was wichtige Veränderungen ihrer mechanischen und (potenziell) biologischen Eigenschaften mit sich bringen muss. Die Verwendung von ApoE-/- Ratten können diese Unzulänglichkeiten als ApoE überwinden-/- Ratten ermöglichen die Bewertung von koronaren Stents in menschlicher Größe und liefern gleichzeitig einen atherogen Phänotyp. Dies macht sie zu einem ausgezeichneten und zuverlässigen Modell, um ISR nach der Stent-Implantation zu untersuchen. Hier beschreiben wir detailliert die Implantation kommerziell erhältlicher menschlicher Koronarstents in die Bauchaorta von Ratten mit einemapoE-/- Hintergrund unter Verwendung eines transfemoralen Zugangs.
Introduction
Perkutane koronare Intervention (PCI), kombiniert mit dem Einsatz eines koronaren Stents, stellt den Goldstandard in der interventionellen Behandlung der koronaren Herzkrankheit1dar. Der langfristige Erfolg von Stents kann jedoch durch das Auftreten von In-Stent-Restenose (ISR) begrenzt werden, die durch eine übermäßige Proliferation von Neointimgewebe im Stent bestimmt wird2,3. ISR kann eine erneute Intervention entweder mit koronaren Arterienbypass oder re-PCI erfordern. Für die Untersuchung von ISR wurden verschiedene Tiermodelle vorgeschlagen, von denen jedes Vorteile und Mängel aufweist. Die Hauptnachteile der am häufigsten verwendeten Schweinekoronar- und Kaninchen-Iliac-Arterienmodelle, obwohl sie lästig sind, sind nach der Stent-Implantation4,5, große Tier- und Wohnkosten, die vor allem in Langzeitstudien logistische Schwierigkeiten mit sich bringen, sowie Einschränkungen bei der Handhabung und Ausrüstung. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen zelluläre Proteine von Schweinen und Kaninchen begrenzt. Auf der anderen Seite bieten murine Modelle die großen Vorteile eines hohen Durchsatzes und der Reproduzierbarkeit sowie der einfachen Handhabung, des Gehäuses und damit der Wirtschaftlichkeit. Darüber hinaus ist eine höhere Anzahl von Antikörpern verfügbar. Obwohl Apolipoprotein E-deficient (apoE-/-) Mäuse weit verbreitet für die Untersuchung von Arteriosklerose6,7,8verwendet wurden, sind sie für die Untersuchung von ISR ungeeignet, da Stents miniaturisiert werden müssen, um in Mäuse implantiert zu werden, was die mechanischen Eigenschaften der Stents verändern könnte. Darüber hinaus misst die Aortenwand von Mäusen bei jungen Mäusen zwischen 50 und bei alten Mäusen9, und Stents müssen mit Druckpegeln von bis zu 2 atm eingesetzt werden, was zu einer Fehlstellung des Stents10führen kann. Ratten erlauben jedoch die Implantation kommerziell erhältlicher menschlicher koronare Stents und zeigen einen vaskulären Heilungsverlauf ähnlich wie größere Tiere nach aortenstents Implantation, zuerst berichtet von Langeveld et al.11. Diese Technik erforderte ursprünglich einen transabdominalen Zugang, der eine physische Verengung der Aorta erforderte, um eine vorübergehende Unterbrechung des Blutflusses zu erreichen. Um die potenziell damit verbundenen Gefäßverletzungen und Entzündungsreaktionen zu vermeiden, wurde die Technik später durch die Einführung eines transiliac Zugangs verfeinert, was zusätzlich zu einer höheren Überlebensrate der Tiereführte 12.
Da Wildtypratten keine atherosklerotischen Läsionen entwickeln13, wurden ApoE-/- Ratten mit Nuklease-Techniken wie Transkription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15und Zinkfinger (ZF)16erzeugt. ApoE-/- Ratten sind seit 2011 im Handel erhältlich. ApoE-/- Ratten mit einem atherogen Hintergrund ermöglichen eine realistischere Bewertung von koronaren Stents in menschlicher Größe, insbesondere in Bezug auf ISR.
