Summary
يصف هذا البروتوكول زرع الدعامات التاجية البشرية في الشريان الأورطي البطني للفئران ذات الخلفيةapoE -/- باستخدام الوصول عبر الفخذ. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الأخرى، تحمل نماذج مورين مزايا الإنتاجية العالية، والاستنساخ، وسهولة المناولة والإسكان، وتوافر واسع من العلامات الجزيئية.
Abstract
يمثل التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) ، إلى جانب نشر دعامة تاجية ، المعيار الذهبي في العلاج التدخلي لمرض الشريان التاجي. يتم تحديد ريستينوسيس في الدعامات (ISR) من خلال الانتشار المفرط للأنسجة النيونتيمالية داخل الدعامة ويحد من نجاح الدعامات على المدى الطويل. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية لتوضيح العمليات المرضية الفسيولوجية الكامنة وراء ريستينوسيس في الدعامات (ISR)، مع التاجية porcine ونماذج الشريان الحرقفي أرنب كونها الأكثر استخداما. توفر نماذج مورين مزايا الإنتاجية العالية وسهولة المناولة والإسكان والاستنساخ وتوافر واسع من العلامات الجزيئية. Apolipoprotein E نقص (apoE-/- ) وقد استخدم على نطاق واسع نموذج الماوس لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، يجب تصغير الدعامات لزرعها في الفئران ، والتي تنطوي على تغييرات مهمة في خصائصها الميكانيكية والبيولوجية (المحتملة). استخدام apoE-/- الفئران يمكن التغلب على هذه العيوب كما apoE-/- الفئران تسمح لتقييم الدعامات التاجية بحجم الإنسان مع توفير في الوقت نفسه النمط الظاهري غير المنشأ. وهذا يجعلها نموذجا ممتازا وموثوقا به للتحقيق ISR بعد زرع الدعامة. هنا، ونحن نصف، بالتفصيل، وزرع الدعامات التاجية البشرية المتاحة تجاريا في الشريان الأورطي البطني للفئران مع apoE-/- الخلفية باستخدام الوصول عبر الفخذ.
Introduction
يمثل التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) ، إلى جانب نشر دعامة تاجية ، المعيار الذهبي في العلاج التدخلي لمرض الشريان التاجي1. النجاح على المدى الطويل من الدعامات، ومع ذلك، يمكن أن تكون محدودة من خلال حدوث ريستينوسيس في الدعامات (ISR) التي يتم تحديدها من خلال الانتشار المفرط للأنسجة نيوينتيمال داخل الدعامة2،3. قد يتطلب ISR إعادة التدخل إما عن طريق مجازة الشريان التاجي أو إعادة PCI. وقد اقترحت مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية لدراسة ISR، كل واحد منهم يضم مزايا وأوجه قصور. العيوب الرئيسية للنماذج الشريان التاجي البرسيني والأرنب الأكثر استخداما، وإن كانت الآفات النامية مشابهة بشكل ملحوظ للبشر بعد زرع الدعامة4،5، هي تكاليف الحيوانات والمساكن الكبيرة التي تطرح صعوبات لوجستية خاصة في الدراسات طويلة الأجل ، فضلا عن القيود المفروضة على المناولة والمعدات. وعلاوة على ذلك، فإن توافر الأجسام المضادة للبروتينات الخلوية من الخنازير والأرانب محدود. من ناحية أخرى، توفر نماذج مورين المزايا الرئيسية لارتفاع الإنتاجية والتكرار، فضلا عن سهولة المناولة والإسكان، وبالتالي فعالية التكلفة. وعلاوة على ذلك، يتوفر عدد أكبر من الأجسام المضادة. ومع ذلك ، في حين أن الفئران apolipoprotein E-deficient (apoE-/-) قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة تصلب الشرايين6،7،8، فهي غير مناسبة لدراسة ISR حيث يجب تصغير الدعامات لزرعها في الفئران ، مما قد يغير الخصائص الميكانيكية للثوامع. وعلاوة على ذلك، فإن الجدار الأبهري للفئران يقيس ما بين 50 ميكرومتر في الفئران الصغيرة و 85 ميكرومتر في الفئران القديمة9، ويجب نشر الدعامات باستخدام مستويات ضغط منخفضة يصل إلى 2 أجهزة الصراف الآلي ، مما قد يؤدي إلى سوء وضع الدعامة10. الجرذان، ومع ذلك، تسمح لزرع الدعامات التاجية البشرية المتاحة تجاريا، وإظهار مسار شفاء الأوعية الدموية مماثلة للحيوانات الكبيرة بعد زرع الدعامات الأبهري، ذكرت لأول مرة من قبل Langeveldوآخرون. كانت هذه التقنية تتطلب في الأصل الوصول عبر البطن ، مما استلزم انقباضا جسديا في الشريان الأورطي لتحقيق انقطاع مؤقت لتدفق الدم. لتجنب إصابة الأوعية التي يحتمل أن تكون مرتبطة وردود الفعل الالتهابية ، تم تحسين هذه التقنية في وقت لاحق من خلال إدخال الوصول عبر الحرقفي ، مما أدى بالإضافة إلى ذلك إلى ارتفاع معدل بقاءالحيوانات 12.
