Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62782
Automatic Translation
1, 2
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Summary

כאשר שינוי גורם גדילה ß חלבונים מבשר המשפחה באים לידי ביטוי חוץ רחמי בעוברים קסנופוס laevis, הם עמעם, לקבל מבקעים ומופרשים לתוך blastocoele, אשר מתחיל בפיצוץ מאוחר לשלב gastrula מוקדם. אנו מתארים שיטה לשאיפה של מוצרי מחשוף מחלל הפיצוץ לניתוח אימונובלוט.

Abstract

שתי הזרועות של הליבנדים של גורם גדילה משתנה (Tgfß), המיוצגות על ידי ליגנדים של חלבון מורפוגנטי של Tgfß/Nodal או Bone morphogenetic (Bmp), בהתאמה, ממלאות תפקידים חיוניים בהתפתחות העוברית ובהומאוסטזיס למבוגרים. בני משפחת Tgfß נעשים כמבשרים לא פעילים המעמעמים ומקפלים בתוך הרטיקולום האנדופלסמי. המבשר נצמד לאחר מכן לרסיסי ליגנד ופרודומיין. למרות שרק ליגנד דימריק יכול לעסוק קולטני Tgfß ולהפעיל איתות במורד הזרם, יש הכרה גוברת כי moiety פרודומיין תורם לפעילות ליגנד. מאמר זה מתאר פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לזהות מוצרי מחשוף שנוצרו במהלך ההפעלה של חלבונים מבשר Tgfß. מבשרי Tgfß של קידוד RNA הם הראשונים microinjected לתוך X. laevis עוברים. למחרת, מוצרי מחשוף נאספים מן blastocoele של עוברי שלב gastrula וניתחו על כתמים מערביים. פרוטוקול זה יכול להסתיים במהירות יחסית, אינו דורש ריאגנטים יקרים ומספק מקור של מוצרי מחשוף Tgfß מרוכזים בתנאים פיזיולוגיים.

Introduction

חברי פקטור הגדילה המשתנה ß (Tgfß) הם מסונתזים כחלבונים מבשרים לא פעילים, מעומעמים. המבשרים אז הם בקע על ידי בני משפחת פרופרוטאין convertase (PC), או בתוך מסלול הפרשה או מחוץ לתאים. זה יוצר דימר ליגנד פעיל, מלוכד דיסולפיד ושני שברי פרודומיין1. למרות שזה ידוע כבר למעלה מ -30 שנה כי הפרודומיין של מבשרי משפחת Tgfß נדרש לייצר ליגנד פעיל2, ההבנה כיצד פרודומיין לתרום לתפקוד ליגנד אינה שלמה.

למרות שההבנה של תהליך ההפעלה הפרוטאוליטית של בני משפחת Tgfß נותרה לא שלמה, יש עניין גובר להבין אילו מוטיבים של קונצנזוס PC מקושטים ב- vivo, אם המחשוף מתרחש בתא תת-תאי או חוץ תאי ספציפי, והאם הפרודומיין נשאר קשור באופן קוולנטי או לא צייתני עם ligand3. מספר מחקרים הראו כי הפרודומיין לא רק מנחה את קיפול ליגנד לפני המחשוף4,5, אלא גם יכול להשפיע על יציבות גורם הצמיחה וטווח הפעולה6,7,8,9, מניעים את היווצרותם של הומודימרים או הטרודימרים10, לעגן את הליגנד במטריצה החוץ-תאית כדי לשמור על חביון ליגנד11, ובמקרים מסוימים, לתפקד כליגנד בזכות עצמו להפעיל הטרולוגית איתות12. מוטציות נקודת הטרוזיגוס בתוך הפרודומיין של חברים רבים במשפחת Tgfß קשורות לעין, עצם, כליות, שלד או פגמים אחרים בבני אדם3. ממצאים אלה מדגישים את התפקיד הקריטי של הפרודומיין ביצירת ותחזוקה של ליגנד פעיל ומדגישים את החשיבות של זיהוי ופענוח התפקיד של מוצרי מחשוף שפותחו במהלך ההבשלה הפרוטאוליטית של מבשרי משפחת Tgfß.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור שאיפה מוצרי מחשוף שנוצרו במהלך ההתבגרות של מבשרי משפחת Tgfß מן blastocoele של X. laevis עוברים ולאחר מכן ניתוח אותם על חיסונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע אם אחד או יותר PC קונצנזוס מוטיבים בחלבון הקדמה הם חבולים vivo10,13, לזהות את המחשבים האנדוגניים כי לבקע כל מוטיב13,14, להשוות היווצרות vivo של הומודימרים משפחתיים Tgfß לעומת heterodimers10 או לנתח אם מוטציות נקודה הקשורות למחלות אנושיות ב- Tgfß מבשרי להשפיע על יכולתם ליצור ליגנדים דימרי פונקציונלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת יוטה. צפרדעים שוכנות במתקן שאושר על ידי IACUC. צפרדעים זכרים מורדמות על ידי טבילה בטריקאין הבאים על ידי חיתוך החדר של הלב. צפרדעים שוכנות במעבדה לכל היותר 24 שעות לאחר אינדוקציה הורמונלית של השרצה כדי לאפשר איסוף ביצים ולאחר מכן חזר למתקן הטיפול.

