Summary
Denne protokol beskriver implantationen af menneskelige koronar stenter i abdominal aorta af rotter med en apoE-/- baggrund ved hjælp af en trans-femoral adgang. Sammenlignet med andre dyremodeller bærer murinmodeller fordelene ved høj gennemløb, reproducerbarhed, nem håndtering og boliger og en bred tilgængelighed af molekylære markører.
Abstract
Perkutan koronar intervention (PCI), kombineret med indsættelsen af en koronar stent, repræsenterer guldstandarden i interventionel behandling af koronararteriesygdom. In-stent restenosis (ISR) bestemmes af en overdreven spredning af neointimalt væv i stenten og begrænser stenternes langsigtede succes. En række dyremodeller er blevet brugt til at belyse patofysiologiske processer, der ligger til grund for in-stent restenosis (ISR), hvor svin koronar og kanin iliac arterie modeller er de hyppigst anvendte. Murine modeller giver fordelene ved høj gennemløb, nem håndtering og boliger, reproducerbarhed, og en bred tilgængelighed af molekylære markører. Den apolipoprotein E mangelfuld (apoE-/- ) mus model er blevet udbredt til at studere hjerte-kar-sygdomme. Stents skal dog miniaturiseres for at blive implanteret i mus, hvilket indebærer vigtige ændringer af deres mekaniske og (potentielt) biologiske egenskaber. Brugen af apoE-/- rotter kan overvinde disse mangler, da apoE-/- rotter giver mulighed for evaluering af koronarstenter i menneskelig størrelse, samtidig med at de giver en aterogen fænotype. Dette gør dem til en fremragende og pålidelig model til at undersøge ISR efter stentimplantation. Her beskriver vi i detaljer implantationen af kommercielt tilgængelige menneskelige koronarstenter i abdominal aorta af rotter med en apoE-/- baggrund ved hjælp af en trans-femoral adgang.
Introduction
Perkutan koronar intervention (PCI), kombineret med indsættelsen af en koronar stent, repræsenterer guldstandarden i interventionel behandling af koronararteriesygdom1. Stenternes langsigtede succes kan dog begrænses af forekomsten af in-stent restenosis (ISR), der bestemmes af en overdreven spredning af neointimalt væv inden forstenten 2,3. ISR kan kræve en re-intervention enten med kranspulsåren bypass eller re-PCI. En række dyremodeller er blevet foreslået til undersøgelse af ISR, hver af dem med fordele og mangler. De største ulemper ved de mest almindeligt anvendte koronar- og kaninpulsåremodeller, omend udvikling af læsioner, der ligner mennesker markant efter stentimplantation4,5, er store dyre- og boligomkostninger, hvilket bringer logistiske vanskeligheder op, især i langsigtede undersøgelser samt begrænsninger i håndtering og udstyr. Desuden er tilgængeligheden af antistoffer mod cellulære proteiner af svin og kaniner begrænset. På den anden side giver murinemodeller de store fordele ved høj gennemløb og reproducerbarhed samt nem håndtering, boliger og derfor omkostningseffektivitet. Desuden er der et større antal antistoffer til rådighed. Men mens apolipoprotein E-mangelfulde (apoE-/-) mus er blevet bredt anvendt til undersøgelse af åreforkalkning6,7,8, de er uegnede til undersøgelse af ISR som stents skal miniaturiseres at blive implanteret i mus, potentielt ændre stents mekaniske egenskaber. Desuden måler musens aortavæg mellem 50 μm hos unge mus og 85 μm i gamle mus9, og stenter skal indsættes ved hjælp af trykniveauer så lavt som 2 atm, hvilket kan føre til malapposition afstenten 10. Rotter giver imidlertid mulighed for implantation af kommercielt tilgængelige menneskelige koronarstenter og demonstrerer et vaskulært helbredende kursus svarende til større dyr efter aorta stentimplantation, først rapporteret af Langeveld et al.11. Denne teknik krævede oprindeligt en trans-abdominal adgang, hvilket nødvendiggjorde en fysisk indsnævring af aorta for at opnå en midlertidig afbrydelse af blodgennemstrømningen. For at undgå den potentielt tilknyttede fartøjsskade og inflammatoriske reaktioner blev teknikken senere raffineret ved indførelsen af en trans-iliacaadgang, hvilket desuden resulterede i en højere overlevelsesrate for dyrene12.
