Summary
Bu protokol, insan koroner stentlerin trans-femoral erişim kullanılarak apoE-/- arka plan ile sıçanların karın aortuna implantesini açıklar. Diğer hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, murine modelleri yüksek verim, tekrarlanabilirlik, kullanım ve muhafaza kolaylığı ve moleküler belirteçlerin geniş bir kullanılabilirliği avantajlarını taşır.
Abstract
Perkütan koroner girişim (PCI), koroner stent dağıtımı ile birlikte koroner arter hastalığının girişimsel tedavisinde altın standardı temsil eder. Stent içi restenoz (ISR), stent içindeki neointimal dokunun aşırı çoğalması ile belirlenir ve stentlerin uzun süreli başarısını sınırlar. Steno-in-stent restenozunun (ISR) altında yatan patofizyolojik süreçlerin aydınlatılması için çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır, porsin koroner ve tavşan iliak arter modelleri en sık kullanılanlardır. Murine modelleri, yüksek verim, kullanım ve gövde kolaylığı, tekrarlanabilirlik ve moleküler belirteçlerin geniş bir kullanılabilirliği avantajları sağlar. Apolipoprotein E eksikliği (apoE-/- ) fare modeli kardiyovasküler hastalıkları incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, stentlerin farelere yerleştirilmek için minyatürleştirilmesi gerekir, mekanik ve (potansiyel olarak) biyolojik özelliklerinin önemli değişikliklerini içeren. ApoE-/- sıçanların kullanımı, apoE-/- sıçanlar insan büyüklüğünde koroner stentlerin değerlendirilmesine izin verirken aynı zamanda aterojenik bir fenotip sağlarken bu eksikliklerin üstesinden gelebilir. Bu, stent implantasyonundan sonra ISR'yi araştırmak için mükemmel ve güvenilir bir model haline getirir. Burada, ticari olarak mevcut insan koroner stentlerinin trans-femoral erişim kullanarak apoE-/- arka plan ile sıçanların karın aortuna implante edilmesi ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Introduction
Perkütan koroner girişim (PCI), koroner stent dağıtımı ile birlikte koroner arter hastalığının girişimsel tedavisinde altın standardı temsil eder1. Bununla birlikte, stentlerin uzun vadeli başarısı, stent içinde neointimal dokunun aşırı çoğalması ile belirlenen stent istirenozunun (ISR) ortaya çıkması ile sınırlanabilir2,3. ISR koroner arter bypass veya yeniden PCI ile yeniden müdahale gerektirebilir. ISR'nin çalışması için her biri avantaj ve eksiklik içeren çeşitli hayvan modelleri önerilmiştir. En sık kullanılan porcine koroner ve tavşan iliak arter modellerinin en büyük dezavantajları, stent implantasyonu4,5'ten sonra insanlara belirgin bir şekilde benzeyen lezyonlar geliştirmek deolsa,özellikle uzun vadeli çalışmalarda lojistik zorlukların yanı sıra elleçleme ve ekipman sınırlamalarını gündeme getiren büyük hayvan ve barınma maliyetleridir. Ayrıca, domuz ve tavşanların hücresel proteinlerine karşı antikorların mevcudiyeti sınırlıdır. Öte yandan, murine modelleri yüksek verim ve tekrarlanabilirliğin yanı sıra kullanım kolaylığı, konut ve dolayısıyla maliyet etkinliğinin önemli avantajlarını sağlar. Ayrıca, daha fazla sayıda antikor mevcuttur. Bununla birlikte, apolipoprotein E-eksik (apoE-/-) fareler ateroskleroz6,7,8çalışması için yaygın olarak kullanılmış olsa da, stentlerin farelere implante edilmesi için minyatürleştirilmesi ve stentlerin mekanik özelliklerinin potansiyel olarak değiştirilmesi gerektiği için ISR çalışması için uygun değildir. Ayrıca, farelerin aort duvarı genç farelerde 50 μm ile yaşlı farelerde 85 μm arasında ölçülmektedir9ve stentler 2 atm kadar düşük basınç seviyeleri kullanılarak dağıtılmalıdır, bu da stenin malapposition10'ayol açabilir. Bununla birlikte, sıçanlar, ticari olarak mevcut insan koroner stentlerin implantasyonuna izin verir ve ilk olarak Langeveld ve ark.11tarafından bildirilen aort stent implantasyonundan sonra daha büyük hayvanlara benzer bir damar iyileşme kursu gösterir. Bu teknik başlangıçta, kan akışının geçici olarak kesintiye uğraması için aortu fiziksel olarak daraltmayı gerektiren bir trans-abdominal erişim gerektiriyordu. Potansiyel olarak ilişkili damar yaralanmasını ve enflamatuar reaksiyonları önlemek için, teknik daha sonra hayvanların daha yüksek bir hayatta kalma oranına neden olan bir trans-iliak erişimin tanıtılmasıyla rafine edildi12.