1. אוסף האשכים של אקס לאביס

  1. להרדים זכר בוגר מינית ב 0.2% Tricaine(טבלה 1)במשך 30-40 דקות עד החיה אינה מגיבה לצבוט טופר.
  2. השתמש במלקחיים קהים כדי למשוך את העור מקיר הגוף. לעשות חתך אופקי בעור על פני הבטן התחתונה באמצעות מספריים כירורגיים. בצע חתירה מקבילה בקיר הגוף הבסיסי, ולאחר מכן חתך שלישי, מאונך דרך קיר הגוף למעלה דרך כלוב הצלעות.
    1. מקפלים לאחור את המדפים המתקבלים, מאתרים את החדר של הלב ומקצים את הבסיס כדי לטפמם ולהבטיח מוות.
  3. מוציאים את גופי השומן הצהובים מהבטן עם מלקחיים קהים ומאתרים את האשכים מכל צד, שבבסיס בסיס גופי השומן. הסר כל אשך על ידי חיתוך אותו מן גופים שמנים וכל קרביים מחוברים באמצעות מספריים כירורגיים.
  4. העבר אשכים לצלחת פטרי המכילה 1x פתרון בארת שונה (MBS)(טבלה 1). יש לשטוף ולהסיר כל כלי דם דבקים או קרביים מחוברים.
    1. מעבירים אשכה אחת לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה חיץ אשכים(טבלה 1)לשימוש מיידי ולאחסן את השני בצינור חרוטי 10 מ"ל מלא במאגר אשכים לשימוש מאוחר יותר. Testis צריך להיות מאוחסן ב 4 °C (55 °F) כאשר לא נעשה שימוש יישאר קיימא לפחות שבועיים.
      הערה: תצלומים של בידוד האשכים ניתן למצוא בהפניה 15.

2. איסוף והפרה של X. laevis ביצים

הערה: יש לטפל בצפרדעים בכפפות ויניל או בידיים שנשטפו לפני ואחרי הטיפול בצפרדעים. כפפות לטקס, קרמים ושאריות חומר ניקוי על הידיים האנושיות יפגעו בעור השברירי של הצפרדעים.

  1. ערב לפני ההשרצה, להזריק 0.3 מ"ל (1200 IU) של גונדוטרופין כוריוני אנושי(טבלה 1)לתוך שק הלימפה הגבי של שתיים או שלוש בוגר X. laevis נקבות באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 26 גרם. השתמש במחט חדשה לכל זריקה.
  2. לאחר ההזרקה, מניחים את הנקבות במיכל אטום (לא אטום אוויר) באינקובטור ביולוגי של 18 מעלות צלזיוס. השרצה מתחילה בדרך כלל 14-16 שעות מאוחר יותר.
    הערה: מגירות פלסטיק או מיכלי פלסטיק עם חורי אוויר חתוכים למכסה פועלים היטב להחזקת נקבות למשך הלילה. ודא שהמכסה הוא על בחוזקה כדי למנוע צפרדעים לברוח וייבש באינקובטור.
  3. החזק את הנקבה מעל צלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 1x MBS ולהפעיל לחץ עדין על הבטן של הצפרדע לגרש ביצים לתוך המנה.
  4. חותכים חתיכה קטנה של האשכים (~ 1/5) באמצעות סכין גילוח ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל ~ 500 μL של 1x MBS. למחוץ עם עלה גלולה או הומוגניזר רקמות. לאחסן את השעיית הזרע המתקבלת על קרח או ב 4 °C (4 °F) להפריה לאחר מכן באותו יום.
  5. הטה את צלחת הפטרי 100 מ"מ כדי לשפוך כמה שיותר של 1x MBS ככל האפשר, ולהסיר את השאר באמצעות pipette העברת פלסטיק. החל כ 100 μL של השעיית זרע, להוסיף על 1 מ"ל של 0.1x MBS מערבולת לערבב.
    1. לאחר 5 דקות, להציף את המנה עם מי ברז dechlorinated או 0.1x MBS ולתת לעמוד במשך 30 דקות.
      הערה: ניתן להשאיר מים ללא כלור באמצעות מסנן או מי ברז עירוניים העומדים חשופים לפחות 24 שעות כדי לאפשר לכלור להתפוגג באזורים שבהם כלור קונבנציונאלי מתווסף למים. באזורים שבהם כלורמין מתווסף לחיטוי מי שתייה, יש לטפל במקום זאת במים עם מרכך זמין מסחרית שיכול לפרק כלורמין.
      הערה: ביצים נאספים בתמיסת מלח גבוהה (1x MBS) כדי למנוע היווצרות של מעיל ג'לי, אשר יספק מחסום להפריה. לאחר ההפריה, תמיסת המלח הנמוכה (מים דה-כלוריים או 0.1x MBS) מאפשרת היווצרות מעיל ג'לי והביצים ידבקו זו לזו ובמנה. ביצים שהופרו יסתובבו כך שעמוד החיה הפיגמנטי פונה כלפי מעלה תוך 30 דקות. אם זה לא קורה, והביצים נראות בריאות מתחת למיקרוסקופ, כדאיות הזרע חשודה וייתכן שיהיה צורך לקצור אשכים חדשים.
  6. יוצקים את הפתרון המכסה את הביצים וממלאים את צלחת הפטרי בתמיסת ציסטאין 2% טריים(טבלה 1). מערבבים את התמיסה בצלחת במשך 3-5 דקות עד שמעיל הג'לי מומס והביצים כבר לא נדבקות זו לזו או למנה.
    1. הטה את המנה ושוצקים בזהירות את תמיסה ציסטאין, או להסיר עם pipette פלסטיק. החלף במי הבריכה של DeBoer(טבלה 1). מערבבים לשטיפה ו decant.
    2. חזור על שטיפה אחת עם הפתרון של DeBoer, אחד עם 0.1x MBS, ולמלא את המנה עם 0.1x MBS. לאחר הסרת מעיל הג'לי, הביצים הופכות שבירות יותר ואסור לחשוף אותו לממשק נוזלי האוויר.
  7. מעבירים את הביציות מופרות לאינקובטור ביולוגי של 16 מעלות צלזיוס או משאירים אותן על הספסל בטמפרטורת החדר. אם נשאר בטמפרטורת החדר, המחשוף הראשון יתרחש 1-1.5 שעות לאחר ההפריה, ואת המחשופים הבאים יתרחש בערך כל 30 דקות. לעומת זאת, אם עוברים הם דגירה ב 15-16 °C (70 °F), מחשופים יתרחשו בערך כל שעה וזה יהיה אפשרי להזריק מספר גדול יותר של עוברים משריץ נתון.

