Summary
Detta protokoll beskriver implantationen av mänskliga födans stentar i buken stora kroppskortor av råttor med en apoE-/- bakgrund med hjälp av en trans-femorala tillgång. Jämfört med andra djurmodeller bär murinmodeller fördelarna med hög genomströmning, reproducerbarhet, enkel hantering och hölje och en bred tillgänglighet av molekylära markörer.
Abstract
Perkutan koronar intervention (PCI), i kombination med införandet av en födans stent, representerar guld standarden i interventionell behandling av födans gatan sjukdom. In-stent restenosis (ISR) bestäms av en överdriven spridning av neointimal vävnad inom stent och begränsar den långsiktiga framgången för stent. En mängd olika djurmodeller har använts för att belysa patofysiologiska processer som ligger till grund för in-stent restenosis (ISR), där svinaronon och kanin iliaca arteriell modeller är de vanligaste. Murinmodeller ger fördelarna med hög genomströmning, enkel hantering och hölje, reproducerbarhet och en bred tillgänglighet av molekylära markörer. Apolipoprotein E bristfällig (apoE-/- ) musmodell har använts ofta för att studera hjärt-kärlsjukdomar. Stentar måste dock miniatyriseras för att implanteras i möss, vilket innebär viktiga förändringar av deras mekaniska och (potentiellt) biologiska egenskaper. Användningen av apoE-/- råttor kan övervinna dessa brister som apoE-/- råttor möjliggör utvärdering av humanstora koronarstentar samtidigt som de ger en ateroogen fenotyp. Detta gör dem till en utmärkt och pålitlig modell för att undersöka ISR efter stentimplantation. Här beskriver vi i detalj implantationen av kommersiellt tillgängliga mänskliga kranskärlstentar i buken stora delar av råttor med en apoE-/- bakgrund med hjälp av en trans-femoral åtkomst.
Introduction
Perkutan koronar intervention (PCI), i kombination med införandet av en födans stent, representerar guldstandarden vid interventionell behandling av födans arteriell sjukdom1. Den långsiktiga framgången för stentar kan dock begränsas av förekomsten av in-stent restenosis (ISR) som bestäms av en överdriven spridning av neointimal vävnad inom stent2,3. ISR kan kräva en återingripande antingen med kranskärl bypass eller re-PCI. En mängd olika djurmodeller har föreslagits för studier av ISR, var och en med fördelar och brister. De största nackdelarna med de vanligaste porcine födans och kanin iliaca gatan modeller, även om utveckla skador markant liknar människor efter stent implantation4,5, är stora djur och bostäder kostnader som ger upp logistiska svårigheter särskilt i långsiktiga studier, liksom begränsningar i hantering och utrustning. Dessutom är tillgången på antikroppar mot cellulära proteiner av svin och kaniner begränsad. Å andra sidan ger murinmodeller de stora fördelarna med hög genomströmning och reproducerbarhet, liksom enkel hantering, bostäder och därmed kostnadseffektivitet. Dessutom finns ett högre antal antikroppar tillgängliga. Men medan apolipoprotein E-bristfälliga (apoE-/-) möss har använts i stor utsträckning för studier av åderförkalkning6,7,8, är de olämpliga för studier av ISR eftersom stentar måste miniatyriseras för att implanteras i möss, vilket potentiellt ändrar stenternas mekaniska egenskaper. Dessutom mäter mössens aortavägg mellan 50 μm hos unga möss och 85 μm hos gamla möss9, och stentar måste sättas in med trycknivåer så låga som 2 atm, vilket kan leda till malapposition av stenten10. Råttor tillåter dock implantation av kommersiellt tillgängliga mänskliga koronarstentar och visar en vaskulär helande kurs som liknar större djur efter aorta stent implantation, först rapporterat av Langeveld et al.11. Denna teknik krävde ursprungligen en trans-abdominal tillgång, som nödvändiggjorde en fysisk förträngning av stora kroppskort för att uppnå ett tillfälligt avbrott i blodflödet. För att undvika den potentiellt associerade kärlskadan och inflammatoriska reaktioner förfinades tekniken senare genom införandet av en trans-iliaca åtkomst, vilket dessutom resulterade i en högre överlevnadsgrad för djuren12.