Da wildtyperoro ikke udvikler aterosklerotiske læsioner13, er der genereret apoE-/- rotter ved hjælp af nukleaseteknikker som Transskription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15og Zinc Finger (ZF)16. ApoE-/- rotter har været kommercielt tilgængelige siden 2011. Med en aterogen baggrund giver apoE-/- rotter mulighed for en mere realistisk vurdering af koronarstents i menneskelig størrelse, især med hensyn til ISR.
Heri beskriver vi metoden via transfemoral adgangsvejen og ved hjælp af en kommercielt tilgængelig tyndstrut kobolt-chrom stof-eluting stent (DES), men det kan også anvendes til undersøgelse af andre stenttyper, såsom bare metalstents (BMS) eller bionedbrydelige stenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene blev udført i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærdslovgivning (TSchG) og direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Den officielle godkendelse af denne undersøgelse blev givet af den statslige komité for dyrepleje og -anvendelse (protokol nr.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Tyskland). Forsøgsprotokollen var i overensstemmelse med vejledningen om pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Postoperativ smertebehandling er baseret på anbefalingerne fra det tyske selskab for laboratoriedyrvidenskab (GV-SOLAS) samt Initiativ Veterinary Pain Therapy.
1. Grundlæggende teknikker og fælles procedurer
- Brug homozygogous apoE-/- Sprague-Dawley rotter. Genotypen for hvert dyr identificeres ved hjælp afstandardmetoder 17.
- Dyrene holdes under identiske forhold (21 °C ± 2 °C, 60 % ± fugtighed på 5 % og en 12 timers lys/mørk cyklus) og der sikres fri adgang til vand og fødevarer.
- Udfør alle procedurer under rene, men ikke-erhvervsmæssige forhold.
- Når rotten er bedøvet, skal du udføre alle procedurer under et kirurgisk mikroskop ved en forstørrelse på 16x.
- Brug vatpinde til kompression hemostase. Gazeprøver (5 cm x 5 cm) gennemblødt med lakeret Ringer-opløsning er nyttige for at holde lysken fugtig.
- Følg reglerne for bortskaffelse af affald for at bortskaffe brugte materialer.
2. Præparater før operationen
- Forbered veterinærlægemidlerne, før operationen påbegyndes. Opbevar alle opløsninger ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- 30 minutter før proceduren gives 0,03-0,05 mg/kg buprenorphin subkutan.
- Bedøve rotten med en intraperitoneal injektion på 100 mg/kg legemsvægt (BW) (S)-ketamin og 8 mg/kg BW xylazin.
- Vurder rottens vægt ved hjælp af en vægt.
- Placer rotten på en varmepude og fastgør over- og underekstremiteterne ved hjælp af medicinsk tape. Placer rotten med venstre bagben fuldt udstrakte og så meget på linje med rygsøjlen som muligt for at skabe en lige linje mellem lårpulsåren og aorta. Dette vil lette fremrykning af ballonmonteret stent gennem aorta bifurcation.
- Ansesi med indånding af 1,5 vol. isofluran i 97,5% ilt ved en strømningshastighed på 2 L/min.
BEMÆRK: Lad rotten trække vejret spontant uden intubation. - Påfør øjensæbning for at forhindre øjenskader under bevidstløshed.
- Barber pelsen fra rottens lyske- og underlivsområde og steriliser den tilsvarende hud med en povidone-jodopløsning.
- Før du starter operationen, skal du kontrollere tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at klemme halespidsen og det interdigitale væv.
3. Kirurgi
- Lav et mediale snit på ~ 0,5 \ u20121 cm i venstre lyske for at åbne huden og den underliggende fascia.