3. מיקרו-נסיגה של X. לאביס עוברים

  1. מחממים ומושכים נימים מזכוכית לנקודה עדינה באמצעות משיכת מיקרופיפט עם ההגדרות הבאות: משיכה דו-שלבית; חום 1: 67 °C (67 °F; חום 2: 62 °C (62 °F).
    הערה: הגדרות אלה ספציפיות עבור פולר מיקרופיפט ונימים זכוכיתהמשמשים כאן (טבלת החומרים).
  2. תחת מיקרוסקופ ניתוח, קליפ את קצה מחט משך קרוב לסוף באמצעות מלקחיים #5 Dumont. המחט צריכה להיות חדה אך לא כל כך דקה שהקצה מתכופף כשהוא יוצר קשר עם העובר. איור 1 מציג דוגמה למחט שנמשכה כראוי שלא קוצצה לצורך מיקרו-ינון (A) ומחט שנקטעה (B).
  3. הכנס את המחט למחזיק מחט המחובר למיקרו-מנג'ר. חבר את מחזיק המחט למיקרו-מניפולטור. מניחים 2-4 μL של RNA סינתטי כתרים קידוד חלבון מבשר Tgfß להיות מנותח על חתיכה קטנה של parafilm תחת מיקרוסקופ ניתוח.
    1. באמצעות micromanipulator, להוריד את המחט לתוך טיפה ולהשתמש בפונקציית המילוי על microinjector לשאוף RNA לתוך המחט. הקפד לשמור את המחט מתחת לפני השטח של טיפה, ולצפות התקדמות מתחת למיקרוסקופ כדי למנוע שאיפה אוויר לתוך המחט.
      הערה: אם נוגדנים המזהים את תחום הפרודומיין ו/או התחום של המבשר Tgfß לניתוח אינם זמינים, ניתן להכניס רצף קידוד של תג אפיטופ (לדוגמה, V5, myc, Flag) בתוך המסגרת ל- cDNA שישמש כתבנית לתמלול RNA. יש להשוות את הביואקטיביות in vivo של החלבון המתויג לזה של חלבון לא מאויג כדי להבטיח כי האפיטופ אינו מפריע לקיפול, מחשוף או פעילות נאותים.
  4. הופלט טיפה של תמיסת הרנ"א לאוויר ומדוד את גודל הטיפה באמצעות מיקרומטר המותקן על שלב ההזרקה או בעין המיקרוסקופ. התאם את גודל הירידה לכ- 10 nL תוך ניצול פקדי הזמן והלחץ במיקרו-נג'ר.
    הערה: ריכוזי RNA בטווח של 5-20 ng/μL מתאימים כדי לספק 50-200 pg של RNA לתוך כל עובר. כמות זו של RNA מספיקה בדרך כלל כדי לזהות מוצרי מחשוף בשאיפות מ 10-20 עוברים. עדיף לשאוף למינון הנמוך ביותר של RNA שנותן אות לגילוי על חיסונים. כמויות גבוהות יותר של RNA יכול לגרום פגמים גסטרולציה, אשר להפריע להתרחבות של blastocoele.
  5. העבר עוברים לצלחת הזרקה או מגש המכיל 5% פיקול ב- 0.1x MBS (טבלה 1) כאשר הם מגיעים לשלב התא 2-4. צלחת פטרי 35 מ"מ המצוידת בחתיכת רשת ניילון בתחתית יכולה לשמש כמאכל הזרקה זול שישמור על העוברים משותקים. הכנס את המחט ליד מוט החיות והזריק 10 nL של RNA לתא אחד של כל עובר.
    הערה: עוברים יכולים להיות מוזרקים בקלות בכל עת בין שלב אחד ו 16 תאים. הזרקת העובר לאחר שהוא בקע מבטיחה שהביצה הופרה ושהעובר בריא. המיקום המדויק של הזריקה אינו חיוני. תיאור מפורט יותר של השרצה, תרבות ומיקרו-הפעלה של RNAs לתוך X. laevis עוברים ניתן למצוא בהפניה 15.
  6. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי 35 מ"מ ממולאת בפיקול 5% ב- 0.1x MBS(טבלה 1). מניחים את הכלים הקטנים בתוך צלחת פטרי 150 מ"מ ומכסים באופן רופף במכסה כדי למנוע מהתקשורת התרבותית להתאדות. תרבות העוברים לילה ב 15 -16 °C (5 °F).
    הערה: פולחן עוברים בפיקול מסייע לרפא את אתר ההזרקה. אם מחטים עדינות משמשות, culturing ב 2-3% פיקול מספיק, ואילו 5% פיקול הוא המועדף אם נזק לכאורה הוא ציין. שמירה על העוברים בתמיסת פיקול במשך 1-2 שעות לאחר ההזרקה מספיקה כדי לסייע בריפוי, אך דגירה לילית אינה פוגעת בעובר כל עוד הפתרון משתנה לפני תחילת ההסטרולציה.