Dabei beschreiben wir die Methode über den transfemoralen Zugangsweg und unter Verwendung eines handelsüblichen Dünnstrut-Kobalt-Chrom-Eluing-Stents (DES), kann aber auch für die Untersuchung anderer Stenttypen wie Bare Metal Stents (BMS) oder biologisch abbaubarer Stents eingesetzt werden.
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Protocol
Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz (TSchG) und der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz von Tieren durchgeführt, die zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet werden. Die offizielle Genehmigung für diese Studie wurde vom Staatlichen Ausschuss für Tierpflege und Nutzung erteilt (Protokoll-Nr.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen). Das Studienprotokoll entsprach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die postoperative Schmerzbehandlung basiert auf den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Labortierkunde (GV-SOLAS) sowie der Initiative Tierärztliche Schmerztherapie.
1. Grundtechniken und gemeinsame Verfahren
- Verwenden Sie homozygote ApoE-/- Sprague-Dawley Ratten. Identifizieren Sie den Genotyp jedes Tieres mit Standardmethoden17.
- Halten Sie die Tiere unter identischen Bedingungen (21 °C ± 2 °C, 60% ± 5% Luftfeuchtigkeit und einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus) und sorgen Sie für freien Zugang zu Wasser und Nahrung.
- Führen Sie alle Verfahren unter sauberen, aber nicht sterilen Bedingungen durch.
- Sobald die Ratte anästhesiert ist, führen Sie alle Eingriffe unter einem chirurgischen Mikroskop bei einer Vergrößerung von 16x durch.
- Verwenden Sie Wattestäbchen für Kompressionshämostase. Gaze Tupfer (5 cm x 5 cm) mit laktierter Ringer-Lösung getränkt sind hilfreich, um die Leistenfeuchte zu halten.
- Befolgen Sie die Abfallentsorgungsvorschriften, um gebrauchte Materialien zu entsorgen.
2. Präparate vor der Operation
- Bereiten Sie die Tierarzneimittel vor Beginn der Operation vor. Halten Sie alle Lösungen bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben.
- Dreißig Minuten vor dem Eingriff 0,03-0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan verabreichen.
- Anästhesisieren Sie die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg/kg Körpergewicht (BW) (S)-Ketamin und 8 mg/kg BW Xylazin.
- Bewerten Sie das Gewicht der Ratte anhand einer Waage.
- Legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen und fixieren Sie die oberen und unteren Gliedmaßen mit medizinischem Klebeband. Positionieren Sie die Ratte mit ihrer linken Hintergliedmaße vollständig ausgestreckt und so viel wie möglich im Einklang mit ihrer Wirbelsäule, um eine gerade Linie zwischen Femoralarterie und Aorta zu schaffen. Dies erleichtert das Vorrücken des Ballon-Stents durch die Aortenbifurkation.
- Halten Sie die Anästhesie mit der Inhalation von 1,5 Vol% Isofluran in 97,5% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 2 L/min aufrecht.
HINWEIS: Lassen Sie die Ratte spontan atmen, ohne Intubation. - Tragen Sie Augensalbe auf, um Augenschäden während der Bewusstlosigkeit zu verhindern.
- Rasieren Sie das Fell aus der Leisten- und Unterbauchbereich der Ratte und sterilisieren Sie die entsprechende Haut mit einer Povidon-Jod-Lösung.
- Vor Beginn der Operation eine ausreichende Tiefe der Anästhesie überprüfen, indem Sie die Schwanzspitze und das interdigitale Gewebe kneifen.
3. Chirurgie
- Machen Sie einen medialen Schnitt von 0,5,21 cm in der linken Leiste, um die Haut und die darunter liegende Faszie zu öffnen.
- Bluntly sect und sonde in den Tiefen, bis die pulsierende linke Oberschenkelarterie identifiziert werden kann.