لأن الفئران البرية لا تتطور الآفات تصلب الشرايين13، وقد ولدت أبو-/ - الفئران باستخدام تقنيات النيوكليز مثل النسخ المنشط مثل النيوكليز تأثير (TALEN)14، متجمعة بانتظام بين متباعدة قصيرة باليندروميك يكرر (CRISPR / Cas9)15، والزنك الاصبع (ZF)16. ApoE-/- الفئران متوفرة تجاريا منذ عام 2011. توفير خلفية ثيروجينيك، apoE-/- الفئران تسمح لتقييم أكثر واقعية من الدعامات التاجية بحجم الإنسان، وخاصة فيما يتعلق ISR.
هنا، ونحن نصف الأسلوب عبر طريق الوصول عبر الزوال واستخدام المتاحة تجاريا رقيقة الدعامات الكوبالت الكروم المخدرات eluting الدعامات (DES)، ومع ذلك، فإنه يمكن أيضا أن تطبق لدراسة أنواع الدعامات الأخرى، مثل الدعامات المعدنية العارية (BMS) أو الدعامات القابلة للتحلل الحيوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت التجارب وفقا لقانون رعاية الحيوان الألماني والتوجيه 2010/63/EU المتعلق بحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية. وقد منحت الموافقة الرسمية لهذه الدراسة من قبل اللجنة الحكومية لرعاية الحيوان واستخدامه (البروتوكول رقم: AZ 87-51.04.2010.A065; لاندسامت فور ناتور، أومويلت أوند فيربروششوتز نوردراين-ويستفالين، ريكلينغهاوزن، ألمانيا). وقد امتثل بروتوكول الدراسة لدليل رعاية واستخدام المختبر. يعتمد علاج الألم بعد الجراحة على توصيات الجمعية الألمانية لعلوم الحيوان المختبرية (GV-SOLAS) بالإضافة إلى مبادرة العلاج البيطري للألم.
1. التقنيات الأساسية والإجراءات المشتركة
- استخدام homozygous أبو-/- فئران سبراغ دولي. تحديد النمط الجيني لكل باستخدام الأساليب القياسية17.
- الحفاظ على الحيوانات في ظل ظروف مماثلة (21 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية، 60٪ ± الرطوبة 5٪، ودورة خفيفة / داكنة 12 ساعة) وضمان حرية الوصول إلى الماء والغذاء.
- تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف نظيفة ولكن غير ستيريلية.
- بمجرد تخدير الجرذ ، قم بإجراء جميع الإجراءات تحت المجهر الجراحي بتكبير 16x.
- استخدام مسحات القطن لضغط hemostasis. مسحات الشاش (5 سم × 5 سم) غارقة مع محلول رينغر المرضعات مفيدة للحفاظ على رطوبة الفخذ.
- اتبع لوائح التخلص من النفايات للتخلص من المواد المستعملة.
2. الاستعدادات قبل الجراحة
- إعداد الأدوية البيطرية قبل بدء العملية. الحفاظ على جميع الحلول في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك.
- قبل 30 دقيقة من الإجراء، تعطي 0.03-0.05 ملغم/كغ البوبرينورفين تحت الجلد.
- تخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كغ وزن الجسم (BW) (S) - الكيتامين و 8 ملغم / كغ BW xylazine.
- تقييم وزن الجرذ باستخدام مقياس الوزن.