Wildtype sıçanlar aterosklerotik lezyonlar geliştirmediği için13, apoE-/- sıçanlar Transkripsiyon Aktivatör Benzeri Efektör Nükleaz (TALEN)14, Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindropik Tekrarlar (CRISPR/ Cas9)15ve Çinko Parmak (ZF)16gibi nükleaz teknikleri kullanılarak üretilmiştir. ApoE-/- sıçanlar 2011 yılından beri ticari olarak mevcuttur. Aterojenik bir arka plan sağlayan apoE-/- sıçanlar, özellikle ISR ile ilgili olarak insan büyüklüğündeki koroner stentlerin daha gerçekçi bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Burada, yöntemi transfemoral erişim yolu üzerinden ve piyasada bulunan ince payanda kobalt-krom ilaç eluting stent (DES) kullanarak açıklıyoruz, ancak çıplak metal stentler (BMS) veya biyolojik olarak parçalanabilir stentler gibi diğer stent türlerinin çalışması için de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler, bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasıyla ilgili Alman hayvan refahı yasası (TSchG) ve Direktifi 2010/63/AB uyarınca gerçek gerçekleştirildi. Bu çalışma için resmi onay Hükümet Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından verilmiştir (Protokol No.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Almanya). Çalışma protokolü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi. Ameliyat sonrası ağrı tedavisi, Alman Laboratuvar Hayvanları Bilimi Derneği'nin (GV-SOLAS) önerilerine ve Girişim Veteriner Ağrı Terapisi'ne dayanmaktadır.
1. Temel teknikler ve ortak prosedürler
- Homozigöz apoE-/- Sprague-Dawley sıçanları kullanın. Standart yöntemler kullanarak her hayvanın genotipini tanımlayın17.
- Hayvanları aynı koşullarda (21 °C ± 2 °C, %60 ± %5 nem ve 12 saat açık/karanlık döngü) tutun ve suya ve yiyeceğe ücretsiz erişim sağlayın.
- Tüm prosedürleri temiz ama nonsteril koşullar altında gerçekleştirin.
- Sıçan uyuşturuldıktan sonra, tüm prosedürleri 16x büyütmede cerrahi bir mikroskop altında gerçekleştirin.
- Sıkıştırma hemostazı için pamuklu çubuk kullanın. Laktlı Ringer çözeltisi ile ıslatılmış gazlı bez sürüntüleri (5 cm x 5 cm) kasık nemli tutmak için faydalıdır.
- Kullanılmış malzemeleri bertaraf etmek için atık bertaraf yönetmeliklerine uyun.
2. Ameliyat öncesi hazırlıklar
- Operasyona başlamadan önce veteriner ilaçlarını hazırlayın. Aksi belirtilmedikçe tüm çözümleri oda sıcaklığında tutun.
- İşlemden otuz dakika önce, 0.03-0.05 mg/kg buprenorfin deri altından uygulayın.
- Sıçanı 100 mg/kg vücut ağırlığı (BW) (S)-ketamin ve 8 mg/kg BW ksilazin intraperitoneal enjeksiyon ile uyuşturun.
- Bir tartım terazisi kullanarak sıçanın ağırlığını değerlendirin.