- Mit sehr feinen Zangen bereiten Sie die Femoralarterie vor, indem Sie das umgebende Bindegewebe vorsichtig entfernen. Achten Sie darauf, weder den Oberschenkelnerv noch die Femoralvene zu schädigen, die der Arterie medial ist.
- Bereiten Sie etwa 1 cm der Oberschenkelarterie vor. Legen Sie vorsichtig die Spitze der Zange unter das Gefäß, um es sanft zu heben.
- Fadenstücke von 4-0 Seidennaht unter den distalen und proximalen Teilen der Arterie und bilden Schlingen. Klemmen Sie die Enden jeder der beiden Gewindeschlingen zwischen den Zweigen einer chirurgischen Klemme. Verwenden Sie die chirurgischen Klemmen, um die Arterie zu steuern. Dehnen und heben Sie die Hebegurte sanft an, um den Blutfluss vorübergehend zu unterbrechen.
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, um ein längeres Tourniquet zu vermeiden, das zu Gewebeschäden führen kann. - Führen Sie mit scharfen Mikroscheren eine Arteriotomie in der Mitte der Oberschenkelarterie durch.
- Führen Sie einen Führungsdraht durch die Arteriotomie ein. Wenn Sie den proximalen Fadenschlingen erreichen, lösen Sie die Spannung des Gewindes, indem Sie die chirurgische Klemme bewegen und den Führungsdraht weiter in Richtung der Bauchaorta voranbringen.
HINWEIS: Schneiden Sie den Führungsdraht mit einem Drahtschneider, um die Handhabung zu erleichtern. - Legen Sie das proximale Ende des Führungsdrahtes zwischen dem Zwerchfell und den Nierenarterien.
HINWEIS: Das Vorrücken des Führungsdrahtes zu weit trägt das Risiko von Aorten- oder Herzverletzungen. Wir empfehlen, den Bauch zu öffnen, um eine angemessene Positionierung des Führungsdrahtes und des Stents zumindest für die ersten tiere zu gewährleisten. - Führen Sie einen gekräusten und ballonmontierten koronaren Stent von 2,25 mm x 8 mm (max. 2,5 mm x 8 mm) über den Führungsdraht in die Oberschenkelarterie ein und bringen Sie ihn zur Bauchaorta vor.
- Platzieren Sie den Stent knapp über der Aortenverzweigung, aber unter den Nierenarterien. Stellen Sie den Stent ein, indem Sie den Ballonkatheter mit einem Inflationsspritzensystem auf 12 atm für 15 s aufblasen.
- Entleeren Sie den Ballonkatheter und halten Sie den Unterdruck gemäß den Empfehlungen des Herstellers für den stent im Einsatz.
- Ziehen Sie den deflationierten Katheter langsam ab, während Sie den Stent an Ort und Stelle lassen.
- Kurz vor dem Herausnehmen des Katheters, erzeugen Spannung auf der Fadenschleife über dem Schnitt mit der chirurgischen Klemme, um den Blutfluss wieder zu unterbrechen. Dann den Ballonkatheter entfernen und das Gefäß direkt proximal aufstellen.
- Binden Sie die proximalen und die distalen Fadenschleifen, um die Oberschenkelarterie zu ligan und eine angemessene Hämostase der Arteriotomie zu bestätigen. Kollateralarterien sorgen für eine weitere Durchblutung der Gliedmaße.
- Schließen Sie den Muskel über der Arterie, sowie den Hautschnitt mit 10-0 nicht resorbierbaren Nähten.
4. Tierpflege nach Stent-Implantation
- Unmittelbar nach der Operation die Ratte 60 min in einem speziellen Intensivstation-Käfig mit erwärmter Luft (30-u201235 °C) und sauerstoffhaltiger Versorgung erholen.
- Beobachten Sie die Tiere sorgfältig, bis sie vollständig geborgen sind. Danach bewegen Sie die Ratten in einen normalen Käfig. Bieten Sie ad libitum Zugang zu Wasser und Lebensmitteln.