- ضع الجرذ على وسادة التدفئة وأصلح الأطراف العلوية والسفلية باستخدام الشريط الطبي. وضع الجرذ مع الطرف الخلفي الأيسر ممتدة بالكامل وبقدر ما يتماشى مع عموده الفقري ممكن وذلك لخلق خط مستقيم بين الشريان الفخذي والشريان الأبهر. وهذا من شأنه أن يسهل النهوض الدعامة التي شنت بالبالون من خلال التشعب الأبهري.
- الحفاظ على التخدير مع استنشاق 1.5 vol٪ isoflurane في 97.5٪ الأكسجين بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة.
ملاحظة: السماح للجرذ بالتنفس تلقائيا، دون التنبيب. - تطبيق مرهم العين لمنع تلف العين أثناء فقدان الوعي.
- حلق الفراء من منطقة الفخذ وأسفل البطن من الفئران وتعقيم الجلد المقابلة مع محلول اليود بوفيدوني.
- قبل البدء في الجراحة، تحقق من العمق الكافي للتخدير عن طريق قرص طرف الذيل والأنسجة بين الأنسجة.
3. الجراحة
- جعل شق وسيط من ~ 0.5 \u20121 سم في الفخذ الأيسر لفتح الجلد واللفافة الكامنة.
- تشريح بصراحة والتحقيق في الأعماق حتى يمكن التعرف على الشريان الفخذي الأيسر النابض.
- باستخدام ملقط ناعم جدا، وإعداد الشريان الفخذي عن طريق إزالة بلطف النسيج الضام المحيطة بها. يجب الحرص على إلحاق الضرر لا العصب الفخذي ولا الوريد الفخذي، الذي هو وسيطة في الشريان.
- إعداد حوالي 1 سم من الشريان الفخذي. ضع بعناية طرف ملقط تحت السفينة لرفعه بلطف.
- قطع الخيط من خياطة الحرير 4-0 تحت الأجزاء البعيدة وال القريبة من الشريان والرافعات الشكل. المشبك نهايات كل من الرافعات الخيط اثنين بين فروع المشبك الجراحية. استخدم المشابك الجراحية للسيطرة على الشريان. تمتد بلطف ورفع الرافعات من أجل وقف تدفق الدم مؤقتا.
ملاحظة: العمل بسرعة لتجنب tourniquet لفترات طويلة والتي قد تؤدي إلى تلف الأنسجة. - باستخدام مقص صغير حاد، قم بإجراء عملية استئصال الشريان في منتصف الشريان الفخذي.
- أدخل سلك دليل من خلال عملية استئصال الشرايين. عند الوصول إلى حبال الخيط القريبة ، أطلق توتر الخيط عن طريق تحريك المشبك الجراحي وتقدم سلك الدليل نحو الشريان الأورطي البطني.
ملاحظة: قطع سلك الدليل باستخدام قاطع سلك لتسهيل التعامل. - ضع الطرف القريب من سلك الدليل بين الحجاب الحاجز والشرايين الكلوية.
ملاحظة: التقدم سلك دليل بعيدا جدا يحمل خطر الإصابة الأبهري أو القلب. نوصي بفتح البطن لضمان تحديد المواقع المناسبة للسلك الدليل الدعامة على الأقل للحيوانات عدة الأولى. - أدخل دعامة تاجية مجعدة ومثبتة بالبالون قياس 2.25 مم × 8 ملم (بحد أقصى 2.5 مم × 8 ملم) فوق سلك الإرشاد في الشريان الفخذي وتقدمه إلى الشريان الأورطي البطني.
- ضع الدعامة فوق التشعب الأبهري ولكن تحت الشرايين الكلوية. نشر الدعامة عن طريق تضخيم قسطرة البالون إلى 12 جهاز الصراف الآلي لمدة 15 s باستخدام نظام حقن التضخم.
- قم بتفرغ قسطرة البالون وحافظ على الضغط السلبي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للثمن المستخدمة.
- سحب القسطرة المفرغة ببطء مع ترك الدعامة في مكانها.
- قبل إخراج القسطرة مباشرة، قم بإنشاء توتر على حلقة الخيط فوق الشق مع المشبك الجراحي لقطع تدفق الدم مرة أخرى. ثم قم بإزالة قسطرة البالون وتسيخ السفينة مباشرة بشكل مباشر.