- Sıçanı bir ısıtma yastığına yerleştirin ve tıbbi bant kullanarak üst ve alt uzuvları sabitleyin. Sıçanı sol arka uzvu tamamen uzatılmış ve omurgasıyla mümkün olduğunca uyumlu olarak konumlandırın, böylece femoral arter ve aort arasında düz bir çizgi oluşturun. Bu, balona monte stentlerin aort çatallanması yoluyla ilerletilmesini kolaylaştıracaktır.
- 2 L/dk akış hızında %97,5 oksijende %1,5 vol izofluran soluma ile anesteziyi koruyun.
NOT: Sıçanın entübasyon yapmadan kendiliğinden nefes almasına izin verin. - Bilinçsizlik sırasında göz hasarlarını önlemek için göz merhemi uygulayın.
- Kürkü sıçanın kasık ve alt karın bölgesinden tıraş edin ve ilgili cildi bir povidone-iyot çözeltisi ile sterilize edin.
- Ameliyata başlamadan önce kuyruk ucunu ve interdigital dokuyu sıkıştırarak yeterli anestezi derinliğini doğrulayın.
3. Cerrahi
- Cildi ve alttaki fasyayı açmak için sol kasıkta ~0,5\u20121 cm medial kesi yapın.
- Titreşen sol uyluk atardamarı tespit edilene kadar derinlikleri künt bir şekilde parçalara ayrılın ve araştırın.
- Çok ince tokmalar kullanarak, çevredeki bağ dokusunu nazikçe çıkararak femoral arteri hazırlayın. Ne femoral sinire ne de artere medial olan femoral damara zarar vermeye dikkat edin.
- Femoral arterin yaklaşık 1 cm'sini hazırlayın. Yavaşça kaldırmak için kabın altına asma ucunu dikkatlice koyun.
- Atardamarın distal ve proksimal kısımlarının altında 4-0 ipek dikiş iplik parçaları ve sapanlar oluşturur. İki iplik sapanının her birinin uçlarını cerrahi kelepçenin dalları arasında sıkıştırın. Atardamarı kontrol etmek için cerrahi kelepçeleri kullanın. Kan akışını geçici olarak kesmek için sapanları hafifçe uzatın ve kaldırın.
NOT: Doku hasarına yol açabilecek uzun süreli bir turnikeden kaçınmak için hızlı çalışın. - Keskin mikro makas kullanarak, femoral arterin ortasında bir arteriotomi gerçekleştirin.
- Arteriotomi yoluyla bir kılavuz tel tanıtın. Proksimal iplik sapanlarına ulaşırken, cerrahi kelepçeyi hareket ettirerek ipliğin gerginliğini serbest bırakın ve kılavuz teli karın aortine doğru daha da ilerletin.
NOT: Elleçlemeyi kolaylaştırmak için kılavuz teli bir tel kesici kullanarak kesin. - Kılavuz telin proksimal ucunu diyafram ve renal arterler arasına yerleştirin.
NOT: Kılavuz telin çok ileriye doğru ilerleten aort veya kardiyak yaralanma riski taşır. Kılavuz telin ve stenin en azından ilk birkaç hayvan için yeterli konumlandırılmasını sağlamak için karnın açılmasını öneririz. - Kılavuz tel üzerinden uyluk atardamarına 2,25 mm x 8 mm (maks. 2,5 mm x 8 mm) ölçülerinde kıvrkıt ve balona monte koroner stent takın ve karın aortuna ilerletin.
- Stetiği aort çatallanmasının hemen üstüne ancak renal arterlerin altına yerleştirin. Balon kateterini şişirerek steni 15 sn için 12 atm'ye şişirerek bir şişirme şırınna sistemi kullanarak dağıtın.
- Balon kateterini söndür ve üreticinin kullanımdaki stent için önerilerine göre negatif basıncı koruyun.
- Sönmüş kateteri yavaşça çekin ve steni yerinde bırakın.