- Verabreichen Sie postoperative Analgesie alle 6-12 Stunden mit 0,03-0,05 mg/kg Buprenorphin (s.c., in 500 l NaCl) für insgesamt 72 Stunden unter klinischer Bewertung.
- Lassen Sie das Futter mit Clopidogrel (15 mg/kg) gemischt, um eine Thrombose des implantierten Stents zu vermeiden.
- Um hypercholesterolemische Bedingungen und Plaquebildung zu verbessern, beginnen Sie die westliche Diätfütterung bei 6-u20128 Wochen nach der Geburt und setzen Sie bis zur Euthanasie fort. Auf Wunsch kann eine Kohorte von Tieren, die mit normalem Ratten-Chow gefüttert werden, als Kontrolle dienen.
5. Gewebesammlung und -verarbeitung
- Bevor Sie mit der Gewebeexplantation zum angegebenen Zeitpunkt beginnen, müssen Sie das Tier gemäß den IACUC-Richtlinien einschläfern. Ernte die gestete Aorta für histologische Analyse am Ende des Beobachtungszeitraums.
- Öffnen Sie den Bauch durch einen Mittellinienschnitt und entfernen Sie das gestäten Segment der Aorta sowie die angrenzenden nicht-stented Teile der Aorta, die jeweils 0,5 cm messen.
- Legen Sie das Gewebe in eine Lösung von 4% gepuffertem Formalin für 24 h zur Fixierung.
- Einbetten des gestents arteriellen Gewebes in Kunststoff und führen Histologische und immunhistochemische Färbung nach Standardprotokollen18,19durch.
6. Histomorphometrische Analyse
- Führen Sie die histomorphometrische Analyse sequenzieller Abschnitte des proximalen, mittleren und distalen Teils der stented aorta mittels eines Mikroskops durch, das mit einer geeigneten Bildanalysesoftware mit einem Computer verbunden ist.
- Verfolgen Sie die Konturen der äußeren elastischen Lamina (EEL, zwischen Adventitie und Medien), der inneren elastischen Lamina (IEL, zwischen Medien und Neointima) und lumen mit einer grafischen Zeichentablette. Berechnen Sie aus diesen Werten Die EEL-Fläche, die IEL-Fläche und die Lumenfläche mit der Software.
- Berechnen Sie die prozentuale Querschnittsfläche in-stent restenosis (ISR):
- Berechnen Sie die gesamte Neotimtonfläche (Ai):
- Messen Sie die Neotimindicke (NIT) über jeder Stentstrebe als Abstand zwischen Federbeine und Lumen. Messen Sie das NIT zwischen den Stentstreben als Abstand zwischen IEL und Lumen.
ANMERKUNG: Alternativ können Sie NIT als
wobei PL und PIEL das Lumen und der interne elastische Laminaumfang sind, bzw.20. - Führen Sie zusätzliche Analysen entsprechend den Anforderungen der Studie durch.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt die Stentimplantation in der Bauchaorta von Ratten mit einem transfemoralen Zugangsweg (Abbildung 1). Der erste zentrale Punkt dieses Tiermodells ist, dass es den Einsatz von koronaren Stents in menschlicher Größe ermöglicht. Ein kommerziell erhältlicher crimpter und ballonmontierter koronaren Stent kann in die Bauchaorta von Ratten gelegt werden. So kann darüber hinaus das gleiche Prinzip der Stent-Einsatz wie beim Menschen angewendet werden. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Ratten ist die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen, wie apoE-/- Ratten, die kommerziell erhältlich sind.
Wir haben vor kurzem diese Methode verwendet, um zu bewerten, ob Apolipoprotein E-defizienten Ratten anfälliger für die Entwicklung von ISR im Vergleich zu Wildtypratten21sind. Von insgesamt 42 männlichen Ratten, die sich einer Stentimplantation unterziehen, schlossen 36 Ratten das Studienprotokoll nach 28 Tagen ab (Überlebensrate = 85,71 %). Jeweils zwei Ratten starben an Gefäßverschlussversagen, inneren Blutungen und Stentthrombose. Stents von drei Tieren konnten nicht analysiert werden, da das Gewebe durch Verarbeitungsfehler stark beschädigt oder gestört wurde. Höchstwahrscheinlich geschah dies während des Sägevorgangs. Wir empfehlen eine Schulung, um diese Technik mehrmals vor Studienbeginn durchzuführen.
