Summary
Dit protocol beschrijft de dissectie van neonatale dmp1-topaas muizen calvaria en isolatie van osteocyten die het groene fluorescerende eiwit tot expressie brengen door celvertering en fractionering, naast osteocytenpreparaat voor fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).
Abstract
De osteocyt, waarvan ooit werd gedacht dat hij een passieve bewoner van het bot was gezien de backstage-functie van het detecteren van mechanische belasting, wordt nu onder de aandacht gebracht en er is aangetoond dat hij meerdere belangrijke functies heeft, zoals het actief wijzigen van de extracellulaire matrix en het vormen van een endocriene orgaan met het lacunocanaliculaire systeem dat het omsluit en berichten naar verre locaties verzendt. Dankzij de methoden die het mogelijk maakten om de osteocyt in vitro te testen van het isoleren van primaire osteocyten tot osteocytachtige cellijnen, ervaren osteocyten nu een klinkende interesse en een golf van kennis over structuur en functie. Veel aspecten van de osteocytenbiologie en de interactie met andere moleculaire componenten moeten nog worden ontdekt. In dit protocol beschrijven we in detail de efficiënte isolatie van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria, die het groene fluorescerende eiwit in osteocyten tot expressie brengen, door celfractionering en vervolgens het verwerven van culturen van primaire osteocyten door FACS.
Introduction
Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen van osteoblastische voorlopers die ingebed raakten in hun uitgescheiden matrix1. Ze zijn de meest voorkomende en langstlevende cellen onder botcelpopulaties. Ze bevinden zich in lacunes en hebben een karakteristieke stellaatmorfologie met dendrieten die zich uitstrekken door kanalen die canaliculi worden genoemd en een uitgebreid netwerk van communicatie en metabole uitwisseling vormen met hun omgeving en het botoppervlak2. Osteocyten choreograferen zowel osteoblasten als osteoclasten rollen in botremodellering, ze zijn de primaire mechanosensorische cellen die aanpassing verlenen aan mechanische belasting3, zijn betrokken bij fosfaathomeostase4 en botmatrixmineralisatie5, en samen met het lacunocanaliculaire systeem fungeren ze als een endocriene orgaan dat verre weefselssignaleert 6.
Osteocyten bevinden zich in een gemineraliseerde matrix, wat de toegankelijkheid beperkt en hun isolatie uitdagend maakt, waardoor in vitro onderzoek wordt belemmerd. Een van de eerste isolatiemethoden beschreef geïsoleerde osteocyten uit kippen calvaria met behulp van een osteocytspecifiek monoklonaal antilichaam (OB7.3)7 waarvan later bekend werd dat het de aviaire variant van PHEX (PHosfaatregulerend gen met homologie aan Endopeptidases op het X-chromosoom)8 was. Andere onderzoekers gebruikten sequentiële vertering van rat 9 of muis 10 lange botten om osteocytrijke fracties te verkrijgen waarin de zuiverheid van osteocyten ongeveer70% 9 was. Beperkingen van deze procedure zijn onder meer de suboptimale zuiverheid van culturen die besmet zijn met andere celtypen dan osteocyten en dat osteocyten mogelijk kunnen worden overwoekerd door andere cellen in cultuur, omdat osteocyten het vermogen om te delen hebben verloren. Deze uitdagingen beperken de bruikbaarheid van langetermijnculturen.
Om deze beperkingen te overwinnen, werden verschillende osteocytencellijnen ontwikkeld. De MLO-Y4-cellijn11 en de MLO-A5-cellijn12 zijn met name de meest bestudeerde cellijnen die nuttig zijn voor de studie van de osteocyten in een vroeg stadium; ze zijn echter minder nuttig voor het bestuderen van volwassen osteocytensignalering omdat ze lage niveaus van sclerostine en FGF2313 uitdrukken, die beide volwassen osteocytenmarkers zijn. Andere cellijnen, waaronder IDG-SW3 14 en Ocy45415, drukken hoge niveaus van sclerostine en FGF23 uit en zijn nuttig bij het bestuderen van het late osteocytenstadium. Cellijnen blijken nuttige onderzoeksinstrumenten te zijn; Niettemin komen ze niet zonder beperkingen omdat ze de biologie van de primaire cel niet volledig vertegenwoordigen. Verschillende cellijnen vertegenwoordigen verschillende ontwikkelingsstadia van het rijpheidsspectrum van osteocyten en cellijnen vertegenwoordigen niet de heterogeniteit van primaire osteocyten16,17.