Eftersom vildtypsråttor inte utvecklar atherosklerotiska lesioner13, apoE-/- råttor har genererats med hjälp av nukleastekniker som Transkription Activator-Liknande Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15, och Zinc Finger (ZF)16. ApoE-/- råttor har varit kommersiellt tillgängliga sedan 2011. Med en atherogen bakgrund möjliggör apoE-/- råttor en mer realistisk utvärdering av koronarstentar i mänsklig storlek, särskilt när det gäller ISR.
Häri beskriver vi metoden via transfemoral åtkomstväg och med hjälp av en kommersiellt tillgänglig tunn-strut kobolt-krom drog-eluting stent (DES), men det kan också tillämpas för studier av andra stent typer, såsom bare metal stents (BMS) eller biologiskt nedbrytbara stentar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöken utfördes i enlighet med den tyska djurskyddslagen (TSchG) och direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Det officiella godkännandet för denna studie beviljades av den statliga kommittén för djurs vård och användning (protokoll nr: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Tyskland). Studieprotokollet följde vägledningen för vård och användning av försöksdjur. Postoperativ smärtbehandling baseras på rekommendationerna från det tyska samhället för laboratoriedjurvetenskap (GV-SOLAS) samt Initiative Veterinary Pain Therapy.
1. Grundläggande tekniker och gemensamma förfaranden
- Använd homozygous apoE-/- Sprague-Dawley råttor. Identifiera varje djurs genotyp med hjälp avstandardmetoderna 17.
- Håll djuren under identiska förhållanden (21 °C ± 2 °C, 60 % ± 5 % luftfuktighet och en 12 timmar lång ljus/mörk cykel) och säkerställ fri tillgång till vatten och mat.
- Utför alla procedurer under rena men icke-sterila förhållanden.
- När råttan är bedövad, utför alla ingrepp under ett kirurgiskt mikroskop vid en förstoring av 16x.
- Använd bomullspinne för kompressionshemostas. Gasvävssvabbar (5 cm x 5 cm) blötlagda med lakterad Ringer-lösning är till hjälp för att hålla ljumsken fuktig.
- Följ reglerna för avfallshantering för att kassera använt material.
2. Förberedelser före operation
- Förbered veterinärmedicinska läkemedel innan du påbörjar operationen. Förvara alla lösningar i rumstemperatur, om inget annat anges.
- Trettio minuter före ingreppet, administrera 0, 03- 0, 05 mg/kg buprenorfin subkutant.
- Bedöva råttan med en intraperitoneal injektion på 100 mg/kg kroppsvikt (BW) (S)-ketamin och 8 mg/kg BW xylazin.
- Utvärdera råttans vikt med hjälp av en vågvägning.
- Placera råttan på en värmedyna och fixera de övre och nedre extremiteterna med medicinsk tejp. Placera råttan med vänster bakben helt utsträckt och så mycket i linje med ryggraden som möjligt för att skapa en rak linje mellan lårbensartären och aortan. Detta kommer att underlätta framflyttning av den ballongmonterade stenten genom den aortabifurcation.
- Behåll anestesi med inandning av 1,5 volymprocent isofluran i 97,5% syre vid en flödeshastighet av 2 L/min.
OBS: Låt råttan andas spontant, utan intubering. - Applicera ögonsalva för att förhindra ögonskador under medvetslöshet.
- Raka pälsen från råttans ljumsk- och underlivsområde och sterilisera motsvarande hud med en povidone-jodlösning.
- Innan du påbörjar operationen, kontrollera tillräckligt djup av anestesi genom att nypa svansspetsen och den interdigitala vävnaden.