Bei den übrigen 33 Ratten wurden menschengroße koronare Stents erfolgreich eingesetzt, ohne Anzeichen von Fehlstellung oder Gefäßverletzung(Tabelle 1). Das Körpergewicht war bei Wildtyp-ApoE+/+ und ApoE-/- Ratten ähnlich (530,1 ± 15,94 g gegenüber 513,6 ± 16,45 g). Homozygote ApoE-/- Ratten entwickelten eine deutlich erhöhte neointimale Hyperplasie und ISR im Vergleich zu Wildtyp-ApoE+/+ Ratten (Abbildung 2). Obwohl ein apoE-/- Hintergrund Tiere anfälliger für Arteriosklerose macht, besonders wenn wir westliche Ernährung gefüttert haben, haben wir keine vorhergetretenen atherosklerotischen Plaques bei unseren Ratten beobachtet, wahrscheinlich weil eine westliche Diät erst nach der Operation begonnen wurde und die anschließende Beobachtungszeit von vier Wochen zu kurz für die entwicklung der atherosklerotischen Läsion war.
Abbildung 1: Schema der Stentimplantation in die Bauchaorta von Ratten mit einem transfemoralen Zugang.
(a) Nach Unterbrechung des Blutflusses wird ein Führungsdraht durch eine mediale Arteriotomie eingeführt. (b) Ein gekrächzter und ballonmontierter koronaren Stent wird über den Führungsdraht in die Oberschenkelarterie eingeführt. (c) Der Ballon-Stent wird zur Bauchaorta vorgeschoben, wo er durch Balloninflation eingesetzt wird. Der Stent sollte über der Bifurkation und unterhalb der Nierenarterien platziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Photomikroskope der Giemsa-gefärbten Bauchaorta nach 28 Tagen nach der Stent-Implantation in der westlichen Ernährung.
(a) Wildtype apoE+/+ Ratten und (b) Homozygot apoE-/- Ratten. Hochleistungsbilder: NI = Neointima, St = Stent strut, M = Tunika-Medien, L = Lumen. Die Figur wurde mit Modifikationen von Cornelissen, A. et al.21reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Anzahl der Ratten | |
| Ausfall der Schiffsschließung | 2 |
| innere Blutung | 2 |
| Stentthrombose | 2 |
| Versagen der Gewebeverarbeitung | 3 |
| Erfolgreicher Abschluss des Protokolls | 33 |
Tabelle 1: Ergebnis der Stentimplantation in der Bauchaorta der Ratte unter Verwendung eines transfemoralen Zugangs.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Implantation von koronaren Stents in menschliche Größe in die Bauchaorta von ApoE-/- Ratten. Mehrere technische Punkte sind hervorzuheben. Zunächst sollte eine Diskrepanz zwischen der Stentgröße und der Größe der Aorta vermieden werden. Das Platzieren eines zu kleinen Stents kann zu Stent-Malapposition führen, während die Implantation eines Stents, der zu groß für die Aorta ist, zu Überdehnung, Reißen und Verletzungen des Gefäßes führen kann. Daher empfehlen wir die Verwendung von Stents zwischen 2,0 und 2,5 mm Durchmesser und die Beibehaltung des Implantationsdrucks im empfohlenen Bereich, ohne den Stent zu überdehnen. Der am besten geeignete Implantationsdruck wird in der Regel vom Stenthersteller gegeben. Übermäßige Verletzungen der Oberschenkelvene und anschließend der Vena cava sollten vermieden werden, da die Gefäßwände extrem dünn und sehr leicht zu verletzen sind, was zu Blutungen führt, die schwer zu stoppen sind. Die Femoralarterie unterscheidet sich von der femoralen Vene durch Pulsation, die sorgfältig beobachtet werden sollte. Eine weitere Falle ist die Möglichkeit einer arteriellen Verletzung und Zerlegung beim Einführen des Führungsdrahtes und/oder des Ballonkatheters. Die arterielle Zerlegung kann minimiert werden, indem die Oberschenkelarterie mit Schlingen mit Seidenkrawatten gesteuert und dehnt, während der Ballonkatheter eingeführt wird. Es ist zwingend erforderlich, das Fortschreiten des Geräts sofort zu stoppen, wenn Widerstand auftritt. In diesem Fall helfen kleine Bewegungen zwischen Daumen und Zeigefinger, die Richtung des Geräts zu ändern. Unserer Erfahrung nach ist dies am häufigsten der Fall direkt unterhalb des Leistenbandes und weiter oben, wenn sich die gemeinsame Iliasarterie der Bifurkation nähert, während sie hier tiefer in den retroperitonealen Raum absteigt. Es wird sicherlich eine Lernkurve für den Bediener geben, bevor die Überlebensraten stabil sind und mit etwas Erfahrung die durchschnittliche Operationszeit etwa 20 min beträgt.