Om zuivere culturen van primaire osteocyten te verkrijgen, maakten onderzoekers gebruik van het cre-muismodel waarin de 8-kb dmp1-promotor wordt gebruikt om groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie in osteocyten18,19 aan te sturen. Dubbele transgene muizen (pOB-Col 2.3- GFP-cyaan en DMP1-GFP-topaas) van Paic et al.19 en dmp1-topaas transgene muizen van Nakashima et al.20 zijn gebruikt om osteocytenpopulaties te verkrijgen. Waarin ze sequentiële vertering en FACS van osteocyten gebruikten die GFP tot expressie brachten om culturen van primaire osteocyten te verkrijgen19,20. De richting van cre in de 10-kb dmp1 reportermuis Ai9, die het tdTomato-eiwit activeert, bleek aanwezig te zijn in osteocyten, osteoblasten, spieren en cellen in het beenmerg. De 8-kb dmp1-promotor had hetzelfde expressiepatroon, maar slechts een deel van de osteoblasten en beenmergcellen drukte het eiwit uit, wat aangeeft dat de 8-kb dmp1-promotor specifieker is21. Desondanks moeten resultaten verkregen met behulp van de 8-kb dmp1-promotor met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd en moeten genexpressieprofielen routinematig worden uitgevoerd met behulp van osteocyten versus osteoblastspecifieke markers om ervoor te zorgen dat de verkregen populatie van voldoende zuiverheid is.
Osteoclastmarkers OSCAR en Dcstamp werden gevonden in hematopoëtische niet-uitgeputte versus uitgeputte osteocytenpopulaties, deze bevinding leidde de auteurs tot de conclusie dat digesten verkregen uit fractionering van 8-kb dmp1-topaas neonatale calvaria en GFP-sortering besmet zijn met hematopoëtische cellen. Besmetting met hematopoëtische cellen had kunnen worden verzacht door de GFP-sorteerpoort aan te scherpen, aangezien GFP-positieve hematopoëtische cellen een redelijk lagere GFP-intensiteit hadden dan GFP-positieve mesenchymale cellen (osteocyten)22.
De methoden voor het bestuderen van osteocyten in vitro hebben bijgedragen aan de recente schat aan informatie over osteocytenbiologie. Osteocytenisolatie blijft echter een arbeidsintensieve en langdurige procedure met lage celopbrengsten. De beschreven methode van botvertering met behulp van collagenase en EDTA, vaak tot fractie 823, duurt enkele uren waarin de levensvatbaarheid van osteocyten wordt belast. Onderzoekers hebben gerapporteerd dat ze fracties (2-0125) hebben gebruikt voor celsortering 20, en hebben aangetoond dat het expressieprofiel van genen geassocieerd met osteocyten versus die van osteoblasten het succes van het isoleren van pure osteocytenpopulatiesbevestigt 20. In dit artikel beschrijven we het proces van het verkrijgen van breuken (2-0125) en vergelijken we de opbrengst van osteocyten van elke fractie beginnend met fractie 1 tot en met 8 om de terugkeer van osteocyten in elke fractie te bepalen. We beschrijven ook de dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria en calvariale spijsvertering met behulp van collagenase en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), evenals de bereiding van cellen voor FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures en dierverzorging werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Tohoku University.
1. Dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria
- Gebruik voor dit protocol 6\u20127 eendagsjongen van C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J muizen. Euthanaseer muizen met 5% isofluraaninhalatie en breng de pups vervolgens over in 70% ethanol.
- Breng de geëuthanaseerde pup over in een niet-behandelde kweekschaal.
- Gebruik een schaar en een pincet om de huid aan de basis van de schedel vast te pakken en maak een incisie.
- Gebruik de eerste incisie als uitgangspunt, snijd aan beide zijden van de schedel voor de oren, verwijder de huid en leg de calvaria bloot.
- Houd het hoofd van de neusbrug en snijd de calvaria langs de lambdoïde hechtdraad. Snijd langs de laterale randen van de pariëtale botten en breid deze uit naar het voorste deel.
- Scheid de calvaria van het onderliggende hersenweefsel.
OPMERKING: Om een schone benige calvaria met minimale aanhechting van zacht weefsel te garanderen, snijd niet diep in het bot; Ter referentie moet men de schaduw van de schaar onder het bot kunnen zien. - Breng de calvaria over in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4 gedurende het hele protocol). Zorg ervoor dat het holle deel naar boven is gericht.
2. Fractionering van de calvaria van pasgeboren muizen
- Breng tot 5 calvariae over in een conische buis van 50 ml met 5 ml collagenaseoplossing van 2 mg/ml. Gebruik verse collagenase-oplossing die vlak voor gebruik is bereid.
- Om een verse collagenase-oplossing te bereiden, voegt u collagenasepoeder toe aan de isolatiebuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mMK2 HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA), 5 mg / ml glucose en 25 mM HEPES) bij2 mg / ml. Los het collagenasepoeder op een magneetroerder op.
- Laat de collagenase-oplossing door een steriele filtereenheid van 0,22 μm in een buis van 50 ml lopen en houd deze gedurende het hele protocol op ijs.
- Incubeer de calvaria bij 37 °C gedurende 20 minuten op een schudder bij 300 tpm om fractie 1 te verkrijgen.
- Gooi de vertering van fractie 1 weg, was de calvaria met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gooi de was weg.
- Incubeer de calvaria in 5 ml 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met 1 mg/ml BSA in PBS, PH 7,4 bij 37 °C gedurende 15 minuten op een shaker bij 300 tpm.
- Verzamel de digest in een conische buis van 50 ml. Was de calvaria met 5 ml PBS en voeg de wasoplossing toe aan de digest.
OPMERKING: Op elk punt van het verzamelen van de vertering en het wassen, pipetteer de botten in hun oplossing om de cellen los te maken van het bot en om doubletten en celaggregaten te voorkomen. - Om fractie 2 te verkrijgen, centrifugeert u de digest bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg, suspensie de pellet opnieuw in 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline G en 100 μg / ml streptomycine. Zaad op een kweekschaal van 10 cm. Incubeer fractie 2 bij 37 °C onder 5% CO2.
- Incubeer de calvaria in 5 ml collagenase-oplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten op een shaker bij 300 tpm.
- Als u breuk 3 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 3 bij 37 °C onder 5% CO2.
OPMERKING: Op dit punt zullen de botten kleiner worden en zullen ze worden gereduceerd tot fragmenten. Om ervoor te zorgen dat er geen botten per ongeluk in de digesten terechtkomen, wat leidt tot celverlies tijdens het proces, gebruikt u een kleine tippipet voor het verzamelen van de digesten (1000-12200 μL pipetpunten). - Incubeer de calvaria in 5 ml collagenase-oplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten op een shaker bij 300 tpm.
- Als u breuk 4 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 4 bij 37 °C onder 5% CO2.
- Incubeer de calvaria in 5 ml 5 mM EDTA met 1 mg/ml BSA in PBS (pH 7,4) bij 37 °C gedurende 15 minuten op een shaker bij 300 tpm.
- Als u breuk 5 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 5 bij 37 °C onder 5% CO2. Osteocyten kunnen op dezelfde dag worden bereid om te sorteren of tot 24 uur voor het sorteren worden gekweekt.
3. Bereiding van osteocyten voor fluorescentie geactiveerde celsortering
- Zuig het medium van elke celfractie op en was zachtjes met 10 ml PBS tweemaal.
- Voeg 5 ml 0,5% trypsine-EDTA toe in PBS en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 5 ml 10% FBS α-MEM en pipet toe om de cellen voorzichtig los te maken. Combineer de cellen in elke fractie door een celzeef van 40 μm in een conische centrifugebuis van 50 ml te zeven.
- Was de cellen met 10 ml PBS en verzamel door een celzeef van 40 μm in een conische centrifugebuis van 50 ml te zeven. Centrifugeer de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant aan en voeg 10% FBS α-MEM toe aan de pellet. Pas de celconcentratie aan op ongeveer 1 x 107 cellen/ml.
- Filter de cellen in een 35 μm nylon mesh afgedekte buis. De cellen zijn nu klaar voor FACS.
- Gebruik voor dit protocol een mondstuk van 100 μm. De opvangvloeistof moet bestaan uit 10% FBS α-MEM. Houd het monster gesorteerd op roeren en op 4 °C in de gehele sortering, indien mogelijk.
- Voorafgaand aan de sortering optimaliseert u gating om artefacten en cellen te verwijderen door het gebied side scatter (SSC) en forward scatter (FSC) aan te passen. Elimineer doubletten door SSC-breedte versus SSC-hoogte en FSC-gebied versus FSC-breedte aan te passen. GFP-negatieve osteocyten moeten worden gebruikt als een controle om de parameters van het sorteerinstrument aan te passen.
- Nadat de celverzameling is voltooid, centrifugeert u de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Was cellen met PBS. Centrifugeer de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
- Suspenseer de cellen opnieuw en pas het aantal naar wens aan met 10% FBS α-MEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van dit protocol is om het proces aan te tonen van het verkrijgen van culturen van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria door middel van een fractioneringsproces met behulp van collagenase om de collageenmatrix en EDTA voor calciumchelatie af te breken, waarna cellen worden voorbereid op FACS om osteocyten van andere celpopulaties te scheiden.
Methoden voor het verkrijgen van primaire osteocyten uit neonatale muis calvaria beschrijven vaak het gebruik van fracties (1\u20128) voor het sorteren23. Om de efficiëntie van deze methode te testen, vergeleken we de opbrengst van osteocyten verkregen uit één dmp1-topaas muizen calvaria, beginnend bij fracties 1 tot en met 8. Fracties 1\u20128 werden afzonderlijk gesorteerd om het percentage en de opbrengst van osteocyten van elke fractie te bepalen. Na de sortering kweekten we osteocyten gedurende 24 uur op een plaat met 96 putten om de dichtheid van de gezaaide cellen te vergelijken. De dichtheid van osteocyten in fracties 2\u20125 blijkt hoger te zijn dan die van fractie 1, en de osteocytendichtheid begint opmerkelijk af te nemen in fracties 6, 7 en 8 (figuur 1A).
Hoewel het percentage osteocyten dat tussen alle fracties wordt verkregen niet statistisch significant is (figuur 1B), verschilt de dichtheid van osteocyten dramatisch. Onderzoekers20 hebben het gebruik van fracties 2-0125 gemeld voor het isoleren van osteocyten via FACS, en we laten in figuur 1 zien dat het gebruik van fracties 2-1 het proces voor het verkrijgen van osteocyten optimaliseert en de tijd van de soort vermindert.
Figuur 2 toont het aantal cellen en de gatingstrategie die werd toegepast om GFP-positieve van GFP-negatieve cellen te isoleren waarin cellen verkregen door fractionering van GFP-negatieve muiscalvaria als controle werden gebruikt. Osteocyten verkregen via deze methode werden geanalyseerd op genexpressie van Dmp1 en SOST, die bekende osteocytenmarkers zijn. Dmp1- en SOST-mRNA-expressies zijn hoger in osteocyten in vergelijking met pre-sort fractie 2, die bekend staat als een hoge osteoblastfractie (figuur 3A). Figuur 3B toont de morfologie van een GFP-positieve osteocyt die een stellaatvorm behoudt met dendrieten die zich uitstrekken van het cellichaam dat gedurende 24 uur op een plastic kweekschaal na de sortering is gekweekt.
Figuur 1: Efficiëntie van osteocytenfractionering. (A) Microscopische beelden van de dichtheid van osteocyten uit fracties 1\u20128 gezaaid op een 96-well plaat gevangen na 24 uur van de soort. Fracties 2\u20125 hebben een hogere celdichtheid dan fracties 1 en 6\u20128. Schaalbalk = 100 μm. (B) Percentage osteocyten verkregen uit fracties 1\u20128 zoals gemeten door de flowcytometersoftware. De resultaten zijn afgeleid van drie afzonderlijke representatieve experimenten. De gegevens worden gepresenteerd als een gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie van GFP-positieve osteocyten via fluorescentie geactiveerde celsortering. Het bovenste paneel stelt cellen voor die geïsoleerd zijn uit GFP-negatieve C57Bl/6J littermate calvaria als GFP-drempelregeling. Het onderste paneel vertegenwoordigt het aantal cellen en gatingcontrole dat wordt toegepast om GFP-positieve osteocyten te isoleren uit GFP-negatieve cellen in fractie 2 verkregen uit dmp1-topaas muiscalvarie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Osteocytenkarakterisering na sortering. (A) Relatieve mRNA-expressie van Dmp1 en SOST van fractie 2-cellen gekweekt gedurende 24 uur en osteocyten gekweekt gedurende 24 uur na de sortering. De gegevens worden gepresenteerd als een gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische verschillen werden gedetecteerd met behulp van de t-test van de student: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Microscopisch beeld van een osteocyt die dendrieten vasthoudt die zich naar buiten uitstrekken van het cellichaam dat gedurende 24 uur na de sortering is gekweekt. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste geïsoleerde osteocyt was van een kippencalvaria7 geïsoleerd met behulp van (OB7.3) of de aviantvariant van PHEX; Deze methode wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van werkbare antilichamen, omdat osteocytspecifieke antilichamen die ook soortspecifiek zijn, moeten worden vervaardigd. Onderzoekers gebruikten een andere modificatie van het sequentiële enzymatische proces om osteocyten te verkrijgen uit lange botten van muizen en ratten; De gerapporteerde zuiverheid van deze culturen werd vastgesteld op ongeveer 70%9. De ontwikkeling van het cre mouse-model maakte het mogelijk om osteocyten te engineeren, die GFP op hun oppervlak tot expressie brengen. Dit muismodel werd, samen met FACS, gebruikt om zuivere culturen van primaire osteocytente verkrijgen 20.