- Kateteri çıkarmadan hemen önce, kan akışını tekrar kesmek için cerrahi kelepçe ile kesiğin üzerindeki iplik halkasında gerginlik yaratın. Daha sonra balon kateterini çıkarın ve damarı proksimally olarak doğrudan lige edin.
- Femoral arteri lige etmek ve arteriotomi yeterli hemostazı doğrulamak için proksimal ve distal iplik döngülerini bağlayın. Kollateral arterler uzuvlara daha fazla perfüzyon sağlayacaktır.
- 10-0 resorbable olmayan dikiş kullanarak arterin üzerindeki kası ve cilt kesisini kapatın.
4. Stent implantasyonundan sonra hayvan bakımı
- Ameliyattan hemen sonra, farenin ısınan hava (30\u201235 °C) ve oksijen kaynağı olan özel bir yoğun bakım ünitesi kafesinde 60 dakika boyunca iyileşmesine izin verin.
- Tamamen iyileşene kadar hayvanları dikkatlice izleyin. Daha sonra, sıçanları normal bir kafese taşıyın. Suya ve yiyeneğe reklam libitum erişimi sağlayın.
- Klinik değerlendirme altında toplam 72 saat boyunca 0.03-0.05 mg/kg buprenorfin (s.c., in 500μl NaCl) ile her 6-12 saatte bir postoperatif analjezi uygulamak.
- İmplant edilen stensin trombozdan kaçınmak için yiyecekleri klopidogrel (15 mg/kg) ile karıştırın.
- Hiperkolestemik koşulları ve plak oluşumunu geliştirmek için doğumdan 6\u20128 hafta sonra batı diyet beslenmesine başlayın ve ötanaziye kadar devam edin. İstenirse, normal sıçan yemeğiyle beslenen bir hayvan grubu kontrol görevi görebilirsiniz.
5. Doku toplama ve işleme
- Doku eksplantasyonuna belirlenen zaman noktasında başlamadan önce, hayvanı IACUC yönergelerine göre ötenazi edin. Gözlem süresinin sonunda histolojik analiz için stented aort hasat edin.
- Karnı orta çizgi kesiğiyle açın ve aortun eğimli segmentini ve aortun bitişik olmayan kısımlarını her biri 0,5 cm ölçülerinde çıkarın.
- Dokuyu sabitleme için 24 saat boyunca% 4 tamponlanmış formalin çözeltisine yerleştirin.
- Stented arteriyel dokuyu plastiğe gömün ve standart protokollere göre histolojik ve immünohistokimyasal lekeleme gerçekleştirin18,19.
6. Histomorfometrik analiz
- Uygun bir görüntü analiz yazılımına sahip bir bilgisayara bağlı mikroskop vasıtasıyla, stental aortun proksimal, orta ve distal kısmının sıralı bölümlerinin histoporfometrik analizini yapın.
- Dış elastik lamina (EEL, adventitia ve medya arasında), iç elastik lamina (IEL, medya ve neointima arasında) ve lümen konturlarını bir grafik çizim tableti ile takip edin. Bu değerlerden, yazılımla birlikte EEL alanını, IEL alanını ve lümen alanını hesaplayın.
- Stent restenozunda (ISR) kesitsel alan yüzdesini hesaplayın:
- Toplam neointimal alanı hesaplayın (Ai):
- Her stent payandası üzerindeki neointimal kalınlığı (NIT) payanda ve lümen arasındaki mesafe olarak ölçün. Nit'i stent payandaları arasında IEL ve lümen arasındaki mesafe olarak ölçün.
NOT: Alternatif olarak, NIT'yi
burada PL ve PIEL sırasıyla lümen ve iç elastik lamina çevresidir20. - Çalışmanın gerekliliklerine göre ek analizler yapmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, trans-femoral erişim yolu kullanan sıçanların karın aortunda stent implantasyonunu açıklar (Şekil 1). Bu hayvan modelinin ilk merkezi noktası, insan büyüklüğünde koroner stentlerin yerleştirilmesine izin veriyor olmasıdır. Piyasada bulunan kıvraklı ve balona monte koroner stent, sıçanların karın aortuna yerlenebilir. Böylece, ek olarak, insanlarda olduğu gibi aynı stent dağıtım prensibi uygulanabilir. Sıçan kullanımının bir başka avantajı, ticari olarak mevcut olan apoE-/- sıçanlar gibi genetiği değiştirilmiş suşların mevcudiyetidir.