- ربط حلقات الخيط القريب والبعدي ل ligate الشريان الفخذي وتأكيد الهموستاسي كافية من استئصال الشرايين. الشرايين الجانبية ستضمن المزيد من التشوه في الطرف.
- أغلق العضلات التي تفرط في الشريان، وكذلك شق الجلد باستخدام الغرز غير القابلة للتكلس 10-0.
4. العناية بالحيوان بعد زرع الدعامة
- بعد العملية مباشرة، اسمح للجرذ بالتعافي لمدة 60 دقيقة في قفص وحدة العناية المركزة الخاصة مع الهواء الدافئ (30 درجة مئوية) وإمدادات الأكسجين.
- مشاهدة الحيوانات بعناية حتى تعافى تماما. بعد ذلك، نقل الفئران إلى قفص عادي. توفير إمكانية الحصول على المياه والغذاء.
- إعطاء مسكن بعد الجراحة كل 6-12 ساعة مع 0.03-0.05 ملغم / كجم البوبرينورفين (ق.c، في 500μl NaCl) لما مجموعه 72 ساعة تحت التقييم السريري.
- يكون الطعام مختلطة مع كلوبيدوغريل (15 ملغ / كغ) لتجنب تجلط الدعامة المزروعة.
- لتعزيز ظروف فرط الكوليسترول في الدم وتشكيل البلاك، ابدأ تغذية النظام الغذائي الغربي في 6 أسابيع بعد الولادة وتستمر حتى القتل الرحيم. إذا رغبت في ذلك، يمكن لمجموعة من الحيوانات تغذية تشاو الفئران العادية بمثابة السيطرة.
5. جمع الأنسجة ومعالجتها
- قبل البدء في إزالة الأنسجة عند النقطة الزمنية المحددة ، قتل الحيوان وفقا لإرشادات IACUC. حصاد الشريان الأورطي الدعامات للتحليل النسيجي في نهاية فترة المراقبة.
- افتح البطن بواسطة شق خط الوسط وأزل الجزء الدعامات من الشريان الأورطي وكذلك الأجزاء غير الدعامات المجاورة من الشريان الأورطي، وقياس 0.5 سم لكل منهما.
- وضع الأنسجة في حل من 4٪ الفورماتين المخزنة مؤقتا لمدة 24 ساعة لتثبيت.
- تضمين الأنسجة الشريانية الدعامات في البلاستيك وأداء تلطيخ النسيج والناعمية الكيميائية وفقا للبروتوكولات القياسية18،19.
6. تحليل الهستومورمومترية
- إجراء تحليل الهستومورفومتري للأقسام المتتابعة للجزء القريب والمتوسط والقاصي من الشريان الأورطي الدعامات عن طريق المجهر المرتبط بجهاز كمبيوتر مع برنامج تحليل صورة مناسب.
- تتبع ملامح الصفيحة المرنة الخارجية (EEL ، بين adventitia ووسائل الإعلام) ، والصفائح المرنة الداخلية (IEL ، بين الوسائط وne neointima) ، والتجويف مع لوح رسم جرافيك. من هذه القيم، حساب منطقة EEL، منطقة IEL، ومنطقة التجويف مع البرنامج.
- حساب نسبة إعادة التشريح في الدعامات (ISR):
- حساب إجمالي منطقة نيوينتيمال (Ai):
- قياس سمك neointimal (NIT) على كل الدعامة الدعامة والمسافة بين الدعامة والتجويف. قياس NIT بين الدعامات الدعامات والمسافة بين IEL والتجويف.
ملاحظة: بدلا من ذلك، حساب NIT ك
حيث PL و PIEL هي التجويف ومحيط الصفيحة المرنة الداخلية، على التوالي20. - إجراء تحليلات إضافية وفقا لمتطلبات الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول زرع الدعامات في الشريان الأورطي البطني للفئران باستخدام طريق الوصول عبر الفخذ(الشكل 1). النقطة المركزية الأولى من هذا النموذج الحيواني هو أنه يسمح لنشر الدعامات التاجية بحجم الإنسان. يمكن وضع دعامة تاجية مجعدة ومثبتة بالبالون في الشريان الأورطي البطني للفئران. وهكذا، بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق نفس مبدأ نشر الدعامات كما هو الحال في البشر. ومن المزايا الأخرى لاستخدام الجرذان توافر السلالات المعدلة وراثيا، مثل الفئران apoE-/- المتاحة تجاريا.