Beim Menschen werden Stents in der Regel in stark verengte atherosklerotische Arterien implantiert. Obwohl apoE-Mangel im Allgemeinen Tiere anfälliger für die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen macht, beobachteten wir keine Plaquebildung bei unseren Ratten, höchstwahrscheinlich, weil die westliche Diätfütterung erst bei der Stentimplantation begonnen wurde. Wenn Stent-Implantation in atherosklerotischen Läsionen gewünscht wird, sollte die westliche Ernährung bei 6-u20128 Wochen nach der Geburt beginnen und bis zum Opfer fortgesetzt werden. Atherosklerotische Läsionen in anfälligen Stämmen entwickeln sich nach 7-u201214 Wochen auf die fettreiche Ernährung22. Bisher wurden nur begrenzte Daten über ApoE-/- Ratten veröffentlicht. Jedoch, keine Studie berichtet spontane Läsion Entwicklung vor dem Alter von 20 Wochen23. Zhao et al. beobachteten typische Arteriosklerose bei ApoE-/- Ratten nach mindestens 24 Wochen mit einer kontinuierlichen Erhöhung der Plaquebelastung und Läsionsschwere bis zum Opfer bei 72 Wochen15. So ist es der Literatur zufolge unwahrscheinlich, dass Ratten im Alter von 14 bis 16 Wochen eine spontane Arteriosklerose entwickeln würden. Daher empfehlen wir, ältere Ratten zu verwenden und die westliche Ernährung so früh wie möglich zu beginnen, wenn eine Stentimplantation bei vorgebildeten atherosklerotischen Läsionen für die Studie gewünscht wird.
Sechs Tiere überlebten die Operation nicht. Zwei Tiere starben an Stentthrombose trotz Verabreichung von Clopidogrel. Um die Stentthrombose zu reduzieren, können Tiere für 48 h mit Aspirin vorbehandelt werden oder eine intraperitoneale Injektion von Enoxaparin postoperativ erhalten. Die Einführung von Clopidogrel einen Tag vor der Operation könnte auch das Risiko einer Thrombose reduzieren, aber jede Intensivierung der Antithrombotikumtherapie erhöht gleichzeitig das Risiko einer Blutung. StentThrombose ist eine häufige Komplikation von PCI24,25,26 und kann mehrere Gründe haben. In unserer Studie sind die Todesfälle durch Stentthrombose möglicherweise auf eine unzureichende Balloninflation und gleichzeitige Stent-Malapposition zurückzuführen. Im Gegensatz zur Stent-Implantation beim Menschen wurde der Stenteinsatz in der Bauchaorta der Ratte nicht durch Angiographie kontrolliert. Daher kann eine ineffektive Balloninflation während der Operation nicht erkannt und korrigiert werden. Ebenso kann der Stenteinsatz zu einer unbeabsichtigten Okklusion eines verzweigten Schiffes führen. Da es nicht praktikabel ist, die Operation durchzuführen, die den Einsatz eines chirurgischen Mikroskops unter fluoroskopischer Kontrolle erfordert, empfehlen wir, den Bauch zu öffnen, um den präzisen Einsatz des Stents zu bestätigen, zumindest für die ersten verschiedenen Eingriffe. Andere mögliche Ursachen für Stentthrombose können Entzündliche Reaktionen, schwere Verletzungen oder Zerlegungen der Gefäßwand sein. Der Chirurg muss alle klinischen Anzeichen kennen, die auf diese Komplikationen hinweisen, und die Tiere müssen während des Beobachtungszeitraums jeden Tag untersucht werden.