- Stumpt dissekere og sonde i dybet, indtil den pulserende venstre lårarterie kan identificeres.
- Brug meget fine pincet, forberede lårbenet arterie ved forsigtigt at fjerne de omkringliggende bindevæv. Vær omhyggelig med at skade hverken lårbenet nerve eller lårbenet vene, som er mediale til arterien.
- Forbered omkring 1 cm af lårpulsåren. Sæt forsigtigt spidsen af tangen under beholderen for forsigtigt at løfte den.
- Tråd stykker af 4-0 silke sutur under distale og proksimale dele af arterien og form slynger. Klem enderne af hver af de to tråd slynger mellem grenene af en kirurgisk klemme. Brug de kirurgiske klemmer til at styre arterien. Stræk forsigtigt og løft slyngerne for midlertidigt at afbryde blodgennemstrømningen.
BEMÆRK: Arbejd hurtigt for at undgå en langvarig årepresse, som kan føre til vævsskader. - Brug skarpe mikro saks, udføre en arteriotomi i midten af lårpulsåren.
- Indfør en guidetråd gennem arteriotomien. Når du når den proksimale gevindsling, skal du slippe trådens spænding ved at flytte den kirurgiske klemme og rykke styretråden længere mod abdominal aorta.
BEMÆRK: Skær styretråden over ved hjælp af en trådskærer for at lette håndteringen. - Placer den proksimale ende af føringstråden mellem mellemgulvet og nyrearterierne.
BEMÆRK: Hvis føringsledningen for langt fremmes, er der risiko for aorta- eller hjerteskader. Vi anbefaler at åbne maven for at sikre tilstrækkelig placering af føringstråden og stenten i det mindste for de første flere dyr. - Indfør en krympet og ballonmonteret kranspulsstent, der måler 2,25 mm x 8 mm (maks. 2,5 mm x 8 mm) over styretråden ind i lårpulsåren og fremryk den til abdominal aorta.
- Placer stent lige over aorta bifurcation men under nyrearterierne. Stanken sættes op ved at pumpe ballonkateteret op til 12 hæveautomater i 15 s ved hjælp af et pumpesprøjtesystem.
- Tøm ballonkateteret, og hold undertrykket i overensstemmelse med producentens anbefalinger til den stent, der er i brug.
- Træk langsomt det deflaterede kateter tilbage, mens stenten er på plads.
- Lige før du tager kateteret ud, skal du skabe spænding på trådsløjfen over snittet med den kirurgiske klemme for at afbryde blodgennemstrømningen igen. Fjern derefter ballonkateteret, og ligate beholderen direkte.
- Bind proksimale og distale tråd sløjfer til ligate lårbenet arterie og bekræfte tilstrækkelig hemostase af arteriotomi. Sikkerhedsstillelse arterier vil sikre yderligere perfusion til lemmerne.
- Luk musklen overliggende arterien, samt huden snit ved hjælp af 10-0 ikke-resorbable suturer.
4. Dyrepleje efter stentimplantation
- Umiddelbart efter operationen skal rotten komme sig i 60 minutter i et særligt intensivafdelingsbur med opvarmet luft (30\u201235 °C) og en ilttilførsel.
- Hold øje med dyrene omhyggeligt, indtil de er helt genoprettet. Derefter flytte rotterne ind i et normalt bur. Giv ad libitum adgang til vand og mad.
- Der gives postoperativ smertestillende midler hver 6.-12. time med 0,03-0,05 mg/kg buprenorphin (r.c. i 500μl NaCl) i alt 72 timer under klinisk vurdering.
- Få maden blandet med clopidogrel (15 mg/kg) for at undgå trombose i den implanterede stent.
- For at forbedre hypercholesterolemic betingelser og plak dannelse, start vestlige kost fodring på 6 \u20128 uger efter fødslen og fortsætte indtil aktiv dødshjælp. Hvis det ønskes, kan en kohorte af dyr fodret normal rotte chow tjene som kontrol.