لقد استخدمنا مؤخرا هذه الطريقة لتقييم ما إذا كانت الفئران التي تعاني من نقص Apolipoprotein E أكثر عرضة لتطوير ISR بالمقارنة مع الفئران البرية21. من بين ما مجموعه 42 فأرا ذكرا يخضعون لزراعة الدعامات، أكمل 36 فأرا بروتوكول الدراسة بعد 28 يوما (معدل البقاء على قيد الحياة = 85.71٪). توفي كل من الفئران اثنين من فشل إغلاق السفن، ونزيف داخلي، وتجلط الدعامات. لم يكن من الممكن تحليل الدعامات من ثلاثة لأن الأنسجة تضررت بشكل خطير أو تعطلت بسبب فشل المعالجة. على الأرجح، حدث هذا أثناء إجراء نشر. نوصي بالتدريب على تنفيذ هذه التقنية عدة مرات قبل بدء الدراسة.
وفي الجرذان ال 33 المتبقية، تم بنجاح نشر الدعامات التاجية بحجم الإنسان دون أي علامة على سوء الإصابة أو إصابة السفينة(الجدول 1). وكان وزن الجسم مماثلا في النمط البري apoE+/+ و apoE-/- الفئران (530.1 ± 15.94 غرام مقابل 513.6 ± 16.45 غرام). Homozygous apoE-/- الفئران وضعت مرتفعة بشكل ملحوظ تضخم النيوينتيمال و ISR بالمقارنة مع البرية apoE+/+ الفئران (الشكل 2). على الرغم من أن apoE-/- الخلفية يجعل الحيوانات أكثر عرضة ل تصلب الشرايين ، خاصة عندما تتغذى على النظام الغذائي الغربي ، إلا أننا لم نلاحظ أي لويحات تصلب الشرايين السابقة في فئراننا ، على الأرجح لأن النظام الغذائي الغربي لم يبدأ حتى الجراحة وكانت فترة الملاحظة اللاحقة لمدة أربعة أسابيع قصيرة جدا لتطوير آفة تصلب الشرايين.
الشكل 1: مخطط زرع الدعامة في الشريان الأورطي البطني للفئران باستخدام الوصول عبر الفخذ.
(أ)بعد انقطاع تدفق الدم، يتم إدخال سلك دليل من خلال استئصال الشريان الوسيط. (ب)يتم إدخال دعامة تاجية مجعدة ومثبتة بالبالون فوق سلك الإرشاد إلى الشريان الفخذي. (ج)يتم تقديم الدعامة المثبتة بالبالون إلى الشريان الأورطي البطني ، حيث يتم نشرها عن طريق تضخم البالون. يجب وضع الدعامة فوق التشعب وتحت الشرايين الكلوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الفوتوميكوغرافيا التمثيلية ل الشريان الأورطي البطني الملطخ بجيمسا بعد 28 يوما من زرع الدعامات في تغذية النظام الغذائي الغربي.
(أ) البرية apoE+/+ الفئران و (ب) Homozygous apoE-/- الفئران. صور عالية الطاقة: NI = نيوينتيما، سانت = الدعامة الدعامة، M = وسائل الإعلام تونيكا، L = التجويف. وقد استنسخ الشكل مع تعديلات من كورنيليسين، أ. وآخرون21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عدد الفئران | |
| فشل إغلاق السفينة | 2 |
| نزيف داخلي | 2 |
| تجلط الدعامات | 2 |
| فشل معالجة الأنسجة | 3 |
| الانتهاء بنجاح من البروتوكول | 33 |