Die Bauchaorta der Ratte misst je nach Gewicht des Tieres zwischen 1,8 mm und 3,0 mm Durchmesser, je nach Gewicht des Tieres27,28. Das Vorrücken eines sperrigen Stents durch die noch kleineren Femoral- und Iliasarterien kann zu Intimrissen und Schäden an der Gefäßwand führen. Daher beschränkt sich diese Technik auf die Implantation kleinerer Stents (zwischen 2,0 und 2,5 mm Durchmesser), um eine Überdehnung oder Verletzung der Gefäßwand der Aorta zu vermeiden.
Eine weitere Einschränkung ist die Notwendigkeit, die Oberschenkelarterie zu ligieren, um nach dem Eingriff eine Hämostase zu erreichen, die möglicherweise das Risiko einer Ischämie der unteren Gliedmaßen trägt. Frühere Studien zeigten jedoch, dass Kollateralarterien sowie Anpassungen der Mikrovaskulatur distal an die Okklusion in der Lage sind, die Perfusion der unteren Gliedmaßen nach Ligation der Femoralarterie bei Ratten29aufrechtzuerhalten, und keine unserer Ratten zeigte während des Beobachtungszeitraums klinische Anzeichen einer Ischämie der unteren Gliedmaßen. Dennoch sollten sich die Forscher dieses potenziellen Risikos bewusst sein, da Gliedmaßen-Ischämie nicht nur eine mögliche Ursache für den postoperativen Tod darstellt, sondern auch potenziell eine systemische Entzündungsreaktion auslösen kann, die die Ergebnisse potenziell verzerrt.
Während Ratten im Allgemeinen ein kostengünstiges Tiermodell sind, erhöht die Verwendung von gentechnisch verändertem ApoE-/- Ratten die Kosten. Eine weitere Einschränkung ist, dass es vergleichsweise lange dauert, bis sich bei Ratten atherosklerotische Plaques entwickelt haben. Darüber hinaus gibt es einige wichtige hämodynamische Unterschiede zwischen der Aorta und den Herzkranzgefäßen, die eine genauere Aufmerksamkeit verdienen. Scherspannung ist in der Aorta höher als in den Koronaren, und Bifurkationen, die einen turbulenten Blutfluss verursachen, fehlen. Dies verringert die Entwicklung der intimalen Hyperplasie und das Ausmaß der Restenose.