5. Indsamling og behandling af væv
- Før du starter vævsudgravningen på det angivne tidspunkt, aflive dyret i henhold til IACUC's retningslinjer. Høst den stenede aorta til histologisk analyse ved afslutningen af observationsperioden.
- Åbn maven ved et midterlinjeindsnit og fjern det stenede segment af aortaen samt tilstødende ikke-stenede dele af aortaen, der måler 0,5 cm hver.
- Placer vævet i en opløsning på 4% buffered formalin i 24 timer til fiksering.
- Indlejre stentet arterielt væv i plast og udføre histologiske og immunohistokemiske farvning i henhold til standardprotokollerne18,19.
6. Histomorfometrisk analyse
- Udfør histomorfometrisk analyse af sekventielle dele af den proksimale, midterste og distale del af den stenede aorta ved hjælp af et mikroskop, der er knyttet til en computer med en passende billedanalysesoftware.
- Spor konturerne af den eksterne elastiske lamina (ÅL, mellem adventitia og medier), intern elastisk lamina (IEL, mellem medier og neointima) og lumen med en grafisk tegnetablet. Ud fra disse værdier skal du beregne ÅL-området, IEL-området og lumen-området med softwaren.
- Beregn procent tværsnitsarealet i stent restenosis (ISR):
- Beregne det samlede neointimale areal (Ai):
- Mål den neointimale tykkelse (NIT) over hver stent spankulere som afstanden mellem spankulere og lumen. Nit måles mellem stentstruterne som afstanden mellem IEL og lumen.
BEMÆRK: Alternativt kan du beregne NIT som
hvor PL og PIEL er lumen og interne elastiske lamina perimeter, henholdsvis20. - Udføre yderligere analyser i henhold til undersøgelsens krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver stentimplantation i rotters abdominale aorta ved hjælp af en trans-femoral adgangsvej (Figur 1). Det første centrale punkt i denne dyremodel er, at den giver mulighed for indsættelse af koronarstents i menneskelig størrelse. En kommercielt tilgængelig krympet og ballonmonteret koronar stent kan placeres i abdominal aorta af rotter. Således kan det samme princip om stentudrulning som hos mennesker anvendes. En anden fordel ved brugen af rotter er tilgængeligheden af genetisk modificerede stammer, såsom apoE-/- rotter, som er kommercielt tilgængelige.
Vi har for nylig anvendt denne metode til at vurdere, om apolipoprotein E-mangelfulde rotter er mere tilbøjelige til at udvikle ISR sammenlignet med wildtype rotter21. Fra i alt 42 hanrotter, der blev implanteret i stent, afsluttede 36 rotter forsøgsprotokollen efter 28 dage (overlevelsesrate = 85,71%). To rotter døde hver af karlukningssvigt, intern blødning og stenttrombose. Stents fra tre dyr kunne ikke analyseres, fordi vævet blev alvorligt beskadiget eller forstyrret på grund af behandlingsfejl. Mest sandsynligt skete dette under savningsproceduren. Vi anbefaler træning til at udføre denne teknik flere gange før undersøgelsens start.
I de resterende 33 rotter blev koronarstenter i menneskestørrelse anvendt uden tegn på malapposition eller fartøjsskade (tabel 1). Kropsvægten var den samme i apoE+/+ og apoE-/- rotter (530,1 ± 15,94 g mod 513,6 ± 16,45 g). Homozygogous apoE-/- rotter udviklede markant forhøjet neointimal hyperplasi og ISR sammenlignet med vilde apoE+/+ rotter(figur 2). Selv om en apoE-/- baggrund gør dyr mere modtagelige for åreforkalkning, især når fodret vestlige kost, har vi ikke observere nogen forskanset aterosklerotiske plaques i vores rotter, sandsynligvis fordi en vestlig kost ikke blev startet før kirurgi og den efterfølgende observation periode på fire uger var for kort til aterosklerotisk læsion udvikling.
Figur 1: Skema over stentimplantationen i rotternes abdominale aorta ved hjælp af trans-femoral adgang.
