Summary
Questo protocollo descrive l'impianto di stent coronari umani nell'aorta addominale dei ratti con uno sfondo apoE-/- utilizzando un accesso trans-femorale. Rispetto ad altri modelli animali, i modelli murini portano i vantaggi di alta produttività, riproducibilità, facilità di movimentazione e alloggiamento e un'ampia disponibilità di marcatori molecolari.
Abstract
L'intervento coronarica percutaneo (PCI), combinato con l'impiego di uno stent coronarica, rappresenta il gold standard nel trattamento interventico della malattia coronarica. La restenosi in-stent (ISR) è determinata da un'eccessiva proliferazione del tessuto neointimico all'interno dello stent e limita il successo a lungo termine degli stent. Una varietà di modelli animali sono stati utilizzati per chiarire i processi fisiopatologici alla base della restenosi in-stent (ISR), con i modelli coronarica suina e l'arteria iliaca del coniglio che sono i più frequentemente utilizzati. I modelli murini offrono i vantaggi di un'elevata produttività, facilità di movimentazione e alloggiamento, riproducibilità e un'ampia disponibilità di marcatori molecolari. Il modello di topo carente di apolipoproteina E (apoE-/- ) è stato ampiamente utilizzato per studiare le malattie cardiovascolari. Tuttavia, gli stent devono essere miniaturizzati per essere impiantati nei topi, comportando importanti cambiamenti delle loro proprietà meccaniche e (potenzialmente) biologiche. L'uso di ratti apoE-/- può superare queste carenze in quanto i ratti apoE-/- consentono la valutazione degli stent coronari delle dimensioni dell'uomo e allo stesso tempo forniscono un fenotipo aterogenico. Questo li rende un modello eccellente e affidabile per indagare ISR dopo l'impianto stent. Qui descriviamo, in dettaglio, l'impianto di stent coronari umani disponibili in commercio nell'aorta addominale dei ratti con uno sfondo apoE-/- utilizzando un accesso trans-femorale.
Introduction
L'intervento coronarica percutaneo (PCI), combinato con l'impiego di uno stent coronarica, rappresenta il gold standard nel trattamento interventico della malattia coronarica1. Il successo a lungo termine degli stent, tuttavia, può essere limitato dal verificarsi di restenosi in-stent (ISR) determinata da un'eccessiva proliferazione del tessuto neointimico all'interno dello stent2,3. L'ISR può richiedere un nuovo intervento con bypass coronarica o re-PCI. Per lo studio dell'ISR sono stati suggeriti diversi modelli animali, ognuno dei quali presenta vantaggi e carenze. I principali inconvenienti dei modelli di arteria iliaca suina più comunemente usati e del coniglio iliaca, sebbene sviluppino lesioni marcatamente simili all'uomo dopo l'impianto di stent4,5, sono grandi costi animali e abitativi che sollevano difficoltà logistiche soprattutto negli studi a lungo termine, nonché limitazioni nella manipolazione e nelle attrezzature. Inoltre, la disponibilità di anticorpi contro le proteine cellulari di suini e conigli è limitata. D'altra parte, i modelli murini offrono i principali vantaggi di elevata produttività e riproducibilità, nonché facilità di movimentazione, alloggiamento e quindi economicità. Inoltre, è disponibile un numero maggiore di anticorpi. Tuttavia, mentre i topi apolipoproteina E-carenti (apoE-/-) sono stati ampiamente utilizzati per lo studio dell'aterosclerosi6,7,8, non sono adatti allo studio dell'ISR poiché gli stent devono essere miniaturizzati per essere impiantati nei topi, potenzialmente cambiando le proprietà meccaniche degli stent. Inoltre, la parete aortica dei topi misura tra 50 μm nei giovani topi e 85 μm nei vecchitopi 9e gli stent devono essere utilizzati utilizzando livelli di pressione fino a 2 atm, che potrebbero portare alla malapposizione dello stent10. I ratti, tuttavia, consentono l'impianto di stent coronari umani disponibili in commercio e dimostrano un corso di guarigione vascolare simile agli animali più grandi dopo l'impianto di stent aortico, riportato per la prima volta da Langeveld etal. Questa tecnica originariamente richiedeva un accesso trans-addominale, che richiedeva una costrizione fisica dell'aorta per ottenere un'interruzione temporanea del flusso sanguigno. Per evitare la lesione del vaso potenzialmente associata e le reazioni infiammatorie, la tecnica è stata successivamente perfezionata con l'introduzione di un accesso trans-iliaca, che ha inoltre portato a un più alto tasso di sopravvivenza degli animali12.
Poiché i ratti di tipo selvatico non sviluppano lesioni aterosclerotiche13, i ratti apoE-/- sono stati generati utilizzando tecniche di nucleasi come transcription activator-like Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15e Zinc Finger (ZF)16. I ratti ApoE-/- sono disponibili in commercio dal 2011. Fornendo uno sfondo aterogenico, i ratti apoE-/- consentono una valutazione più realistica degli stent coronari a misura d'uomo, in particolare per quanto riguarda l'ISR.
Nel presente documento, descriviamo il metodo attraverso la via di accesso transfemorale e utilizzando uno stent di eluizione del farmaco cobalto-cromo (DES) a punto sottile disponibile in commercio, tuttavia, può anche essere applicato per lo studio di altri tipi di stent, come stt bare metal (BMS) o stent biodegradabili.
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Protocol
Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la legge tedesca sul benessere degli animali (TSchG) e la direttiva 2010/63/UE relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. L'approvazione ufficiale di questo studio è stata concessa dal Governmental Animal Care and Use Committee (Protocollo n.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germania). Il protocollo di studio è conforme alla Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio. Il trattamento postoperatorio del dolore si basa sulle raccomandazioni della Società tedesca per le scienze animali di laboratorio (GV-SOLAS) e dell'Iniziativa veterinaria per la terapia del dolore.
1. Tecniche di base e procedure comuni
- Utilizzare ratti omozigoti apoE-/- Sprague-Dawley. Identificare il genotipo di ciascun animale utilizzando metodi standard17.
- Mantenere gli animali in condizioni identiche (21 °C ± 2 °C, 60% ± 5% di umidità e un ciclo chiaro / scuro di 12 ore) e garantire il libero accesso all'acqua e al cibo.
- Eseguire tutte le procedure in condizioni pulite ma nonsterili.
- Una volta che il topo è anestetizzato, eseguire tutte le procedure al microscopio chirurgico con un ingrandimento di 16x.
- Utilizzare tamponi di cotone per l'emostasi di compressione. I tamponi di garza (5 cm x 5 cm) imbevuti di soluzione ringer allattata sono utili per mantenere l'inguine umido.
- Seguire le normative sullo smaltimento dei rifiuti per smaltire i materiali usati.
2. Preparativi prima dell'intervento chirurgico
- Preparare i farmaci veterinari prima di iniziare l'operazione. Conservare tutte le soluzioni a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
- Trenta minuti prima della procedura, somministrare 0,03-0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea.
- Anestetizzare il ratto con un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di peso corporeo (BW) (S)-chetamina e 8 mg/kg di xilazina BW.
- Valutare il peso del topo utilizzando una bilancia.
- Posizionare il topo su una pastiglia riscaldante e fissare gli arti superiore e inferiore utilizzando del nastro medico. Posizionare il topo con l'arto posteriore sinistro completamente esteso e il più in linea possibile con la colonna vertebrale in modo da creare una linea retta tra arteria femorale e aorta. Ciò faciliterà l'avanzamento dello stent montato su palloncino attraverso la biforcazione aortica.
- Mantenere l'anestesia con inalazione di isoflurane 1,5 vol% nel 97,5% di ossigeno ad una portata di 2 L/min.
NOTA: Lasciare respirare spontaneamente il topo, senza intubazione. - Applicare un unguento per gli occhi per prevenire danni agli occhi durante l'incoscienza.
- Radere la pelliccia dall'inguine e dall'area inferiore dell'addome del ratto e sterilizzare la pelle corrispondente con una soluzione di povidone-iodio.
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, verificare un'adeguata profondità dell'anestesia pizzicando la punta della coda e il tessuto interdidigitale.
3. Chirurgia
- Effettuare un'incisione mediale di ~ 0,5 \u20121 cm nell'inguine sinistro per aprire la pelle e la fascia sottostante.
- Sezionare e sondare senza mezzi termini nelle profondità fino a quando non è possibile identificare l'arteria femorale sinistra pulsante.
- Usando forcep molto fini, preparare l'arteria femorale rimuovendo delicatamente il tessuto connettivo circostante. Fai attenzione a danneggiare né il nervo femorale né la vena femorale, che è mediale per l'arteria.
- Preparare circa 1 cm dell'arteria femorale. Mettere con cura la punta delle forcep sotto il vaso per sollevarla delicatamente.
- Filettare pezzi di sutura di seta 4-0 sotto le parti distale e prossimale dell'arteria e formare io. Bloccare le estremità di ciascuna delle due irse del filo tra i rami di un morsetto chirurgico. Utilizzare i morsetti chirurgici per controllare l'arteria. Allungare delicatamente e sollevare le indovamenti per interrompere temporaneamente il flusso sanguigno.
NOTA: Lavorare velocemente per evitare un laccio emostatico prolungato che può causare danni ai tessuti. - Usando micro forbici affilate, eseguire un'arteriotomia nel mezzo dell'arteria femorale.
- Introdurre un filo guida attraverso l'arteriotomia. Quando si raggiunge l'io del filo prossimale, rilasciare la tensione del filo spostando il morsetto chirurgico e far avanzare ulteriormente il filo guida verso l'aorta addominale.
NOTA: Tagliare il filo guida utilizzando una fresa a filo per facilitare la movimentazione. - Posizionare l'estremità prossimale del filo guida tra il diaframma e le arterie renali.
NOTA: L'avanzamento troppo lontano del filo guida comporta il rischio di lesioni aortiche o cardiache. Si consiglia di aprire l'addome per garantire un adeguato posizionamento del filo guida e dello stent almeno per i primi diversi animali. - Introdurre uno stent coronare crimpato e montato su palloncino che misura 2,25 mm x 8 mm (max. 2,5 mm x 8 mm) sul filo guida nell'arteria femorale e avanzare verso l'aorta addominale.
- Posizionare lo stent appena sopra la biforcazione aortica ma sotto le arterie renali. Distribuire lo stent gonfiando il catetere a palloncino a 12 atm per 15 s utilizzando un sistema di siringhe di gonfiaggio.
- Sgonfiare il catetere a palloncino e mantenere una pressione negativa secondo le raccomandazioni del produttore per lo stent in uso.
- Ritirare lentamente il catetere sgonfio lasciando lo stent in posizione.
- Poco prima di esettare il catetere, creare tensione sul ciclo del filo sopra l'incisione con il morsetto chirurgico per interrompere nuovamente il flusso sanguigno. Quindi rimuovere il catetere a palloncino e ligare direttamente il vaso prossimamente.
- Legare i cicli prossimali e distale del filo per legare l'arteria femorale e confermare un'adeguata emostasi dell'arteriotomia. Le arterie collaterali garantiranno un'ulteriore perfusione all'arto.
- Chiudi il muscolo sovrascrivere l'arteria e l'incisione cutanea usando 10-0 suture non riassorbibili.
4. Cura degli animali dopo l'impianto di stent
- Subito dopo l'operazione, lasciare recuperare il ratto per 60 minuti in una speciale gabbia per unità di terapia intensiva con aria riscaldata (30\u201235 °C) e un apporto di ossigeno.
- Guarda attentamente gli animali fino a completo recupero. Successivamente, spostare i ratti in una gabbia normale. Fornire accesso ad libitum all'acqua e al cibo.
- Somministrare analgesia postoperatoria ogni 6-12 ore con 0,03-0,05 mg/kg di buprenorfina (s.c., in NaCl da 500μl) per un totale di 72 ore in fase di valutazione clinica.
- Far miscelare il cibo con clopidogrel (15 mg/kg) per evitare la trombosi dello stent impiantato.
- Per migliorare le condizioni ipercolesterolemiche e la formazione della placca, iniziare l'alimentazione della dieta occidentale a 6\u20128 settimane dopo la nascita e continuare fino all'eutanasia. Se lo si desidera, una coorte di animali alimentati con normale chow di ratto può servire da controllo.
5. Raccolta e lavorazione dei tessuti
- Prima di iniziare l'espianto del tessuto nel punto di tempo designato, eutanasiare l'animale secondo le linee guida della IACUC. Raccogliere l'aorta stenta per l'analisi istologica alla fine del periodo di osservazione.
- Aprire l'addome con un'incisione della linea mediana e rimuovere il segmento stentato dell'aorta e le parti adiacenti non stente dell'aorta, misurando 0,5 cm ciascuna.
- Mettere il tessuto in una soluzione di formalina tamponata al 4% per 24 ore per la fissazione.
- Incorporare il tessuto arterioso stentato nella plastica ed eseguire colorazioni istologiche e immunoistochimiche secondo i protocolli standard18,19.
6. Analisi istomorfometrica
- Eseguire l'analisi istomorfometrica delle sezioni sequenziali della parte prossimale, centrale e distale dell'aorta stentata per mezzo di un microscopio collegato a un computer con un software di analisi delle immagini appropriato.
- Traccia i contorni della lamina elastica esterna (EEL, tra adventitia e media), lamina elastica interna (IEL, tra media e neointima) e lume con una tavoletta grafica da disegno. Da questi valori, calcolare l'area EEL, l'area IEL e l'area lume con il software.
- Calcolare la percentuale di restenosi intersezionale in-stent (ISR):
- Calcolare l'area neointimica totale (Ai):
- Misurare lo spessore neointimico (NIT) su ogni puntone stent come distanza tra puntone e lume. Misurare le NTI tra i montanti stent come distanza tra IEL e lume.
NOTA: In alternativa, calcolare le NTI come
dove PL e PIEL sono il perimetro di lume e lamina elastica interna, rispettivamente20. - Eseguire analisi aggiuntive in base alle esigenze dello studio.
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Representative Results
Questo protocollo descrive l'impianto di stent nell'aorta addominale dei ratti utilizzando una via di accesso trans-femorale (Figura 1). Il primo punto centrale di questo modello animale è che consente il dispiegamento di stent coronari a misura d'uomo. Uno stent coronare crimpato e montato su palloncino disponibile in commercio può essere posizionato nell'aorta addominale dei ratti. Così, inoltre, può essere applicato lo stesso principio di distribuzione dello stent come negli esseri umani. Un altro vantaggio dell'uso dei ratti è la disponibilità di ceppi geneticamente modificati, come i ratti apoE-/- che sono disponibili in commercio.
Recentemente abbiamo utilizzato questo metodo per valutare se i ratti carenti di Epolipoproteina sono più inclini a sviluppare ISR rispetto ai ratti di tipo selvatico21. Su un totale di 42 ratti maschi sottoposti a impianto stent, 36 ratti hanno completato il protocollo di studio dopo 28 giorni (tasso di sopravvivenza = 85,71%). Due ratti morirono ciascuno per un guasto alla chiusura della nave, un'emorragia interna e trombosi stent. Gli stent di tre animali non potevano essere analizzati perché il tessuto era gravemente danneggiato o interrotto a causa di guasti alla lavorazione. Molto probabilmente, questo è accaduto durante la procedura di segatura. Si consiglia di allenarsi per eseguire questa tecnica più volte prima dell'inizio dello studio.
Nei restanti 33 ratti, gli stent coronari a misura d'uomo sono stati dispiegati con successo senza segni di malapposizione o lesioni alla nave(tabella 1). Il peso corporeo era simile nei ratti apoE+/+ e apoE-/- (530,1 ± 15,94 g contro 513,6 ± 16,45 g). I ratti homozygous apoE-/- hanno sviluppato iperplasia neointimica marcatamente elevata e ISR rispetto ai ratti apoE+/+ di tipo selvatico (Figura 2). Sebbene uno sfondo apoE-/- renda gli animali più suscettibili all'aterosclerosi, specialmente se alimentati con dieta occidentale, non abbiamo osservato placche aterosclerotiche anteriori nei nostri ratti, molto probabilmente perché una dieta occidentale non è stata avviata fino all'intervento chirurgico e il successivo periodo di osservazione di quattro settimane è stato troppo breve per lo sviluppo della lesione aterosclerotica.
Figura 1: Schema dell'impianto di stent nell'aorta addominale dei ratti utilizzando un accesso trans-femorale.
(a) Dopo l'interruzione del flusso sanguigno, viene introdotto un filo guida attraverso un'arteriotomia mediale. b)Uno stent coronare crimpato e montato su palloncino viene introdotto sul filo guida nell'arteria femorale. (e) Lo stent montato su palloncino è avanzato verso l'aorta addominale, dove viene utilizzato dall'inflazione del palloncino. Lo stent deve essere posizionato sopra la biforcazione e sotto le arterie renali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fotomicrografi rappresentativi dell'aorta addominale macchiata di Giemsa a 28 giorni dall'impianto di stent nella dieta occidentale alimentata.
(a) Ratti apoE apoE+/+ di tipo selvatico e (b) Ratti omozigoti apoE-/- . Immagini ad alta potenza: NI = neointima, St = stent strut, M = tunica media, L = lumen. La figura è stata riprodotta con modifiche di Cornelissen, A. etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| numero di ratti | |
| guasto chiusura nave | 2 |
| emorragia interna | 2 |
| trombosi stent | 2 |
| insufficienza di lavorazione dei tessuti | 3 |
| completamento del protocollo | 33 |
Tabella 1: Risultato dell'impianto di stent nell'aorta addominale del ratto mediante accesso trans-femorale.
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Discussion
Questo protocollo descrive l'impianto di stent coronari a misura d'uomo nell'aorta addominale dei ratti apoE-/- . Vale la pena sottolineare diversi punti tecnici. In primo luogo, si dovrebbe evitare una mancata corrispondenza tra la dimensione dello stent e la dimensione dell'aorta. Posizionare uno stent troppo piccolo può portare a malapposition stent, mentre l'impianto di uno stent troppo grande per l'aorta può causare sovraccarico, strappo e lesioni del vaso. Pertanto, si consiglia di utilizzare stent tra 2,0 e 2,5 mm di diametro e di mantenere la pressione di impianto entro l'intervallo raccomandato senza allungare eccessivamente lo stent. La pressione di impianto più adatta è solitamente data dal produttore di stent. L'eccesso di lesione della vena femorale e successivamente della vena cava dovrebbe essere evitato perché le pareti del vaso sono estremamente sottili e molto facili da ferire, con conseguente sanguinamento difficile da fermare. L'arteria femorale è distinguibile dalla vena femorale per pulsazione, che dovrebbe essere attentamente osservata. Un'altra insidia è la possibilità di lesioni arteriosa e dissezione quando si introduce il filo guida e / o il catetere a palloncino. La dissezione arteriosa può essere ridotta al minimo controllando e allungando l'arteria femorale distally con fioche usando cravatte di seta mentre si introduce il catetere a palloncino. È imperativo interrompere immediatamente l'avanzamento del dispositivo quando si incontra resistenza. In questo caso, piccoli movimenti tra pollice e indice aiuteranno a cambiare la direzione del dispositivo. Nella nostra esperienza, questo è più frequentemente il caso appena sotto il legamento inguinale e più in alto, quando l'arteria iliaca comune si avvicina alla biforcazione, mentre scende più in profondità nello spazio retroperitoneale qui. Ci sarà sicuramente una curva di apprendimento per l'operatore prima che i tassi di sopravvivenza siano stabili e con una certa esperienza, il tempo chirurgico medio è di circa 20 minuti.
Negli esseri umani, gli stent sono solitamente impiantati in arterie aterosclerotiche gravemente ristrette. Sebbene la carenza di apoE in generale renda gli animali più suscettibili allo sviluppo di lesioni aterosclerotiche, non abbiamo osservato alcuna formazione di placca nei nostri ratti, molto probabilmente perché l'alimentazione della dieta occidentale non è stata avviata fino all'impianto di stent. Se si desidera impianto stent in lesioni aterosclerotiche, la dieta occidentale dovrebbe iniziare a 6 \u20128 settimane dopo la nascita e continuare fino al sacrificio. Le lesioni aterosclerotiche nei ceppi sensibili si svilupperanno dopo 7\u201214 settimane sulla dieta ricca di grassi22. Finora sono stati pubblicati solo dati limitati sui ratti apoE-/-. Tuttavia, nessuno studio ha riportato uno sviluppo spontaneo della lesione prima dell'età di 20settimane 23. ha osservato l'aterosclerosi tipica nei ratti apoE-/- dopo almeno 24 settimane con un continuo aumento del carico della placca e della gravità della lesione fino al sacrificio a 72 settimane15. Così, secondo la letteratura, è improbabile che i ratti sviluppino aterosclerosi spontanea a 14-16 settimane di età. Pertanto, si consiglia di utilizzare ratti più anziani e di iniziare la dieta occidentale il prima possibile se si desidera impianto di stent in lesioni aterosclerotiche pre-formate per lo studio.
Sei animali non sopravvissero all'operazione. Due animali sono morti per trombosi stent nonostante la somministrazione di clopidogrel. Per ridurre la trombosi stent, gli animali possono essere pretrattati per 48 ore con aspirina o ricevere un'iniezione intraperitoneale di enoxaparina post-operatoria. L'introduzione del clopidogrel un giorno prima dell'intervento chirurgico potrebbe anche ridurre il rischio di trombosi, ma qualsiasi intensificazione della terapia anti-trombotica allo stesso tempo aumenta il rischio di emorragia. La trombosi stent è una complicazione comune di PCI24,25,26 e può avere diversi motivi. Potenzialmente, nel nostro studio, le morti per trombosi stent sono il risultato di un'insufficiente inflazione del palloncino e di una sovrapposizione simultanea di stent. A differenza dell'impianto di stent nell'uomo, il dispiegamento di stent nell'aorta addominale del ratto non era controllato dall'angiografia. Pertanto, l'inflazione inefficace del palloncino non può essere rilevata e corretta durante l'intervento chirurgico. Allo stesso modo, il dispiegamento di stent potrebbe portare a un'occlusione involontaria di una nave ramificata. Considerando che non è possibile eseguire l'intervento chirurgico che richiede l'uso di un microscopio chirurgico sotto controllo fluoroscopico, si consiglia di aprire l'addome per confermare l'impiego preciso dello stent, almeno per le prime diverse procedure. Altre potenziali cause di trombosi stent potrebbero essere reazioni infiammatorie, lesioni gravi o dissezioni della parete del vaso. Il chirurgo deve essere a conoscenza di eventuali segni clinici che indichino queste complicazioni e gli animali devono essere ispezionati ogni giorno durante tutto il periodo di osservazione.
L'aorta addominale del ratto misura tra 1,8 mm e 3,0 mm di diametro, a seconda delpeso dell'animale 27,28. L'avanzamento di uno stent ingombrante attraverso le arterie femorale e iliaca ancora più piccole può causare lacrimazione intimale e danni alla parete del vaso. Pertanto, questa tecnica è limitata all'impianto di stent più piccoli (tra 2,0 e 2,5 mm di diametro) per evitare sovraccariche o lesioni della parete del vaso dell'aorta.
Un'altra limitazione è la necessità di legare l'arteria femorale al fine di ottenere l'emostasi dopo la procedura, potenzialmente sopportando il rischio di ischemia degli arti inferiori. Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che le arterie collaterali e gli adattamenti della microvascolarizzazione distale all'occlusione sono in grado di mantenere la perfusione degli arti inferiori dopo la legatura dell'arteria femorale neiratti 29e nessuno dei nostri ratti ha mostrato segni clinici di ischemia degli arti inferiori durante il periodo di osservazione. Tuttavia, gli investigatori dovrebbero essere consapevoli di questo potenziale rischio, poiché l'ischemia degli arti non solo rappresenta una potenziale causa di morte post-operatoria, ma può anche potenzialmente indurre una reazione infiammatoria sistemica, potenzialmente biasing dei risultati.
Mentre i ratti in generale sono un modello animale economico, l'uso di ratti apoEgeneticamente modificati aumenta il costo. Un'altra limitazione è che ci vuole un tempo relativamente lungo fino a quando le placche aterosclerotiche non si sono sviluppate nei ratti. Inoltre, ci sono alcune importanti differenze emodinamiche tra l'aorta e le arterie coronarie che meritano maggiore attenzione. Lo stress da taglio è più alto nell'aorta rispetto alle coronarie e sono assenti biforcazioni che causano un flusso sanguigno turbolento. Ciò diminuisce lo sviluppo dell'iperplasia intimale e l'estensione della restenosi.
La restenosi è uno dei principali fattori che limitano il successo a lungo termine degli stent coronarica. Una varietà di modelli animali sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia della restenosi, ognuno con i propri vantaggi e carenze. Rispetto ad altri modelli animali, i ratti contengono il vantaggio di un'elevata produttività, una facilità di movimentazione e alloggiamento, riproducibilità e rapporto costo-efficacia, consentendo allo stesso tempo l'impianto di stent coronari a misura d'uomo. Il primo protocollo di stenting di aorta addominale nei ratti è stato riportato da Langeveld etal. Questo modello, tuttavia, richiede un accesso trans-addominale per introdurre lo stent, che è associato a una costrizione fisica dell'aorta per ottenere un'interruzione temporanea del flusso sanguigno. La manipolazione risultante e la lesione del vaso potrebbero potenzialmente causare reazioni infiammatorie, che potrebbero non solo portare a complicazioni, ma anche a pronunciare ISR12. Più tardi, Oyamada et al. Hanno confrontato il tasso di sopravvivenza tra i due diversi approcci (arteria trans-aorta contro trans-iliaca) e hanno riscontrato un tasso di mortalità significativamente più elevato negli animali con stent distribuiti trans-addominalmente (57% contro 11%, p < 0,05). I ratti più comunemente morti per trombosi nel sito di incisione / sutura, che è catastrofico quando si verificano nell'aorta addominale12. Riducendo ulteriormente i traumi e imitando più da vicino la tecnica di impianto nell'uomo, abbiamo usato un accesso trans-femorale per introdurre lo stent e abbiamo riportato un tasso di mortalità del 14%. Due ratti morirono ciascuno per un guasto alla chiusura della nave, un'emorragia interna e trombosi stent. Studi più recenti, tuttavia, hanno riportato tassi di mortalità fino al 6% dopo l'impianto di stent nell'aorta addominale del ratto anche con l'accesso trans-aortico30,31. Tuttavia, il tasso combinato di morbilità e mortalità è stato del 13,4%, in uno studio di Nevzati et al. Mentre né il guasto alla chiusura della nave né l'emorragia interna sono stati segnalati nella loro serie, la trombosi dello stent era evidente nel 10,5%dei ratti 30. D'altra parte, Aquarius et al. Abbiamo cercato di trovare un equilibrio tra il rischio di trombosi stent e il rischio di sanguinamento e somministrato clopidogrel ed eparina nel nostro studio. Mentre questo potrebbe aver ridotto il rischio di trombosi stent, che si è verificato nel 4,76% dei ratti, potrebbe anche essere stato la causa del rischio relativamente più elevato di sanguinamento (9,52% dei ratti), a causa di emorragia interna o fallimento della chiusura dei vasi.
Qui, abbiamo dimostrato l'impianto di uno stent che eluizza il farmaco nell'aorta addominale del ratto, ma allo stesso modo questo metodo può essere utilizzato per la valutazione di altri dispositivi stent di dimensioni simili, ad esempio stent bare metal o impalcature vascolari bioresorbibili.
In sintesi, lo stenting aorta addominale dei ratti apolipoproteina E carenti è un modello affidabile e riproducibile per indagare l'ISR dopo l'impianto di stent. Il modello può essere esteso all'uso di ratti più anziani, che hanno maggiori probabilità di sviluppare lesioni aterosclerotiche spontaneamente, e testando altri dispositivi utilizzati per l'intervento coronarica umano.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la signora Angela Freund per la sua preziosa assistenza tecnica nella produzione di incorporamenti e diapositive. Ringraziamo anche Tadeusz Stopinski presso l'Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery per il suo perspicoso aiuto nel lavoro veterinario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
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