4. הפקה וניתוח של מוצרי מחשוף Tgfß

  1. למחרת בבוקר לאחר ההזרקה, להסיר את פתרון Ficoll ולהסיר כל עוברים מתים או גוססים. יש לשטוף את העוברים פעם או פעמיים עם 0.1x MBS ולתרבות העוברים ב-0.1x MBS על הספסל בטמפרטורת החדר.
    הערה: עוברים ניתן גם להחזיר את האינקובטור הביולוגי 16 °C כדי להאט את הפיתוח.
  2. מחממים ומושכים נימים מזכוכית לנקודה עדינה באמצעות פולר מיקרופיפט עם ההגדרות הבאות: משיכה של שני שלבים; חום 1: 67 °C (67 °F; חום 2: 62 °C (62 °F).
    הערה: הגדרות אלה ספציפיות עבור הנימי מושך וזכוכית המשמשים כאן (שולחן החומרים).
  3. תחת מיקרוסקופ ניתוח, קליפ את קצה מחט משך באמצעות מלקחיים. כדי למנוע סתימה, פתיחת מחט המשמשת לשאיפה blastocoele צריך להיות גדול יותר מזה במחט המשמשת microinjection. דוגמה למחט טובה שנמשכה וחתוכה לשמש לשאיפה של בלסטוקול מוצגת באיור 1C. הכנס את מחט השאיפה למחזיק מחט המחובר למיקרו-מנג'ר וחבר את מחזיק המחט למיקרו-מניפולטור.
    הערה: קוטר המחט האופטימלי נקבע אמפירית על ידי ניסוי וטעייה. מחטים בקוטר גדול מתמלאות מהר מדי ולהפוך את זה יותר סביר כי פסולת הסלולר ייכנס המחט. לעומת זאת, מחטים בקוטר קטן מאוד צפויות להיות סתומות. ברגע שנוצרת מחט מתאימה, כדאי ליצור מחטים מרובות שנקטעו באותה תנוחה.
  4. מניחים עוברים במגש הזרקה או צלחת מלאה ב- MBS 0.1x כאשר הם מגיעים לשלב המוקדם עד אמצע הגזטרולה (שלב 10-11).
  5. הכנס את המחט מתחת לפני השטח של העובר ליד עמוד החיה. לחץ על כפתור המילוי על microinjector תוך התבוננות דרך המיקרוסקופ הניתוח כדי לפקוח עין על המחט ועל העובר. במשך כמה שניות, רמת הנוזל הצלול תעלה במחט והעובר יקרוס ויהפוך קרוט.
    1. אם חומר לבן מעונן נכנס למחט, להרפות כפתור המילוי ולפעום את כפתור ההזרקה פעם אחת או יותר כדי להוציא כל חומר מעונן, אשר מורכב פסולת סלולרית שעשוי להכיל פרוטאזים.
      הערה: אם blastocoele מתמוטט ופסולת התא נכנס המחט ברגע כפתור המילוי הוא לחצה, זה מציין כי הפתח במחט הוא גדול מדי. אם blastocoele לא מצליח להתמוטט אבל חומר לבן נכנס המחט מיד, זה מראה כי המחט הוכנסה עמוק מדי והוא נוגע רצפת blastocoele. להוציא את החומר הלבן, ולעבור לעובר הבא. ניתן לשלוט בקצב השאיפה בקפידה רבה יותר על ידי פעימת כפתור המילוי במקום ללחוץ עליו ברציפות. זה חשוב במיוחד אם הפתח במחט גדול יותר אופטימלי.
  6. חזור על שלב 4.5 עד שהנוזל שואף מהבלסטוקול של 10-20 עוברים.
    הערה: בדרך כלל, נוזל blastocoele שאף מ 10-20 עוברים מספיק כדי לזהות מוצרי מחשוף על חיסונים. עם זאת, זה יכול להשתנות בהתאם לאיכות הנוגדנים ויש לקבוע אמפירית.
  7. מניחים חתיכת פרפין על מגש ההזרקה ופיפטה 1 μL של מים ללא נוקלאז על זה. תטביעו את המחט מתחת לטיפת המים ולחצו על כפתור ההזרקה כדי להפיג את נוזל הבלסטוקול למים.
    1. לחלופין, להוציא את הנוזל ישירות על parafilm, אבל במקרה זה, דופק את כפתור ההזרקה במקום להחזיק אותו. זה מגרש את הנוזל תחת לחץ נמוך יותר, מונע ממנו לשטח על parafilm, מה שמקשה לצייר בפיפטה.
  8. מעבירים את נוזל הבלסטוקול לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי על הקרח. צפו לקצור כ 0.3-0.5 μL של נוזל blastocoele לכל עובר. הוסף מים ללא גרעין כדי להתאים את הנפח הסופי ל 30 μL.
  9. מעבירים את העוברים המרוקנים מנוזלי הפיצוץ לצינור נפרד על קרח. הסר עודף 0.1x MBS ולהוסיף 200 μL של חוצץ עובר צונן (4 °C) (10 μL לכל עובר)(טבלה 1). פיפטה העוברים למעלה ולמטה 10-20 פעמים באמצעות מיקרופיט עד שהם הומוגניים לחלוטין ולא נותרו גושים.
  10. צנטריפוגה העוברים הומוגניים במיקרוצנטריפוגה בקירור ב 10,000 x g במשך 10 דקות. הסר 160 μL של supernatant באמצעות פיפטה P200 ולהעביר צינור חדש על קרח, נזהר כדי למנוע את חלבוני החלמון הלבן ופסולת תאית אחרת בחלק התחתון של הצינור.
    1. חזור על המיקרו-צנטריפוגה פעם אחת והעבר 128 מיקרו-אל של הסופר-נט השקוף לצינור חדש על הקרח. בשלב זה, עובר מנוקה lysates ונוזל blastocoele ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) כל עוד תרצה.