(a) Efter afbrydelse af blodgennemstrømningen indføres en føringsledning gennem en mediale arteriotomi. b)Der indføres en krympet og ballonmonteret kranspulsåre over styretråden ind i lårpulsåren. (c) Den ballonmonterede stent er avanceret til abdominal aorta, hvor den er indsat ved ballon inflation. Stenten skal placeres over bifurcationen og under nyrearterierne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative fotomikrografer af Giemsa-farvede abdominal aorta 28 dage efter stentimplantation i vestlig kostfodret.
(a) Wildtype apoE+/+ rotter og (b) Homozygous apoE-/- rotter. Billeder med høj effekt: NI = neointima, St = stent spankulere, M = tunica medier, L = lumen. Figur er gengivet med modifikationer fra Cornelissen, A. et al.21. Klik her for at se en større version af dette tal.
| antal rotter | |
| fejl ved lukning af fartøj | 2 |
| intern blødning | 2 |
| stenttrombose | 2 |
| vævsbehandling fiasko | 3 |
| fuldførelse af protokollen | 33 |
Tabel 1: Resultatet af stentimplantation i abdominal aorta hos rotter ved hjælp af trans-femoral adgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver implantationen af koronarstenter i menneskestørrelse i aorta af apoE-/- rotter. Flere tekniske punkter er værd at understrege. For det første bør en uoverensstemmelse mellem stentstørrelsen og størrelsen af aorta undgås. Placering for lille en stank kan føre til stank malapposition, mens implantation af en stank, der er for stor til aorta kan forårsage overstretch, rive, og skade på fartøjet. Derfor anbefaler vi at bruge stenter mellem 2,0 og 2,5 mm i diameter og at holde implantationstrykket inden for det anbefalede interval uden at overbelaste stenten. Det mest egnede implantationstryk gives normalt af stentproducenten. Overskydende skade på lårbenet vene og efterfølgende vena cava bør undgås, fordi fartøjet vægge er meget tynde og meget let at skade, hvilket resulterer i blødning, der er svært at stoppe. Lårpulsåren kan skelnes fra lårbenet vene ved pulsering, som skal overholdes omhyggeligt. En anden faldgrube er muligheden for arteriel skade og dissektion, når du introducerer guidewire og / eller ballon kateter. Arteriel dissektion kan minimeres ved at kontrollere og strække lårpulsåren distally med slynger ved hjælp af silke bånd samtidig indføre ballon kateter. Det er vigtigt straks at stoppe med at fremrykke enheden, når der opstår modstand. I dette tilfælde vil små bevægelser mellem tommelfinger og pegefinger hjælpe med at ændre enhedens retning. Det er vores erfaring, er dette oftest tilfældet lige under lyskeledbånd og længere op, når den fælles iliaca arterie nærmer sig bifurcation, da det ned dybere ind i retroperitoneal rummet her. Der vil helt sikkert være en indlæringskurve for operatøren, før overlevelsesraterne er stabile, og med en vis erfaring er den gennemsnitlige kirurgiske tid ca. 20 min.
Hos mennesker, stents er normalt implanteret i alvorligt indsnævret aterosklerotiske arterier. Selvom apoE-mangel generelt gør dyr mere modtagelige for udvikling af aterosklerotiske læsioner, observerede vi ikke nogen plakdannelse i vores rotter, sandsynligvis fordi vestlig diætfodring ikke blev startet før stentimplantation. Hvis stent implantation i aterosklerotiske læsioner ønskes, vestlige kost bør starte ved 6 \u20128 uger efter fødslen og fortsætte indtil offer. Aterosklerotiske læsioner i modtagelige stammer vil udvikle sig efter 7\u201214 uger på fedtfattig kost22. Indtil videre er der kun offentliggjort begrænsede data om apoE-/- rotter. Ingen undersøgelse rapporterede imidlertid spontan læsionsudvikling før 20 uger23år . Zhao et al. observerede typisk åreforkalkning hos apoE-/- rotter efter mindst 24 uger med en kontinuerlig stigning i plak byrde og læsion sværhedsgrad indtil offer på 72 uger15. Således er det ifølge litteraturen usandsynligt, at rotter ville udvikle spontan åreforkalkning ved 14-16 uger. Derfor anbefaler vi at bruge ældre rotter og at starte vestlig kost så tidligt som muligt, hvis stentimplantation i forformede aterosklerotiske læsioner ønskes til undersøgelsen.