Restenose ist einer der Hauptfaktoren, die den langfristigen Erfolg von koronaren Stents begrenzen. Eine Vielzahl von Tiermodellen wurden verwendet, um die Pathophysiologie der Restenose zu studieren, jedes mit seinen eigenen Vorteilen und Mängeln. Im Vergleich zu anderen Tiermodellen haben Ratten den Vorteil eines hohen Durchsatzes, einer einfachen Handhabung und Unterbringung, Reproduzierbarkeit sowie Wirtschaftlichkeit und ermöglichen gleichzeitig die Implantation von koronaren Stents in menschlicher Größe. Das erste Protokoll der Abdominal-Aorta-Stenting bei Ratten wurde von Langeveld et al.11berichtet. Dieses Modell erfordert jedoch einen transabdominalen Zugang, um den Stent einzuführen, der mit einer physischen Verengung der Aorta verbunden ist, um eine vorübergehende Unterbrechung des Blutflusses zu erreichen. Die daraus resultierende Manipulation und Gefäßverletzung kann möglicherweise zu Entzündungsreaktionen führen, die nicht nur zu Komplikationen, sondern auch zu ausgeprägten ISR12führen können. Später modifizierten Oyamada et al. das Protokoll, indem sie den Stent durch die gemeinsame Iliasarterie12einführten. Sie verglichen die Überlebensrate zwischen den beiden verschiedenen Ansätzen (Trans-Aorta versus trans-iliac arteriey) und fanden eine signifikant höhere Sterblichkeitsrate bei Tieren mit transabdominal eingesetzten Stents (57% versus 11%, p < 0,05). Ratten starben am häufigsten an Thrombose an der Schnitt-/Nahtstelle, was katastrophal ist, wenn sie in der Bauchaorta12auftreten. Weiter reduzieren Trauma taumeln und imitieren die Implantationstechnik beim Menschen näher, wir nutzten einen transfemoralen Zugang, um den Stent einzuführen und berichteten von einer Sterblichkeitsrate von 14%. Jeweils zwei Ratten starben an Gefäßverschlussversagen, inneren Blutungen und Stentthrombose. Neuere Studien berichteten jedoch, dass Diesterblichkeitsraten nach einer Stent-Implantation in der Bauchaorta der Ratte sogar bei dem transaorten Zugang30,31. Dennoch betrug die kombinierte Morbiditäts- und Sterblichkeitsrate 13,4%, in einer Studie von Nevzati et al. nach implantation von Magnesiumstents in die Ratte aorta30. Während in ihrer Serie weder gefäßverschlussnoch eine innere Blutung berichtet wurde, war eine Stentthrombose bei 10,5% der Ratten30zu beobachten. Auf der anderen Seite, Aquarius et al. berichtete keine Stentthrombose nach der Behandlung Vonminandysmen mit Flow-Diverter, jedoch diese Studie verwendet dünnere Stent-Strut-Geräte, und duale Anti-Thrombozyten-Therapie wurde den Ratten verabreicht31. Wir versuchten, ein Gleichgewicht zwischen dem Risiko von Stentthrombose und Blutungsrisiko zu finden und verabreichten Clopidogrel und Heparin in unserer Studie. Dies könnte zwar das Risiko einer Stentthrombose verringert haben, das bei 4,76 % der Ratten auftrat, aber es könnte auch der Grund für das vergleichsweise höhere Blutungsrisiko (9,52 % der Ratten) gewesen sein, entweder aufgrund einer inneren Blutung oder eines Versagens der Gefäßschließung.
Hier demonstrierten wir die Implantation eines medikamentösen Stents in die Bauchaorta der Ratte, aber auch diese Methode kann zur Bewertung anderer, ähnlich großer Stentgeräte, z.B. Bare Metal Stents oder bioresorbierbarer Gefäßgerüste, eingesetzt werden.
Zusammenfassend ist die Abdominal-Aorta-Stentstierung von Apolipoprotein-E-defizienten Ratten ein zuverlässiges und reproduzierbares Modell zur Untersuchung von ISR nach der Stent-Implantation. Das Modell kann auf die Verwendung älterer Ratten ausgedehnt werden, die eher spontan atherosklerotische Läsionen entwickeln, und durch die Prüfung anderer Geräte, die für menschliche koronare Eingriffe verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Frau Angela Freund für ihre unschätzbare technische Unterstützung bei der Einbettung und Folienproduktion. Wir danken auch Herrn Tadeusz Stopinski vom Institut für Labortierkunde & Experimentalchirurgie für seine aufschlussreiche Hilfe bei der tierärztlichen Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
- Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
- Virmani, R., Farb, A.
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
- Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
- Knowles, J. W., Maeda, N.
- Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744 (2015).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
- Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9 (2011).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
- Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
- Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13 (2014).
- Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950 (2019).
- Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
- Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18 (2004).
- Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541 (2019).
- Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
- Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835 (2018).
- Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
- Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
- Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
- Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
- Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359 (2017).
- Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).