We laten het gebruik van breuken 1 en fracties 6\u20128 achterwege, omdat er in deze fracties kleine hoeveelheden osteocyten afkomen. Het gebruik van fracties 2\u20125 geeft de best mogelijke opbrengst van osteocyten over de kortste verwerkingstijd; Dit beperkt de verwerkingstijd van osteocyten en werkt aan het voorkomen van celdood of een mogelijke verandering in celsignalering als gevolg van de stress waaraan de cel wordt blootgesteld tijdens fractionering. We kweken ook osteocyten gedurende 24 uur voorsortering, wat standaard niet-aanhechtende suspensiecellen (hematopoëtische cellen) uitsluit tijdens de sorteerbereiding. Dit minimaliseert besmetting door hematopoëtische cellen die GFP22 tot expressie brengen. De workflow in dit protocol maakt gebruik van eerder gepubliceerde methoden23 en verkort de tijd van de soort, waardoor een efficiënt en snel herstel van osteocyten met minimale verontreiniging mogelijk is.
Kritieke stappen in het protocol omvatten het verkrijgen van een schone benige calvaria en het trimmen van zacht weefsel uit de hersenen of bindweefsel dat aan het bot is bevestigd om de besmetting van aanhangende cellen (fibroblast en neurale cellen) te beperken. Ook het pipetteren van de cellen tijdens stappen die het verkrijgen en wassen van de digesten omvatten, is cruciaal, omdat celaggregaten en doubletten tijdens het sorteren als afval worden gelezen en zullen bijdragen aan een lage opbrengst aan osteocyten.
Osteocyten kunnen worden gesorteerd zonder voorafgaande kweek. Dit betekent echter dat een groter aantal cellen moet worden gesorteerd, waardoor de tijd van de soort toeneemt en de kans op hematopoëtische besmetting toeneemt. Dit kan worden verzacht door hematopoëtische celdepletie voorsortering toe te passen. Dit is echter belastend en wordt niet aanbevolen voor routine- en batchlaboratoriumanalyse22. Problemen kunnen optreden tijdens het sorteren als gevolg van de aanwezigheid van grote celaggregaten en doubletten die de vloeistofstroom van de sorteermachine verstoppen. In ons protocol is dit geen probleem geweest, maar dit kan worden opgelost door het FBS-gehalte van de sorteerbuffer te verlagen (minder dan 10%).
Dit protocol komt niet zonder beperkingen. Deze methode maakt gebruik van osteocyten bij muizen, die niet helemaal lijken op menselijke osteocyten. Dit beperkt het uitbreiden van de resultaten verkregen door het bestuderen van murine osteocyten tot zinvolle klinische uitkomsten. Protocollen voor isolatie van menselijke osteocyten zijn beschreven24, en onderzoekers worden aangemoedigd om de celsoort te gebruiken die het beste hun doelen dient. Net als bij andere protocollen zijn de hoeveelheden osteocyten die met dit protocol worden verkregen beperkt en is een groot aantal muizen nodig voor grootschalige analyse, maar door de tijd die nodig is voor het bereiden en sorteren van osteocyten te verkorten, kunnen grotere hoeveelheden cellen in één tijdsbestek worden verkregen.
Osteocyten verkregen door dit proces kunnen worden gebruikt voor verdere kweek en co-cultuur, genexpressie-analyse, downstream analyse van substraatactivatie / remming, moleculair tasten en kleuringstoepassingen. Primaire cellen kunnen ook worden gebruikt om een 3D-osteocytenmatrixmodel te construeren dat lijkt op de oorspronkelijke osteocytische omgeving voor de studie van mechanotransductie en mechanosensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS KAKENHI-beurs van de Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K10397 tot H.K. en nr. 18K09862 tot I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