      הערה: עם כמה יוצאים מן הכלל, חלבונים מבשר Tgfß אינם מופרשים לתוך blastocoele והם יזוהו רק בליסאטים העוברים המדולדלים. לעומת זאת, מוצרי המחשוף המשפחתי Tgfß נראים בעיקר בנוזל blastocoele. זה מועיל לקצור ולנתח הן את lysates העובר ואת נוזל blastocoele עבור רוב המטרות. לכל הפחות, זה מספק שליטה חיובית כדי להבטיח כי הקדמה תורגמה בחוזקה ויציבה. בנוסף, הוא מאפשר להשוות יחס יחסי בין מוצרי מחשוף למבשרים בין סוגים שונים של בר או חלבונים מוטנטיים, כדי לזהות מוטציות המאפשרות מבשרי שלמים להיות מופרשים לנוזל blastocoele (למשל, מוטציות בתוך מוטיב קונצנזוס המחשב המאפשר קיפול נכון והפרשה ללא מחשוף, ובמקרה זה מבשר שלם מזוהה הן העובר והן בנוזל blastocoele) או מוטציות המייצרות misfolded, חלבונים שאינם ניתנים למחשוף (ובמקרה זה המבשר יזוהה בליסאט העובר, אך מוצרי מחשוף ייעדרו בנוזל blastocoele).
  11. חלבוני Deglycosylate נוכחים בנוזל blastocoele עם PNGase F בשלב זה על ידי ביצוע הוראות היצרן.
    הערה אין צורך deglycosylate חלבונים מבשר נוכח העובר lysate מאז אלה מייצגים רטיקולום אנדופלסמי (ER)-- צורות תושב של הקדמה כי חסרים את המורכב N מקושר אוליגוסכרידים הוסרו על ידי PNGase F. לעומת זאת, מוצרי מחשוף נוכח נוזל blastocoele עברו דרך רשת טרנס-Golgi (TGN) שבו פחמימות משתנות עוד יותר ועכשיו ניתן להסיר על ידי PNGase F. בעקבות deglycosylation, מוצרי מחשוף נודדים כמו רצועה מרוכזת יותר על ג'ל SDS, אשר יכול לסייע הדמיה, כמות וזיהוי מדויק של מוצרי מחשוף. זה לא נדרש בהחלט, אבל זה יכול להיות מועיל, למשל, אם אתה מנסה להבחין בין homodimers והטרודימרים מבוסס על דפוסי הגירה או אם מוצר מחשוף מכיל פחמימות הטרוגניות שגורמות לו לנדוד כמו להקה מטושטשת רחבה.
  12. הוסף 5 μL של הפחתת 4x חוצץ מדגם (טבלה 1) כדי 15 μL של נוזל blastocoele ו 15 μL של ליסאט עובר מובהר. הוסף 5 μL של חיץ מדגם 4x שאינו מפחית (טבלה 1) ל 15 μL הנותרים של נוזל blastocoele. מחממים ל-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים על הקרח.
    הערה: ניתוח חלבונים בתנאים שאינם מפחיתים חיוני כדי לנתח את היווצרותם של ליגנדים הומודימריים או הטרודימריים מאופקים, אך אין צורך בניתוח אתרי מחשוף או רמות של חלבונים מחשופים. עם כמה יוצאים מן הכלל, שברי פרודומיין מופרשים כמו מונומרים. יתר על כן, חלבונים מבשרים הנמצאים בליסאט העובר הם בעיקר נפרשים, מונומרים תושב ER. לכן, אין צורך לנתח מוצרים אלה בתנאים שאינם מפחיתים.
  13. פתור חלבונים קודמים ומוצרי מחשוף על ידי אלקטרופורזה על 15% ג'לים SDS /polyacrylamide.
  14. מעבירים חלבונים מהג'ל לקרום PVDF באמצעות העברה אלקטרופורטית.
  15. דגירה ממברנות עם נוגדנים מתאימים המזהים את הפרודומיין ואת תחום הליגנד (או תגי אפיטופ המוחדרים לתחומים אלה), לשטוף ולדגירה עם נוגדנים משניים מתאימים. דמיינו חלבונים עם כימותרפיה או הדמיה פלואורסצנטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת הניסוי המתוארת להלן הייתה לקבוע אם Bmp4 ו- Bmp7 יוצרים הטרודימרים (עמעום המורכב מליגנד Bmp4 אחד וליגנד Bmp7 אחד), הומודימרים (המורכבים משני ליגנדים Bmp4 או שני Bmp7), או תערובת של כל אחד מהם כאשר הם באים לידי ביטוי ב- X. laevis. נתונים המוצגים באיור 2 מופקים ממחקר שפורסם בעבר10. איור 2A הוא סכמטי המציג מוצרי מחשוף שנוצרו על ידי התבגרות פרוטאוליטית של מבשרים הומודימריים Bmp4 או Bmp7 או מבשרים הטרודימריים Bmp4/7. Bmp4 הוא מקופל בשני אתרים בתוך prodomain כדי ליצור שני שברי פרודומיין (ירוק כהה וצהוב) ושבר ליגנד דימרי אחד (ירוק בהיר) כי נודד ~ 26 kDa על ג'ל SDS-PAGE. Bmp7 הוא בקע באתר אחד כדי ליצור שבר פרודומיין אחד (חום) ושבר ליגנד דימריק אחד (ורוד) כי נודד ~ 35 kDa. ליגנדים הטרודימרים נודדים ב- ~ 30 kDa. פס הכסף בדמרי הליגנד מייצג תג מיק-אפיטופ שנוסף לתחום זה.