3. Kirurgi
- Gör ett medialt snitt på ~0,5\u20121 cm i vänster ljumske för att öppna huden och den underliggande fascian.
- Dissekera och sondera trubbigt i djupet tills den pulserande vänstra lårbensartären kan identifieras.
- Förbered lårbensartären med hjälp av mycket fina tång genom att försiktigt ta bort den omgivande bindväven. Var noga med att skada varken lårbensnerven eller lårbensvenen, som är mediala för artären.
- Förbered ca 1 cm av lårbensartären. Sätt försiktigt spetsen på tången under kärlet för att försiktigt lyfta den.
- Gänga bitar av 4-0 silkessutur under de distala och proximala delarna av artären och bilda slings. Kläm fast ändarna på var och en av de två gängslingorna mellan grenarna på en kirurgisk klämma. Använd de kirurgiska klämmorna för att styra artären. Sträck försiktigt ut och lyft slingorna för att tillfälligt avbryta blodflödet.
OBS: Arbeta snabbt för att undvika en långvarig stass som kan leda till vävnadsskador. - Använd vass mikrosax, utför en arteriotomi mitt i lårartären.
- Introducera en guidetråd genom arteriotomin. När du når den proximala gängslingan, släpp trådens spänning genom att flytta den kirurgiska klämman och föra styrtråden vidare mot bukaortan.
OBS: Kapa ledaren med en trådskärare för att underlätta hanteringen. - Placera den proximala änden av ledaren mellan membranet och njurartärerna.
OBS: Att föra ledaren för långt bär risken för aorta- eller hjärtskada. Vi rekommenderar att du öppnar buken för att säkerställa tillräcklig positionering av ledaren och stenten åtminstone för de första djuren. - För in en pressad och ballongmonterad kranskärlstent som mäter 2,25 mm x 8 mm (max 2,5 mm x 8 mm) över ledaren i lårbensartären och för den till bukaortan.
- Placera stenten strax ovanför kolorektalbifurcationen men under njurartärerna. Sätt ut stenten genom att blåsa upp ballongkatetern till 12 atm i 15 s med hjälp av ett uppblåsningssprutasystem.
- Töm ballongkatetern och behåll undertrycket enligt tillverkarens rekommendationer för den stent som används.
- Dra långsamt tillbaka den tömda katetern samtidigt som stenten lämnades på plats.
- Strax innan du tar ut katetern, skapa spänning på gängslingan ovanför snittet med operationsklämman för att avbryta blodflödet igen. Ta sedan bort ballongkatetern och ligate omedelbart kärlet proximally.
- Knyt proximala och distala tråd slingor för att ligate femorala gatan och bekräfta adekvat hemostas av arteriotomy. Säkerheter artärer kommer att säkerställa ytterligare perfusion till lemmen.
- Stäng muskeln som överbetonar artären, liksom hudsnittet genom att använda 10-0 icke-resorbable suturer.
4. Djurvård efter stentimplantation
- Omedelbart efter operationen, låt råttan återhämta sig i 60 minuter i en speciell intensivvårdsavdelning med uppvärmd luft (30\u201235 °C) och en syretillförsel.
- Håll noga koll på djuren tills de är helt återställda. Flytta sedan råttorna till en vanlig bur. Ge ad libitum tillgång till vatten och mat.
- Administrera postoperativ analgesi var 6-12 timmar med 0, 03- 0, 05 mg/kg buprenorfin (s.c., i 500μl NaCl) under totalt 72 timmar under klinisk bedömning.
- Blanda maten med clopidogrel (15 mg/kg) för att undvika trombos av den implanterade stenten.
- För att förbättra hypercholesterolemic villkor och plack bildas, börja västerländsk kost utfodring vid 6\u20128 veckor efter födseln och fortsätta till dödshjälp. Om så önskas kan en kohort av djur som matas med normal råttmat fungera som kontroll.
5. Insamling och bearbetning av vävnader
- Innan du påbörjar vävnadsutplanteringen vid den angivna tidpunkten avlivar du djuret enligt IACUC:s riktlinjer. Skörda den stentade aortan för histologisk analys i slutet av observationsperioden.
- Öppna buken med ett mittlinjesnitt och ta bort det stentade segmentet av aortan samt intilliggande icke-stentade delar av aortan, som mäter 0,5 cm vardera.
- Placera vävnaden i en lösning av 4% buffrat formalin i 24 timmar för fixering.
- Bädda in den stenterade kranskärlens vävnad i plast och utför histologisk och immunohistokemisk färgning enligtstandardprotokollen 18,19.
6. Histomorfetrisk analys
- Utför histomorfetrisk analys av sekventiella delar av den proximala, mellersta och distala delen av stented aorta med hjälp av ett mikroskop kopplat till en dator med en lämplig bildanalys programvara.
- Spåra konturerna av den yttre elastiska lamina (EEL, mellan adventitia och media), inre elastiska lamina (IEL, mellan media och neointima) och lumen med en grafisk ritplatta. Från dessa värden beräknar du EEL-område, IEL-område och lumenområde med programvaran.
- Beräkna den procentliga tvärsnittsarealen i stent restenosis (ISR):
- Beräkna den totala neointimala areaen (Ai):
- Mät neointimaltjockleken (NIT) över varje stentstag som avståndet mellan strut och lumen. Mät NIT mellan stentstag som avståndet mellan IEL och lumen.
OBS: Alternativt kan du beräkna NIT som
där PL och PIEL är lumen respektive inre elastiska lamina omkrets,respektive 20. - Utför ytterligare analyser enligt studiens krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver stentimplantation i buken stora delar av råttor med hjälp av en trans-femoral åtkomstväg (Figur 1). Den första centrala punkten i denna djurmodell är att den möjliggör utplacering av koronarstentar i mänsklig storlek. En kommersiellt tillgänglig pressad och ballongmonterad kranskärlstent kan placeras i råttornas bukaorv. Dessutom kan samma princip för stentutplacering som hos människor tillämpas. En annan fördel med användningen av råttor är tillgången på genetiskt modifierade stammar, såsom apoE-/- råttor, som är kommersiellt tillgängliga.
Vi använde nyligen denna metod för att utvärdera om apolipoprotein E-bristfälliga råttor är mer benägna att utveckla ISR jämfört med vildtyp råttor21. Från totalt 42 hanråttor som genomgår stentimplantation, slutförde 36 råttor studieprotokollet efter 28 dagar (överlevnadsgrad = 85,71%). Två råttor dog var och en av fartygsstängning misslyckande, inre blödning och stent blodpropp. Stentar från tre djur kunde inte analyseras eftersom vävnaden skadades allvarligt eller stördes på grund av bearbetningsfel. Troligtvis hände detta under sågproceduren. Vi rekommenderar träning för att utföra denna teknik flera gånger innan studien börjar.
Hos de återstående 33 råttorna sattes kranskärlsstenar i mänsklig storlek framgångsrikt ut utan tecken på malapposition eller fartygsskada (tabell 1). Kroppsvikten var likartad hos vilda apoE+/+ och apoE-/- råttor (530,1 ± 15,94 g jämfört med 513,6 ± 16,45 g). Homozygous apoE-/- råttor utvecklade markant förhöjd neointim hyperplasi och ISR jämfört med vilda apoE+/+ råttor(figur 2). Även om en apoE-/- bakgrund gör djur mer mottagliga för åderförkalkning, särskilt när de matas västerländsk kost, observerade vi inte några tidigare aterosklerotiska plack hos våra råttor, troligtvis eftersom en västerländsk kost inte startades förrän kirurgi och den efterföljande observationsperioden på fyra veckor var för kort för aterosklerotisk lesion utveckling.
Figur 1: Schema för stentimplantationen i buken stora delar av råttor med hjälp av en trans-femoral åtkomst.
a)Efter avbrott i blodflödet införs en ledaren genom en medial arteriotomi. b)En pressad och ballongmonterad kranskärlstent förs in över ledaren i lårartären. c)Den ballongmonterade stenten är förs fram till bukaortan, där den används genom ballonginflation. Stenten ska placeras ovanför bifurcationen och under njurartärerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa fotomikrografer av Giemsa-färgade buken stora fårorv 28 dagar efter stent implantation i västra kosten-matas.
a)Vilda apoE+/+ råttor ochb)Homozygous apoE-/- råttor. Hög effekt bilder: NI = neointima, St = stent strut, M = tunica media, L = lumen. Figuren har reproducerats med modifieringar från Cornelissen, A. et al.21. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| antal råttor | |
| fartygsstängningsfel | 2 |
| inre blödning | 2 |
| stent trombos | 2 |
| fel på vävnadsbehandling | 3 |
| framgångsrikt slutförande av protokollet | 33 |
Tabell 1: Resultat av stentimplantation i buken stora kroppskort med hjälp av en trans-femorala tillgång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver implantationen av mänskliga stora födans stentar i buken stora aortan av apoE-/- råttor. Flera tekniska punkter är värda att betona. För det första bör en missmatchning mellan stentstorleken och aortans storlek undvikas. Att placera en för liten stent kan leda till stent malapposition, medan implantation av en stent som är för stor för aortan kan orsaka översträcka, riva och skada på kärlet. Därför rekommenderar vi att du använder stentar mellan 2,0 och 2,5 mm i diameter och att hålla implantationstrycket inom det rekommenderade intervallet utan att överbelasta stenten. Det lämpligaste implantationstrycket ges vanligtvis av stenttillverkaren. Överdriven skada på lårbens venen och därefter vena cava bör undvikas eftersom kärlväggarna är extremt tunna och mycket lätta att skada, vilket resulterar i blödning som är svår att stoppa. Lårbensartären kan särskiljas från lårbens venen genom pulsering, som bör observeras noggrant. En annan fallgrop är risken för arteriell skada och dissekering när du introducerar ledaren och / eller ballongkatetern. Arteriell dissekering kan minimeras genom att kontrollera och sträcka lårbensartären distally med slingor med silkesband medan ballongkatetern införs. Det är absolut nödvändigt att omedelbart sluta föra enheten framåt när motstånd påträffas. I det här fallet hjälper små rörelser mellan tum- och pekfinger att ändra enhetens riktning. Enligt vår erfarenhet är detta oftast fallet strax under det inguinala ligamentet och längre upp, när den gemensamma iliaca gatan närmar sig bifurcation, eftersom det går djupare in i retroperitoneal utrymmet här. Det kommer säkert att finnas en inlärningskurva för operatören innan överlevnadsgraden är stabil och med viss erfarenhet är den genomsnittliga kirurgiska tiden ca 20 min.
Hos människor implanteras stentar vanligtvis i kraftigt smala åderförkalkning artärer. Även om apoE brist i allmänhet gör djur mer mottagliga för utvecklingen av aterosklerotiska skador, observerade vi inte någon plack bildas hos våra råttor, troligtvis eftersom västra kost utfodring inte startades förrän stent implantation. Om stent implantation i aterosklerotiska skador önskas, bör västerländsk kost börja vid 6\u20128 veckor efter födseln och fortsätta tills uppoffring. Atherosclerotic skador i mottagliga stammar kommer att utvecklas efter 7\u201214 veckor på fettrik kost22. Hittills har endast begränsade data om apoE-/- råttor publicerats. Ingen studie rapporterade dock spontan lesion utveckling före 20 veckor23. Zhao et al. observerade typisk åderförkalkning i apoE-/- råttor efter minst 24 veckor med en kontinuerlig ökning av plackbörda och lesion allvarlighetsgrad tills uppoffring vid 72 veckor15. Således, enligt litteraturen, är det osannolikt att råttor skulle utveckla spontan åderförkalkning vid 14-16 veckors ålder. Därför rekommenderar vi att du använder äldre råttor och att starta västerländsk kost så tidigt som möjligt om stent implantation i förformade atherosclerotic skador önskas för studien.
Sex djur överlevde inte operationen. Två djur dog av stent trombos trots administrering av clopidogrel. För att minska stenttrombos kan djur förbehandlas i 48 timmar med aspirin eller få en intraperitoneal injektion av enoxaparin postoperativt. Att införa clopidogrel en dag före operationen kan också minska risken för trombos, men all intensifiering av den antitrombotiska behandlingen samtidigt ökar risken för blödning. Stent trombos är en vanlig komplikation av PCI24,25,26 och kan ha flera skäl. Potentiellt, i vår studie, stent trombos dödsfall resulterade från otillräcklig ballong inflation och samtidig stent malapposition. I motsats till stent implantation hos människor kontrollerades inte stent utplacering i råtta buken storast i angiografi. Därför kan ineffektiv ballonginflation inte upptäckas och korrigeras under operationen. På samma sätt kan stent-distribution leda till en oavsiktlig ocklusion av ett förgrenande fartyg. Med tanke på att det inte är praktiskt möjligt att utföra operationen som kräver användning av ett kirurgiskt mikroskop under fluoroskopisk kontroll, rekommenderar vi att du öppnar buken för att bekräfta den exakta utplaceringen av stenten, åtminstone för de första flera procedurerna. Andra potentiella orsaker till stent trombos kan vara inflammatoriska reaktioner, allvarlig skada eller dissekeringar av kärlväggen. Kirurgen måste vara medveten om eventuella kliniska tecken som indikerar dessa komplikationer, och djuren måste inspekteras varje dag under hela observationsperioden.
Råtta buken stora kroppsvikt mäter mellan 1,8 mm och 3,0 mm i diameter, beroende på djurets vikt27,28. Att föra fram en skrymmande stent genom de ännu mindre lårbens- och iliaca artärerna kan orsaka intimareva och skador på kärlväggen. Därför är denna teknik begränsad till implantation av mindre stentar (mellan 2,0 och 2,5 mm i diameter) för att undvika översträckning eller skada på kärlväggen i stora delar.
En annan begränsning är nödvändigheten av att ligatera lårbensartären för att uppnå hemostas efter förfarandet, potentiellt med risk för nedre delen ischemi. Tidigare studier visade dock att säkerheter artärer samt anpassningar av mikrovasculature distala till ocklusion kan upprätthålla nedre delen perfusion efter ligatur av femorala gatan hos råttor29, och ingen av våra råttor uppvisade kliniska tecken på nedre delen ischemi under observationsperioden. Ändå bör utredarna vara medvetna om denna potentiella risk, eftersom lem ischemi inte bara representerar en potentiell orsak till postoperativ död, men kan också potentiellt inducera en systemisk inflammatorisk reaktion, potentiellt partisk resultaten.
Medan råttor i allmänhet är en kostnadseffektiv djurmodell, ökar användningen av genetiskt modifierad apoE- - råttor kostnaden. En annan begränsning är att det tar jämförelsevis lång tid tills atherosclerotic plack har utvecklats hos råttor. Dessutom finns det några viktiga hemodynamiska skillnader mellan aortan och kranskärlen som förtjänar mer uppmärksamhet. Shear stress är högre i stora än hjärtinfarkt, och bifurcations orsakar turbulent blodflödet saknas. Detta minskar utvecklingen av intimal hyperplasi och omfattningen av restenosis.