Son zamanlarda apolipoprotein E eksikliği olan sıçanların wildtype sıçanlara kıyasla ISR geliştirmeye daha yatkın olup olmadığını değerlendirmek için bu yöntemi kullandık21. Stent implantasyonu uygulanan toplam 42 erkek sıçandan 36 sıçan 28 gün sonra çalışma protokolünü tamamladı (sağkalım oranı = %85.71). Her biri iki sıçan damar kapatma yetmezliği, iç kanama ve stent trombozu nedeniyle öldü. İşleme başarısızlıkları nedeniyle doku ciddi şekilde hasar gördüğü veya bozulduğu için üç hayvandan gelen stentler analiz edilemedi. Büyük olasılıkla, bu testere prosedürü sırasında oldu. Çalışma başlamadan önce bu tekniği birkaç kez gerçekleştirmek için eğitim öneriyoruz.
Kalan 33 sıçanda, insan büyüklüğünde koroner stentler malapposition veya damar yaralanması belirtisi olmadan başarıyla yerleştirildi (Tablo 1). Vücut ağırlığı wildtype apoE+/+ ve apoE-/- sıçanlarda benzerdi (530.1 ± 15.94 g ile 513.6 ± 16.45 g). Homozigöz apoE-/- sıçanlar wildtype apoE+/+ sıçanlara kıyasla belirgin şekilde yüksek neointimal hiperplazi ve ISR geliştirdiler (Şekil 2). Bir apoE-/- arka plan hayvanları ateroskleroz için daha duyarlı hale getirse de, özellikle batı diyeti ile beslendiğinde, sıçanlarımızda öncül aterosklerotik plak gözlemlemedik, çünkü büyük olasılıkla ameliyata kadar batı diyetine başlanmamış ve sonraki dört haftalık gözlem süresi aterosklerotik lezyon gelişimi için çok kısaydı.
Şekil 1: Sıçanların karın aortuna trans-femoral erişim kullanılarak stent implantasyon şeması.
(a)Kan akışının kesilmesinden sonra medial arteriotomi yoluyla bir kılavuz tel sokulur. (b) Kılavuz tel üzerinden uyluk atardamarına kıvrılmış ve balona monte koroner stent sokulur. (c) Balona monte stent, balon şişirme ile konuşlandırıldığı abdominal aorta ilerletilir. Stent bifurkasyonun üzerine ve renal arterlerin altına yerleştirilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Batı diyeti ile beslenen stent implantasyonundan 28 gün sonra Giemsa lekeli abdominal aort temsili fotomikrograflar.
(a) Wildtype apoE+/+ sıçanlar ve (b) Homozigöz apoE-/- sıçanlar. Yüksek güçlü görüntüler: NI = neointima, St = stent payandası, M = tunica ortamı, L = lümen. Şekil Cornelissen, A. ve ark.21'denyapılan değişikliklerle yeniden üretilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| sıçan sayısı | |
| gemi kapatma arızası | 2 |
| iç kanama | 2 |
| stent trombozu | 2 |
| doku işleme hatası | 3 |
| protokolün başarıyla tamamlanması | 33 |
Tablo 1: Trans-femoral erişim kullanılarak sıçan abdominal aortunda stent implantasyonunun sonucu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, insan büyüklüğündeki koroner stentlerin apoE-/- sıçanların karın aortuna implantesini açıklar. Birkaç teknik nokta vurgu etmeye değer. İlk olarak, stent boyutu ile aortun büyüklüğü arasında bir uyumsuzluk önlenmelidir. Çok küçük bir stent yerleştirmek stent malappozasyonuna yol açabilirken, aort için çok büyük bir stent takılması damarın aşırı uzamasına, yırtılmasına ve yaralanmasına neden olabilir. Bu nedenle, çapı 2,0 ila 2,5 mm arasında stent kullanmanızı ve implantasyon basıncını stent üzerinde aşırı uzanmadan önerilen aralıkta tutmanızı öneririz. En uygun implantasyon basıncı genellikle stent üreticisi tarafından verilir. Damar duvarlarının aşırı ince ve yaralanması çok kolay olduğu için femoral damarın ve daha sonra vena kavasının aşırı yaralanmasından kaçınılmalıdır, bu da durdurulması zor kanama ile sonuçlanır. Femoral arter, dikkatle gözlenmesi gereken nabız ile femoral damardan ayırt edilebilir. Bir diğer tuzak ise kılavuz tel ve/veya balon kateter tanıtırken arteriyel yaralanma ve diseksiyon olasılığıdır. Balon kateteri tanıtılırken ipek bağlar kullanılarak sapanlarla femoral arterin distal olarak kontrol edilip gerilmesi ile arteriyel diseksiyon en aza indirilebilir. Dirençle karşılaşıldığında cihazı ilerletmeyi derhal durdurmak zorunludur. Bu durumda, başparmak ve işaret parmağı arasındaki küçük hareketler cihazın yönünü değiştirmeye yardımcı olacaktır. Deneyimlerimize göre, bu en sık kasık bağının hemen altında ve daha da yukarısında, ortak iliak arter çatallanmaya yaklaştığında, buradaki retroperitoneal alanın daha derinlerine inerken. Hayatta kalma oranları sabit olmadan önce operatör için kesinlikle bir öğrenme eğrisi olacaktır ve bazı deneyimlerle ortalama cerrahi süre yaklaşık 20 dakikadır.
İnsanlarda, stentler genellikle ciddi şekilde daraltılmış aterosklerotik arterlere yerleştirilir. Genel olarak apoE eksikliği hayvanları aterosklerotik lezyonların gelişimine daha duyarlı hale getirse de, sıçanlarımızda herhangi bir plak oluşumu gözlemlemedik, çünkü büyük olasılıkla batı diyet beslenmesi stent implantasyonuna kadar başlatılmadı. Aterosklerotik lezyonlarda stent implantasyonu isteniyorsa, batı diyeti doğumdan 6\u20128 hafta sonra başlamalı ve kurban edilene kadar devam etmelidir. Duyarlı suşlarda aterosklerotik lezyonlar, yüksek yağlı diyette 7\u201214 hafta sonra gelişecektir22. Şimdiye kadar, sadece apoE-/- sıçanlar hakkında sınırlı veri yayınlandı. Bununla birlikte, hiçbir çalışmada 20 haftalık 23 yaşından önce spontan lezyon gelişimibildirilmedi. Zhao ve ark. apoE-/- sıçanlarda tipik ateroskleroz gözlendi en az 24 hafta sonra plak yükünde ve lezyon şiddetinde sürekli bir artış ile 72 hafta15'tekurban edilene kadar. Bu nedenle, literatüre göre, sıçanların 14-16 haftalıkken spontan ateroskleroz geliştirmesi olası değildir. Bu nedenle, çalışma için önceden oluşturulmuş aterosklerotik lezyonlarda stent implantasyonu isteniyorsa, yaşlı sıçanların kullanılmasını ve batı diyetine mümkün olduğunca erken başlamanızı öneririz.
Altı hayvan ameliyattan sağ çıkamadı. Klopidogrel verilmesine rağmen iki hayvan stent trombozundan öldü. Stent trombozını azaltmak için, hayvanlar aspirin ile 48 saat boyunca ön tedavi edilebilir veya ameliyat sonrası intraperitoneal enoksaparin enjeksiyonu alabilir. Clopidogrel'in ameliyattan bir gün önce tanıtılması tromboz riskini de azaltabilir, ancak anti-trombotik tedavinin aynı zamanda yoğunlaşması kanama riskini arttırır. Stent trombozu PCI24 , 25,26'nın yaygın bir komplikasyonudur ve birkaç nedeni olabilir. Potansiyel olarak, çalışmamızda, stent trombozu ölümleri yetersiz balon enflasyonu ve eşzamanlı stent malappozisinden kaynaklanmıştır. İnsanlarda stent implantasyonunun aksine, sıçan abdominal aortunda stent dağıtımı anjiyografi ile kontrol altına alınmamıştır. Bu nedenle ameliyat sırasında etkisiz balon enflasyonu tespit edilemez ve düzeltilemez. Benzer şekilde, stent dağıtımı dallanma kabının istemeden tıkanmasına neden olabilir. Floroskopik kontrol altında cerrahi mikroskop kullanılmasını gerektiren ameliyatın yapılmasının mümkün olmadığını göz önünde bulundurarak, en azından ilk birkaç işlem için stentin kesin olarak konuşlandırılmasını doğrulamak için karnın açılmasını öneririz. Stent trombozunun diğer olası nedenleri enflamatuar reaksiyonlar, ciddi yaralanmalar veya damar duvarının diseksiyonları olabilir. Cerrah bu komplikasyonları gösteren klinik belirtilerin farkında olmalı ve hayvanlar gözlem süresi boyunca her gün kontrol edilmelidir.
Sıçan karın aortu, hayvanın ağırlığına bağlı olarak 1,8 mm ila 3,0 mm çapında ölçülür27,28. Daha da küçük femoral ve iliak arterlerden hantal bir stent ilerlemesi intimal yırtılmaya ve damar duvarında hasara neden olabilir. Bu nedenle, bu teknik, aortun damar duvarının aşırı uzamasını veya yaralanmasını önlemek için daha küçük stentlerin (çapı 2,0 ila 2,5 mm arasında) implantasyonu ile sınırlıdır.
Diğer bir sınırlama, işlemden sonra hemostaz elde etmek için femoral arterin bağlanmasının gerekliliğidir ve potansiyel olarak alt ektremite iskemisi riskini doğurmaktadır. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, kollateral arterlerin yanı sıra mikrovaskülür distalinin tıkanıklıklara adaptasyonlarının sıçanlarda femoral arterin ligasyonundan sonra alt ekstremite perfüzyonunu koruyabildiğini göstermiştir29ve sıçanlarımızın hiçbiri gözlem süresi boyunca alt ekstremite iskemisinin klinik belirtilerini göstermedi. Yine de, araştırmacılar bu potansiyel riskin farkında olmalıdır, çünkü uzuv iskemisi sadece ameliyat sonrası ölümün potansiyel bir nedenini temsil etmekle kalmaz, aynı zamanda potansiyel olarak sistemik bir inflamatuar reaksiyona neden olabilir ve sonuçları potansiyel olarak önyargılı hale getirebilir.
Genel olarak sıçanlar uygun maliyetli bir hayvan modeli olsa da, genetiği değiştirilmiş apoE-/- sıçanların kullanımı maliyeti arttırır. Başka bir sınırlama, sıçanlarda aterosklerotik plakların gelişmesinin nispeten uzun sürmesidir. Ayrıca, aort ve koroner arterler arasında daha yakından ilgiyi hak eden bazı önemli hemodinamik farklılıklar vardır. Kesme stresi aortta koronerlere göre daha yüksektir ve türbülanslı kan akışına neden olan çatallanmalar yoktur. Bu, intimal hiperplazi gelişimini ve restenozun boyutunu azaltır.