Seks dyr overlevede ikke operationen. To dyr døde af stenttrombose på trods af indgift af clopidogrel. For at reducere stenttrombose kan dyr forbehandles i 48 timer med aspirin eller modtage en intraperitoneal injektion af enoxaparin postoperativt. Indførelse af clopidogrel en dag før operationen kan også reducere risikoen for trombose, men enhver intensivering af den anti-trombotiske behandling på samme tid øger risikoen for blødning. Stent trombose er en almindelig komplikation af PCI24,25,26 og kan have flere grunde. Potentielt, i vores undersøgelse, stent trombose dødsfald skyldtes utilstrækkelig ballon inflation og samtidig stent malapposition. I modsætning til stentimplantation hos mennesker blev stentudrulningen i rotternes abdominale aorta ikke kontrolleret af angiografi. Derfor kan ineffektiv ballon inflation ikke påvises og korrigeres under operationen. På samme måde kan stentudrulning føre til utilsigtet okklusion af et forgreningsfartøj. I betragtning af at det ikke er praktisk muligt at udføre operationen, som kræver brug af et kirurgisk mikroskop under fluoroskopisk kontrol, anbefaler vi at åbne maven for at bekræfte den nøjagtige indsættelse af stenten, i det mindste for de første flere procedurer. Andre potentielle årsager til stenttrombose kan være inflammatoriske reaktioner, alvorlig skade eller dissektioner af karvæggen. Kirurgen skal være opmærksom på eventuelle kliniske tegn, der indikerer disse komplikationer, og dyrene skal inspiceres hver dag i hele observationsperioden.
Rotternes abdominale aorta måler mellem 1,8 mm og 3,0 mm i diameter, afhængigt af dyrets vægt27,28. Fremrykning af en voluminøs stent gennem de endnu mindre lårarterier og iliacaarterier kan forårsage intimal tåre og skade på karvæggen. Derfor er denne teknik begrænset til implantation af mindre stenter (mellem 2,0 og 2,5 mm i diameter) for at undgå overbelastning eller skade på aortaens karvæg.
En anden begrænsning er nødvendigheden af at ligating lårpulsåren for at opnå hemostase efter proceduren, potentielt bærer risikoen for underekstremitet iskæmi. Imidlertid viste tidligere undersøgelser, at følgearterier samt tilpasninger af mikrovasculature distal til okklusionen er i stand til at opretholde underekstremitet perfusion efter ligation af lårarterien hos rotter29, og ingen af vores rotter udviste kliniske tegn på underekstremitetisk iskæmi i observationsperioden. Alligevel bør efterforskerne være opmærksomme på denne potentielle risiko, da limbiskæmi ikke kun repræsenterer en potentiel årsag til postoperativ død, men også potentielt kan fremkalde en systemisk inflammatorisk reaktion, der potentielt biaser resultaterne.
Mens rotter generelt er en omkostningseffektiv dyremodel, øger brugen af genetisk modificeret apoE-/- rotter omkostningerne. En anden begrænsning er, at det tager forholdsvis lang tid, før aterosklerotiske plaques har udviklet sig hos rotter. Desuden er der nogle vigtige hæmodynamiske forskelle mellem aorta og kranspulsårerne, der fortjener større opmærksomhed. Shear stress er højere i aorta i forhold til koronar, og bifurcations forårsager turbulent blodgennemstrømning er fraværende. Dette mindsker udviklingen af intimal hyperplasi og omfanget af restenosis.