מבשרים Bmp4myc או Bmp7myc קידוד RNA (200 pg), או שני RNAs (100 pg של כל אחד) הוזרקו X. laevis עוברים בשלב 2-4 תאים. העוברים היו תרבותיים במשך הלילה בשעה 16 °C (6 °F) עד שהם הגיעו לשלב gastrula מוקדם. בשלב זה, נוזל היה שאף מן blastocele של 20 עוברים בכל קבוצה ומים סטריליים נוספה להביא את הנפח סך של 30 μL. בעקבות deglycosylation, כל דגימה חולקה לשני צינורות. הפחתת מאגר מדגם נוספה לצינור אחד, ומאגר מדגם שאינו מצמצם נוסף לשני. הדגימות היו מחוממות ל 100 °C (5 דקות). חלבונים הופרדו אז על ידי SDS/PAGE ואימונובלטוטים נבדקו עם נוגדנים המזהים את תג המיק-אפיטופ(איור 2B). בתנאים מופחתים, להקה אחת המתאימה למונומרים Bmp4 מבקעים ופס נודד לאט יותר המתאים למונומרים BMP7 מגולגלים זוהו בליזאטים מעוברים המבטאים רק Bmp4 או Bmp7, בהתאמה (איור 2C,D,פאנל תחתון, נתיבים 1, 2). שתי הלהקות התגלו בעוברים המבטאים את Bmp4 ו-Bmp7(איור 2C,D,פאנל תחתון, נתיב 3). כמויות שוות ערך יחסית של מונומרים Bmp4 ו- Bmp7 היו נוכחים בכל אחת משלוש הקבוצות (פאנל תחתון, צמצום). בניסוי זה, כאשר חלבונים הופרדו בתנאים שאינם מפחיתים, זוהתה רצועת הטרודימר אחת בוגרת Bmp4/7 של ניידות ביניים יחד עם כמות זעירה של הומודימר Bmp4 בעוברים המבטאים במשותף Bmp4 ו- Bmp7 (איור 2C,פאנל עליון). מתוצאות אלה אנו מסיקים כי אם רמות שוות ערך של Bmp4 ו Bmp7 חלבונים מבשר באים לידי ביטוי בעוברי קסנופוס, הם מעדיפים ליצור הטרודימרים, ולא כל הומודימר. בניסוי המוצג באיור 2D, באופן משמעותי יותר חלבון Bmp7 קיים ביחס ל-Bmp4 (פאנל תחתון, הפחתת). כתוצאה מכך, בעוברים המבטאים הן חלבונים מבשר Bmp7 ו- Bmp4, הומודימרים Bmp4 אינם מזוהים ובמקום זאת Bmp4 זמין קיים כהטרודימר Bmp4/7, ואת עודף Bmp7 יוצר homodimers. בעוד ניסוי זה אינו אופטימלי, כמו המטרה הייתה להביע במשותף את הכמות המקבילה של מבשר Bmp4 ו Bmp7, התוצאות עדיין עולות בקנה אחד עם המסקנה כי Bmp4 ו Bmp7 מעדיפים ליצור הטרודימרים על פני הומודימר כאשר התבטא במשותף.