Restenosis är en av de viktigaste faktorerna som begränsar den långsiktiga framgången för kranskärlstentar. En mängd olika djurmodeller har använts för att studera restosis patofysiologi, var och en med sina egna fördelar och brister. I jämförelse med andra djurmodeller har råttor fördelen av en hög genomströmning, enkel hantering och bostäder, reproducerbarhet samt kostnadseffektivitet, samtidigt som de möjliggör implantation av koronarstenter i mänsklig storlek. Det första protokollet av buken aorta stenting hos råttor rapporterades av Langeveld et al.11. Denna modell kräver dock en trans-abdominal tillgång för att införa stenten, som är associerad med en fysisk förträngning av stora kroppskörtband för att uppnå ett tillfälligt avbrott i blodflödet. Den resulterande manipulationen och kärlskadan kan potentiellt orsaka inflammatoriska reaktioner, vilket inte bara kan leda till komplikationer, men också till uttalad ISR12. Senare ändrade Oyamada et al. protokollet genom att införa stenten genom den gemensamma iliaca gatan12. De jämförde överlevnadsgraden mellan de två olika metoderna (transaorta kontra trans-iliaca gatan) och fann en betydligt högre dödlighet hos djur med trans-abdominally utplacerade stenter (57% mot 11%, p < 0,05). Råttor dog oftast av trombos vid snittet / suturstället, vilket är katastrofalt när det förekommer i bukaortan12. Ytterligare minska trauma och efterlikna implantationstekniken hos människor närmare, använde vi en trans-femoral tillgång för att införa stent och rapporterade en dödlighet på 14%. Två råttor dog var och en av fartygsstängning misslyckande, inre blödning och stent blodpropp. Nyare studier rapporterade dock dödligheten så låg som 6% efter stentimplantation i råtta buken aorta även med transaorta åtkomst30,31. Ändå var den kombinerade sjukligheten och dödligheten 13,4%, i en studie av Nevzati et al. efter implantation av magnesiumstentar i råtta aorta30. Medan varken fartyg stängning misslyckande eller inre blödning rapporterades i deras serie, stent blodpropp var uppenbart i 10,5% av råttor30. Å andra sidan rapporterade Aquarius et al. inte någon stent trombos efter behandling av sidewall stora med flödesavledare, men denna studie använde tunnare stent strut enheter, och dubbla antiplatelet terapi administrerades tillråttorna 31. Vi försökte hitta en balans mellan risken för stent trombos och blödningsrisk och administrerade clopidogrel och heparin i vår studie. Även om detta kan ha minskat risken för stent trombos, som inträffade hos 4,76% av råttorna, kan det också ha varit orsaken till den jämförelsevis högre risken för blödning (9,52% av råttorna), antingen på grund av inre blödning eller fartygsstängningsfel.
Här visade vi implantationen av en läkemedels-eluterande stent i råtta buken stora, men likaså denna metod kan användas för utvärdering av andra, lika stora stent enheter, till exempel nakna metallstentar eller bioresorbable vaskulär byggnadsställningar.
Sammanfattningsvis är buken aorta stenting av apolipoprotein E-bristfälliga råttor en tillförlitlig och reproducerbar modell för att undersöka ISR efter stent implantation. Modellen kan utvidgas till att omfatta användning av äldre råttor, som är mer benägna att utveckla åderfördriska lesioner spontant, och genom att testa andra enheter som används för mänsklig koronarintervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka fru Angela Freund för hennes ovärderliga tekniska hjälp med inbäddning och bildproduktion. Vi vill också tacka Tadeusz Stopinski vid Institutet för laboratoriedjurvetenskap & experimentell kirurgi för hans insiktsfulla hjälp med veterinärarbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
- Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
- Virmani, R., Farb, A.
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
- Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
- Knowles, J. W., Maeda, N.
- Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744 (2015).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
- Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9 (2011).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
- Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
- Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13 (2014).
- Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950 (2019).
- Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
- Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18 (2004).
- Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541 (2019).
- Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
- Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835 (2018).
- Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
- Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
- Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
- Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
- Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359 (2017).
- Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).