Restenosis er en af de vigtigste faktorer, der begrænser koronarstenternes langsigtede succes. En række dyremodeller er blevet brugt til at studere patofysiologien af restenosis, hver med deres egne fordele og mangler. I sammenligning med andre dyremodeller har rotter fordelen ved en høj gennemløb, en let håndtering og boliger, reproducerbarhed samt omkostningseffektivitet, samtidig med at de giver mulighed for implantation af koronarstenter i menneskelig størrelse. Den første protokol om abdominal aorta stenting hos rotter blev rapporteret af Langeveld et al.11. Denne model kræver imidlertid en trans-abdominal adgang til at introducere stenten, som er forbundet med en fysisk indsnævring af aorta for at opnå en midlertidig afbrydelse af blodgennemstrømningen. Den resulterende manipulation og fartøjsskade kan potentielt forårsage inflammatoriske reaktioner, hvilket ikke kun kan føre til komplikationer, men også til udtalt ISR12. Senere ændrede Oyamada et al. protokollen ved at introducere stenten gennem den fælles iliaca arterie12. De sammenlignede overlevelsesraten mellem de to forskellige tilgange (trans-aorta versus trans-iliaca arterie) og fandt en betydeligt højere dødelighed hos dyr med trans-abdominalt indsat stents (57% versus 11%, p < 0,05). Rotter døde oftest af trombose på indsnit / suturstedet, hvilket er katastrofalt, når de forekommer i abdominal aorta12. Yderligere reducere traumer og efterligne implantation teknik hos mennesker tættere, vi brugte en trans-femoral adgang til at indføre stent og rapporterede en dødelighed på 14%. To rotter døde hver af karlukningssvigt, intern blødning og stenttrombose. Nyere undersøgelser, dog rapporteret dødeligheden så lavt som 6% efter stent implantation i rotte abdominal aorta selv med trans-aorta adgang30,31. Alligevel var den kombinerede sygelighed og dødelighed 13,4%, i en undersøgelse af Nevzati et al. efter implantation af magnesiumstents i rotte aorta30. Mens hverken fartøjet lukning fiasko eller intern blødning blev rapporteret i deres serie, stent trombose var tydelig i 10,5% af rotter30. På den anden side, Aquarius et al. ikke rapportere nogen stent trombose efter behandling sidevæg aneurismer med flow diverters, men denne undersøgelse anvendes tyndere stent spankulere enheder, og dobbelt antiplatelet terapi blev administreret tilrotterne 31. Vi forsøgte at finde en balance mellem risikoen for stenttrombose og blødningsrisiko og administrerede clopidogrel og heparin i vores undersøgelse. Selv om dette kunne have reduceret risikoen for stenttrombose, som forekom hos 4,76% af rotterne, kunne det også have været årsagen til den forholdsvis højere risiko for blødning (9,52% af rotter), enten på grund af intern blødning eller karlukningssvigt.
Her demonstrerede vi implantationen af en lægemiddeludtalende stent i rotte abdominal aorta, men ligeledes kan denne metode bruges til vurdering af andre stentanordninger af samme størrelse, for eksempel bare metalstents eller bioresorbable vaskulære stilladser.
Sammenfattende er abdominal aorta stenting af apolipoprotein E-mangelfulde rotter en pålidelig og reproducerbar model til at undersøge ISR efter stentimplantation. Modellen kan udvides til brugen af ældre rotter, som er mere tilbøjelige til at udvikle aterosklerotiske læsioner spontant, og ved at teste andre enheder, der anvendes til menneskelig koronar intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke fru Angela Freund for hendes uvurderlige tekniske bistand med indlejring og diasproduktion. Vi vil også gerne takke Mr. Tadeusz Stopinski på Institute for Laboratory Animal Science &experimental surgery for hans indsigtsfulde hjælp med veterinærarbejdet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
- Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
- Virmani, R., Farb, A.
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
- Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
- Knowles, J. W., Maeda, N.
- Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744 (2015).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
- Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9 (2011).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
- Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
- Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13 (2014).
- Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950 (2019).
- Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
- Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18 (2004).
- Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541 (2019).
- Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
- Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835 (2018).
- Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
- Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
- Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
- Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
- Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359 (2017).
- Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).