Restenoz, koroner stentlerin uzun süreli başarısını sınırlayan başlıca faktörlerden biridir. Restenozun patofizyolojisini incelemek için her biri kendi avantajlarını ve eksikliklerini içeren çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Diğer hayvan modellerine kıyasla, sıçanlar yüksek verim, kullanım ve barınma kolaylığı, tekrarlanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajını elinde tutarken, aynı zamanda insan büyüklüğünde koroner stentlerin implantasyonuna izin verir. Sıçanlarda abdominal aort stentinginin ilk protokolü Langeveld ve ark.11tarafından bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu model, kan akışının geçici bir kesintiye uğramasını sağlamak için aortun fiziksel bir daralması ile ilişkili olan stenti tanıtmak için bir trans-abdominal erişim gerektirir. Ortaya çıkan manipülasyon ve damar hasarı potansiyel olarak enflamatuar reaksiyonlara neden olabilir, bu da sadece komplikasyonlara yol açmayabilir, aynı zamanda isr12'yi de telaffuz edebilir. Daha sonra, Oyamada ve arkadaşları, stentleri ortak iliak arter12'dengeçirerek protokolü değiştirdi. İki farklı yaklaşım (trans-aort ve trans-iliak arter) arasındaki sağkalım oranını karşılaştırdılar ve trans-abdominal olarak konuşlandırılmış stentli hayvanlarda önemli ölçüde daha yüksek bir ölüm oranı buldular (%57'ye karşı %11, p < 0.05). Sıçanlar en sık karın aortunda meydana geldiğinde felaket olan kesi / dikiş bölgesinde trombozdan öldü12. Travmayı daha da azaltarak ve insanlarda implantasyon tekniğini daha yakından taklit ederek, stenti tanıtmak için trans-femoral erişim kullandık ve% 14'lük bir ölüm oranı bildirdik. Her biri iki sıçan damar kapatma yetmezliği, iç kanama ve stent trombozu nedeniyle öldü. Bununla birlikte, daha yeni çalışmalar, trans-aort erişimi30 , 31ile bile sıçan karın aortunda stent implantasyonundan sonra ölüm oranlarının% 6'ya kadar düşük olduğunu bildirmektedir. Yine de, magnezyum stentlerin sıçanaortunaimplante edildikten sonra Nevzati ve ark. Serilerinde ne damar kapatma yetmezliği ne de iç kanama bildirilirken, sıçanların % 10,5'inde stent trombozu belirgindi30. Öte yandan, Aquarius ve arkadaşları yan duvar anevrizmalarını akış diverterleri ile tedavi ettikten sonra herhangi bir stent trombozu bildirmedi, ancak bu çalışmada daha ince stent payanda cihazları kullanıldı ve sıçanlara çift antiplatelet tedavisi uygulandı31. Stent trombozu riski ile kanama riski arasında bir denge kurmaya çalıştık ve çalışmamızda clopidogrel ve heparin uyguladık. Bu, sıçanların% 4.76'sında meydana gelen stent trombozu riskini azaltmış olsa da, iç kanama veya damar kapatma yetmezliği nedeniyle nispeten daha yüksek kanama riskinin (sıçanların% 9.52'si) nedeni de olabilir.
Burada, sıçan karın aortuna ilaçla geçen bir stent implantasyonunu gösterdik, ancak aynı şekilde bu yöntem, çıplak metal stentler veya biyoürorbable vasküler iskeleler gibi diğer benzer büyüklükteki stent cihazlarının değerlendirilmesi için kullanılabilir.
Özetle, apolipoprotein E-eksik sıçanların abdominal aort stent implantasyonundan sonra ISR'yi araştırmak için güvenilir ve tekrarlanabilir bir modeldir. Model, aterosklerotik lezyonların kendiliğinden gelişme olasılığı daha yüksek olan yaşlı sıçanların kullanımına ve insan koroner müdahalesi için kullanılan diğer cihazların test edilmesiyle genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bayan Angela Freund'a gömme ve slayt üretimindeki paha biçilmez teknik yardımı için teşekkür ederiz. Ayrıca Laboratuvar Hayvan Bilimi ve Deneysel Cerrahi Enstitüsü'ndeki Bay Tadeusz Stopinski'ye veterinerlik çalışmalarına yaptığı anlayışlı yardımlar için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
- Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
- Virmani, R., Farb, A.
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
- Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
- Knowles, J. W., Maeda, N.
- Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744 (2015).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
- Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9 (2011).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
- Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
- Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13 (2014).
- Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950 (2019).
- Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
- Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18 (2004).
- Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541 (2019).
- Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
- Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835 (2018).
- Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
- Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
- Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
- Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
- Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359 (2017).
- Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).