Figure 1
איור 1. מחטי הזרקה ושאיפה. תצלומים של מחטים מייצגות שנמשכו אך לא קוצצו (A) נמשכו ונקטעו לשימוש כמחט הזרקה (B) או נמשכו ונקטעו לשימוש כמחט שאיפה (C). החץ וראש החץ ב -A) מציינים את הנקודה שבה הזכוכית נחתכה כדי ליצור מחט להזרקה ושאיפה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. ניתוח של ליגנדים Bmp מבקעים שחולצו מנוזל בלסטוצל X. laevis. (A)מוצרי מחשוף שנוצרו מ Bmp4 ו Bmp7 הומודימרי או הטרודימרי חלבונים מקדימים והטרודימריים ומיקום תג אפיטופ מיק (חטיף כסף) מוצג באופן סכמטי (B)תרשים סכמטי המציג את התזמון של הזרקה ומיצוי נוזל blastocoele. (C-D) עוברי קסנופוס הוזרקו עם 200 pg של Bmp7 או Bmp4 RNA, או עם Bmp4 ו Bmp7 RNA מעורבב יחד (100 pg כל אחד). בשלב הגסטרולה, נוזל הוצא מהבלסטוקול של אותו מספר עוברים בכל קבוצת ניסוי. חלבונים הנמצאים בנוזל הפיצוץ היו deglycosylated והופרדו על ידי SDS-PAGE. נוגדנים שזיהו את תג המיק-אפיטופ שימשו לחקירת חיסונים. המיקום היחסי של מונומרים ודמרי ליגנד חיסוניים מוצג באופן סכמטי מימין לכל ג'ל. קו שחור ב- (C) מציין הסרה של נתיב מתערב על כתם. הנתונים המוצגים מופקים ממחקר שפורסם בעבר10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תמיסה הרכב
0.2% טריקאין 20 גרם של טריקאין מומס במים deionized, להתאים pH ל 7.4 על ידי תוספת של סודיום ביקרבונט
10x MBS 880 מ"מ NaCl, 10 mM KCl, 25 מ"מ NaHCO3, 100 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 מ"מ MgSO4, 0.14 מ"מ Ca (NO3)2, 0.41 מ"מ CaCl2; התאימו ל-pH 7.5 עם NaOH. ניתן לאחסן את מלאי 10x MBS ב-4 °C (75 °F) מדולל לפי הצורך.
2% תמיסה ציסטאין 2 גרם של ציסטאין לכל 100 מ"ל של מים דה-יוניים, כוונון ה-pH ל-7.8-8.0 עם נתרן הידרוקסיד.  הפוך טרי בכל יום.
20x מי הבריכה של דה-בורה 100 מ"מ NaCl, 1.3 מ"מ KCl, 0.44 מ"מ CaCl2; הסתגלו ל-pH 7.4 עם NaHCO3. מלאי 20x של מי הבריכה של DeBoer ניתן לאחסן ב 4 °C (50 °F) מדולל לפי הצורך.
מאגר מדגם 4x שאינו מפחית 200 מ"מ טריס pH 6.8, 8% SDS, 0.4% ברומופנול כחול, 40% גליצריל.
הפחתת מאגר מדגם פי 4 200 מ"מ טריס pH 6.8, 8% SDS, 0.4% ברומופנול כחול, 40% גליצריל, 14.4 M ß-mercaptoethanol
5% פתרון פיקול 25 גרם של פיקול ב 500 מ"ל 0.1x MBS, להתאים את ה- pH ל 7.5 עם נתרן הידרוקסיד.  יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
חוצץ ליסאט עובר 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1% טריטון X-100, 0.1% SDS, 2.5 % NP-40.  יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
גונדוטרופין כוריוני אנושי באמצעות מזרק 3 מ"ל מחובר מחט 19 G, להזריק 2.5 מ"ל של מים סטריליים דרך פקק גומי של מקטור של גונדוטרופין כוריוני אנושי (10,000 IU ). יש לאחסן ב-4 °C (77°F).
מאגר האשכים סרום בקר עוברי 10%, 1% עט/סטרפטוקוקונו (פניצילין 100U/mL, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ב-1x MBS