الجدول 1: نتيجة زرع الدعامات في الشريان الأورطي البطني للفئران باستخدام الوصول عبر الفخذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول زرع الدعامات التاجية بحجم الإنسان في الشريان الأورطي البطني للفئران-/- apoE. وهناك عدة نقاط تقنية جديرة بالتشديد عليها. أولا، يجب تجنب عدم التطابق بين حجم الدعامة وحجم الشريان الأورطي. يمكن أن يؤدي وضع دعامة صغيرة جدا إلى سوء وضع الدعامات ، في حين أن زرع دعامة كبيرة جدا بالنسبة للهرطية يمكن أن يسبب تمددا زائدا وتمزيقا وإصابة السفينة. لذلك، نوصي باستخدام الدعامات التي يتراوح قطرها بين 2.0 و 2.5 مم، والحفاظ على ضغط الزرع ضمن النطاق الموصى به دون إرهاق الدعامة. عادة ما يتم إعطاء ضغط الزرع الأنسب من قبل الشركة المصنعة للثمن. يجب تجنب الإصابة الزائدة في الوريد الفخذي وبالتالي الوريد الكافا لأن جدران الأوعية رقيقة للغاية وسهلة الإصابة ، مما يؤدي إلى نزيف يصعب إيقافه. يمكن تمييز الشريان الفخذي عن الوريد الفخذي عن طريق النبض ، والذي يجب ملاحظته بعناية. عثرة أخرى هي إمكانية إصابة الشرايين وتشريح عند إدخال الدليل و / أو قسطرة البالون. يمكن تقليل تشريح الشريان عن طريق التحكم في الشريان الفخذي ومده بشكل كبير باستخدام الرافعات باستخدام روابط الحرير أثناء إدخال قسطرة البالون. من الضروري التوقف فورا عن تقدم الجهاز عند مواجهة المقاومة. في هذه الحالة، تساعد الحركات الصغيرة بين الإبهام والسبابة في تغيير اتجاه الجهاز. في تجربتنا ، وهذا هو الحال في معظم الأحيان فقط تحت الرباط الأربي وإلى أبعد من ذلك ، عندما يقترب الشريان الحرقفي المشترك من التشعب ، لأنه ينحدر أعمق في الفضاء الرجعية هنا. سيكون هناك بالتأكيد منحنى التعلم للمشغل قبل أن تكون معدلات البقاء على قيد الحياة مستقرة ومع بعض الخبرة ، فإن متوسط الوقت الجراحي حوالي 20 دقيقة.
في البشر ، وعادة ما تزرع الدعامات في الشرايين تصلب الشرايين ضاقت بشدة. على الرغم من أن نقص apoE بشكل عام يجعل الحيوانات أكثر عرضة لتطوير الآفات تصلب الشرايين ، إلا أننا لم نلاحظ أي تكوين لوحة في فئراننا ، على الأرجح لأن تغذية النظام الغذائي الغربي لم تبدأ حتى زرع الدعامة. إذا كان زرع الدعامات في الآفات تصلب الشرايين هو المطلوب، يجب أن يبدأ النظام الغذائي الغربي في 6 أسابيع بعد الولادة وتستمر حتى التضحية. سوف الآفات تصلب الشرايين في سلالات عرضة لتطوير بعد 7 أسابيع على النظام الغذائي الغني بالدهون22. حتى الآن، تم نشر بيانات محدودة فقط عن apoE-/- الفئران. ومع ذلك، لم تبلغ أي دراسة عن تطور الآفات التلقائي قبل سن 20 أسبوعا23. لاحظ تشاو وآخرون تصلب الشرايين النموذجي في apoE-/- الفئران بعد 24 أسبوعا على الأقل مع زيادة مستمرة في عبء البلاك وشدة الآفة حتى التضحية في 72 أسبوعا15. وهكذا ، وفقا للأدب ، فمن غير المحتمل أن الفئران سوف تتطور تصلب الشرايين العفوية في 14-16 أسابيع من العمر. لذلك ، نوصي باستخدام الفئران القديمة وبدء النظام الغذائي الغربي في أقرب وقت ممكن إذا كان زرع الدعامات في الآفات تصلب الشرايين التي تم تشكيلها مسبقا مرغوبا فيه للدراسة.
ولم تنجو ستة من الجراحة. توفي حيوانان من تجلط الدعامات على الرغم من إدارة كلوبيدوجريل. للحد من تجلط الدعامات، يمكن علاج الحيوانات مسبقا لمدة 48 ساعة مع الأسبرين أو تلقي حقن داخل الصفاق من إينوكاسابارين بعد الجراحة. إدخال clopidogrel قبل يوم واحد من الجراحة قد يقلل أيضا من خطر التجلط، ولكن أي تكثيف للعلاج المضاد للجلطات في نفس الوقت يزيد من خطر النزيف. تجلط الدعامات هو أحد المضاعفات الشائعة ل PCI24،25،26 ويمكن أن يكون له عدة أسباب. من المحتمل، في دراستنا، أن تكون الوفيات الناجمة عن تجلط الدعامات ناتجة عن تضخم غير كاف في البالونات وسوء وضع الدعامات المتزامن. على النقيض من زرع الدعامات في البشر ، لم يتم التحكم في نشر الدعامات في الشريان الأورطي البطني للفئران عن طريق تصوير الأوعية. لذلك، لا يمكن الكشف عن تضخم البالون غير الفعال وتصحيحه أثناء الجراحة. وبالمثل، قد يؤدي نشر الدعامات إلى انسداد غير مقصود لسفينة متفرعة. وبالنظر إلى أنه من غير العملي إجراء الجراحة التي تتطلب استخدام المجهر الجراحي تحت التحكم بالمنظار ، نوصي بفتح البطن لتأكيد النشر الدقيق للجذان ، على الأقل للإجراءات العديدة الأولى. قد تكون الأسباب المحتملة الأخرى لتجلط الدعامات هي ردود الفعل الالتهابية أو الإصابة الشديدة أو تشريح جدار الوعاء. يجب أن يكون الجراح على علم بأي علامات سريرية تشير إلى هذه المضاعفات ، ويجب فحص الحيوانات كل يوم طوال فترة الملاحظة.
يبلغ قطر الشريان الأورطي البطني للفئران ما بين 1.8 مم و3.0 مم، اعتمادا على وزن الحيوان27و28. قد يؤدي تقدم الدعامة الضخمة عبر الشرايين الفخذية والإيلية الأصغر إلى تمزق وإيلام إلى جدار السفينة. لذلك ، تقتصر هذه التقنية على زرع الدعامات الصغيرة (بين قطر 2.0 و 2.5 ملم) لتجنب التمدد الزائد أو إصابة جدار السفينة في الشريان الأورطي.
وهناك قيد آخر هو ضرورة ربط الشريان الفخذي من أجل تحقيق الهموستاسي بعد العملية ، مما قد يحمل خطر نقص التروية في الطرف السفلي. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أن الشرايين الجانبية وكذلك التكيفات من الفصيل المجهري إلى انسداد قادرة على الحفاظ على انحراف الطرف السفلي بعد ربط الشريان الفخذي في الفئران29، ولم تظهر أي من الفئران لدينا علامات سريرية على نقص التروية في الطرف السفلي خلال فترة الملاحظة. ومع ذلك ، ينبغي أن يكون المحققون على بينة من هذا الخطر المحتمل ، حيث أن نقص التروية في الأطراف لا يمثل فقط سببا محتملا للوفاة بعد الجراحة ، ولكن يمكن أيضا أن يؤدي إلى رد فعل التهابي نظامي ، مما قد يؤدي إلى تحيز النتائج.
في حين أن الفئران بشكل عام هي نموذج حيواني فعال من حيث التكلفة ، فإن استخدام apoE المعدل وراثيا- / - الفئران يزيد من التكلفة. وهناك قيد آخر هو أن الأمر يستغرق وقتا طويلا نسبيا حتى لويحات تصلب الشرايين قد وضعت في الفئران. وعلاوة على ذلك، هناك بعض الاختلافات الهامة في ديناميكية الدم بين الشريان الأورطي والشرايين التاجية التي تستحق اهتماما أوثق. إجهاد القص أعلى في الشريان الأورطي بالمقارنة مع التاجيات ، وتشعبات تسبب تدفق الدم المضطرب غائبة. وهذا يقلل من تطور فرط التنسج الايحاء ومدى ريستيونوسيس.
ريستينوسيس هو واحد من العوامل الرئيسية التي تحد من نجاح الدعامات التاجية على المدى الطويل. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للراحة، كل منها يتميز بمزاياه وأوجه قصوره الخاصة. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الأخرى ، تتمتع الفئران بميزة الإنتاجية العالية ، وسهولة المناولة والإسكان ، والتكرار ، وكذلك فعالية التكلفة ، مع السماح في الوقت نفسه بزرع الدعامات التاجية بحجم الإنسان. تم الإبلاغ عن البروتوكول الأول من الدعامات الشريان الأورطي البطنيفي الفئران من قبل Langeveld وآخرون. هذا النموذج، ومع ذلك، يتطلب الوصول عبر البطن لإدخال الدعامة، والذي يرتبط مع انقباض مادي من الشريان الأورطي لتحقيق انقطاع مؤقت لتدفق الدم. قد يؤدي التلاعب الناتج وإصابة الأوعية إلى ردود فعل التهابية ، والتي قد لا تؤدي فقط إلى مضاعفات ، ولكن أيضا إلى ISR12. في وقت لاحق، Oyamada وآخرون تعديل البروتوكول عن طريق إدخال الدعامة من خلال الشريان الحرقفي المشترك12. وقارنوا معدل البقاء على قيد الحياة بين النهجين المختلفين (الشريان عبر الشريان الأورطي مقابل الشريان العابر للوياق) ووجدوا معدل وفيات أعلى بكثير في الحيوانات ذات الدعامات المنتشرة عبر البطن (57٪ مقابل 11٪، ص < 0.05). الفئران الأكثر شيوعا توفي من تجلط الدم في شق / خياطة الموقع، وهو أمر كارثي عندما تحدث في الشريان الأورطيالبطني 12. زيادة الحد من الصدمة ومحاكاة تقنية زرع في البشر عن كثب، استخدمنا الوصول عبر الفخذ لإدخال الدعامة وأبلغنا عن معدل وفيات من 14٪. توفي كل من الفئران اثنين من فشل إغلاق السفن، ونزيف داخلي، وتجلط الدعامات. دراسات أكثر حداثة، ومع ذلك، ذكرت معدلات وفيات منخفضة يصل إلى 6٪ بعد زرع الدعامات في الشريان الأورطي البطني الفئران حتى مع الوصول عبر الأبهر30،31. ومع ذلك ، كان معدل المراضة والوفيات مجتمعة 13.4 ٪ ، في دراسة أجراها Nevzati وآخرون بعد زرع الدعامات المغنيسيوم في الشريان الأورطي الفئران30. في حين لم يتم الإبلاغ عن فشل إغلاق السفن ولا نزيف داخلي في سلسلتها ، كان تجلط الدعامات واضحا في 10.5٪ من الفئران30. من ناحية أخرى، لم الدلو وآخرون لم يبلغوا عن أي تجلط الدعامات بعد علاج تمدد الأوعية الدموية الجدار الجانبي مع محولات التدفق، ومع ذلك، استخدمت هذه الدراسة أرق أجهزة الدعامات الدعامة، وكان تدار العلاج المزدوج المضاد للصفيحات للفئران31. حاولنا تحقيق توازن بين خطر تجلط الدعامات وخطر النزيف وأدارت كلوبيدوجريل وهيبارين في دراستنا. في حين أن هذا قد يكون قلل من خطر تجلط الدعامات ، والذي حدث في 4.76٪ من الفئران ، فقد يكون أيضا السبب في ارتفاع خطر النزيف نسبيا (9.52٪ من الفئران) ، إما بسبب النزيف الداخلي أو فشل إغلاق الأوعية.
هنا ، أظهرنا زرع دعامة الدواء في الشريان الأورطي البطني للفئران ، ولكن بالمثل يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم أجهزة الدعامات الأخرى ذات الحجم المماثل ، على سبيل المثال الدعامات المعدنية العارية أو سقالات الأوعية الدموية القابلة للترشهر الحيوي.
وباختصار، الدعامات الشريان الأورطي البطني من الفئران Apolipoprotein E-ناقص هو نموذج موثوق بها وقابلة للاستنساخ للتحقيق ISR بعد زرع الدعامة. يمكن توسيع نطاق النموذج ليشمل استخدام الفئران الأكبر سنا ، والتي من المرجح أن تتطور الآفات تصلب الشرايين تلقائيا ، واختبار الأجهزة الأخرى المستخدمة للتدخل التاجي البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر السيدة أنجيلا فرويند على مساعدتها التقنية القيمة في مجال التضمين وإنتاج الشرائح. كما نود أن نشكر السيد تاديوش ستوينسكي في معهد علوم الحيوان المختبرية والجراحة التجريبية على مساعدته الثاقبة في العمل البيطري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
- Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
- Virmani, R., Farb, A. Pathology of in-stent restenosis. Current Opinion in Lipidology. 10 (6), 499-506 (1999).
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
- Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
- Knowles, J. W., Maeda, N. Genetic modifiers of atherosclerosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (11), 2336-2345 (2000).
- Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744 (2015).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
- Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9 (2011).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
- Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
- Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13 (2014).
- Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950 (2019).
- Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
- Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18 (2004).
- Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541 (2019).
- Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
- Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835 (2018).
- Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
- Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
- Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
- Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
- Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359 (2017).
- Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).