טבלה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרונות העיקריים לפרוטוקול המתואר כאן הם שניתן להשלים אותו במהירות יחסית, אינו דורש ריאגנטים יקרים ומספק מקור למוצרי מחשוף Tgfß מרוכזים בתנאים פיזיולוגיים. יתרון נוסף הוא שהוא מאפשר לנתח חלבונים מתויגים אפיטופ ובכך לעקוף את המחסור בנוגדנים זמינים מסחרית המזהים את רוב הפרודומיין המשפחתי Tgfß. למרות שניתן גם לנתח את המחשוף של חלבוני Tgfß מבשר מתויגים אפיטופה בתאי יונקים מתורבתים, ישנם מספר יתרונות לשימוש X. laevis. מוקדם X. laevis עוברים לבטא את כל ארבעת בני משפחת PC כי הם מועמדים עבור Tgfß convertases אנדוגני (פורין, Pcsk5, Pcsk6 ו Pcsk7)13,14,16. קווי תאים מסוימים של יונקים אינם מבטאים מחשב אחד או יותר, הדורשים ביטוי חוץ רחמי הן של חלבון מבשר והן של convertase שלו כדי לבחון מחשוף17. שיקול חשוב יותר הוא כי רמות גבוהות מאוד של חלבונים מבשר שנוצרים על ידי transfect ארעי של תאים שעברו טרנספורמציה יכול להוביל לממצאים, כגון הפרשת מוצרי מחשוף misfolded, אשר יכול להתרחש אם רמות מבשר עולה על הקיבולת של בקרת איכות ER18. זה יכול להסוות את ההשפעה של מוטציות מזיקות על עמעום מקדים ומחשוף מאז מוצרי המחשוף misfolded מופיעים בתקשורת תקלות לא יזוהו אלא אם כן הפעילות היא eded. לעומת זאת, ניסויים המשתמשים בעוברי X. laevis מזהים בקלות פגמים בקיפול, מה שמוביל לאובדן מבשר עקב תגובת החלבון המוטעה בחדר המיון או הגירה חריגה של מוצרי מחשוף בתנאים שאינם מפחיתים10,18.

במהלך הליך השאיפה blastocoele, זה חיוני כדי לנסות לחלץ כמות שווה בערך של נוזל blastocoele מכל עובר, במיוחד אם, למשל, המטרה הייתה להשוות מוצרי מחשוף שנוצרו מן סוג בר ומבשרי מוטציה. זהו מדע לא רקקטי אך שאיפה לכמות זמן שווה בערך מכל עובר מסייעת לנרמל את הנפח. בנוסף, שאיפה נוזל ממספר גדול יותר של עוברים בכל קבוצה מסייע לנרמל כל הבדלים בנפח בין עוברים בודדים.

אין ויטרו מחשוף תגובות הן הליך חלופי שניתן להשתמש בו כדי לקבוע אם מוטיב PC מסוים נוכח חלבון מחשוף Tgfß הוא מבקע כדי לזהות ו /או לשלול מחשבים פוטנציאליים כמו convertases אנדוגני עבור מצע נתון. פרוטוקולים קיימים מתארים מבחן פשוט שבו חלבונים מבשרים radiolabeled נוצרים במבחנה, באמצעות רטיקולוציטים ארנב, למשל, או ב vivo, באמצעות X. laevis ביציות. מצעים הם לאחר מכן דגירה במבחנה עם מחשבים רקומביננטיים מועמד ומוצרי מחשוף מנותחים על ידי אלקטרופורזה ואוטורדיוגרפיה19. בעוד פרוטוקול זה מספק דרך מהירה וקלה לקבוע אם חלבון הוא מצע מחשב ולזהות אילו אתרי מחשוף פוטנציאליים מנוצלים ב vivo, חלבונים מבשר אינם צפויים להיות מקופלים כראוי או עמעום ולכן מידע מחשוף המתקבל מניסויים אלה עשוי לא לשקף את מצב vivo.

אחד החסרונות של הפרוטוקול שאנו מתארים כאן הוא שאי אפשר לדמיין חלבון מבשר מקופל ומעומעם כראוי בעוברי X. laevis. הדבר נכון גם במערכות ביטוי חוץ רחמיות אחרות, כגון תאי יונקים שהודבקו באופן חולף, שכן חלבון מבשר מונומרי טמא מצטבר בתוך המיון ברמות גבוהות בהרבה מאשר מבשרים מעומעמים ומקופלים לאחר המיון. המבשר המעומעם נבקע במהירות ומופרש ברגע שהוא עוזב את חדר המיון. אם זה חיוני כדי לנתח עמעום וקיפול של חלבונים מבשר, הליך חלופי שימושי הוא לבחון את הסחר ואת המחשוף של מבשרי radiolabeled ב X. laevis ביציות20. הרגישות הגבוהה של אוטורדיוגרפיה, יחד עם העובדה כי חלבונים לנוע דרך מערכת הפרשה לאט יותר ביציות ממה שהם עושים בתאי יונקים מתורבתים או עוברים מאפשרים אחד לזהות חלבונים מבשרים מעומעם בתוך ביציות ולבדוק אם החלבונים מקופלים כראוי ועזבו את המיון על ידי בחינת מצב הגליקוסילציה שלהם18, 21.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ופשוטה לניתוח מוצרי מחשוף שנוצרו על ידי הבשלת חלבונים מבשרי Tgfß.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למרי סנצ'ז על טיפול מעולה בבעלי חיים. המחקר של המחברים נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH / NICHD) מעניק R01HD067473-08 ו R21 HD102668-01 ועל ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK / NIH) מענק R01DK128068-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L. Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 173
ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של <em>קסנופוס laevis</em> עוברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, H. S., Christian, J. L.… More

Kim, H. S., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter