Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Analys av transformerande tillväxtfaktor ß Familjeklyvningsprodukter utsöndras i Blastocoele av Xenopus laevis embryon

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62782
Automatic Translation
1, 2
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Summary

När Transforming Growth Factor ß familjeprekursorproteiner uttrycks extopiskt i Xenopus laevis embryon, de dimerize, blir klyvda och utsöndras i blastocoele, som börjar i slutet av blastula till tidigt gastrula stadium. Vi beskriver en metod för aspirerande klyvning produkter från blastocoele hålighet för immunoblot analys.

Abstract

De två armarna i superfamiljen Transforming Growth Factor ß (Tgfß), representerade av Tgfß/Nodal eller Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, spelar viktiga roller i embryonal utveckling respektive vuxen homeostas. Medlemmar av Tgfß-familjen tillverkas som inaktiva prekursorer som dimeriserar och viker sig inom det endoplasmatiska retikulumet. Föregångaren klyvs därefter i ligand och prodomain fragment. Även om endast dimeric ligand kan engagera Tgfß receptorer och aktivera nedströms signalering, finns det växande erkännande att prodomain moiety bidrar till ligand aktivitet. I den här artikeln beskrivs ett protokoll som kan användas för att identifiera klyvningsprodukter som genereras under aktivering av Tgfß prekursorproteiner. RNA-kodning Tgfß prekursorer är först mikroinjected i X. laevis embryon. Följande dag samlas klyvningsprodukter in från blastocoele av gastrula-stadiumembryon och analyseras på västerländska blök. Detta protokoll kan slutföras relativt snabbt, kräver inte dyra reagenser och ger en källa till koncentrerade Tgfß klyvningsprodukter under fysiologiska förhållanden.

Introduction

Medlemmar av superfamiljen Transforming Growth Factor ß (Tgfß) syntetiseras som inaktiva, dimeriserade prekursorproteiner. Prekursorerna klyvs sedan av medlemmar av proproteinkonverteringsfamiljen (PC), antingen inom sekretersvägen eller utanför celler. Detta skapar en aktiv, disulfidbunden ligand dimer och två prodomain fragment1. Även om det har varit känt i över 30 år att prodomain av Tgfß familjeprekursorer krävs för att generera en aktiv ligand2, är förståelsen för hur prodomains bidrar till ligand funktion ofullständig.

Även om förståelsen av processen för proteolytisk aktivering av Tgfß familjemedlemmar fortfarande är ofullständig, finns det ett ökande intresse för att förstå vilka PC konsensus motiv som klyvs in vivo, oavsett om klyvningen sker i ett specifikt subcellulärt eller extracellulärt fack, och om prodomänen förblir kovalent eller icke-kovaveriskt associerad med den klyvda ligand3. Flera studier har visat att prodomain inte bara styr ligand vikning föreklyvning 4,5, men kan också påverka tillväxtfaktorstabilitet och handlingsområde6,7,8,9, driva bildandet av homodimers eller heterodimers10, förankra ligand i den extracellulära matrisen för att upprätthålla ligand latens11, och i vissa fall fungera som en ligand i sin egen rätt att aktivera heterolog signalering12. Heterozygous punktmutationer inom prodomänen hos många medlemmar av Tgfß familjen är associerade med öga, ben, njure, skelett eller andra defekter hos människor3. Dessa resultat belyser prodomains kritiska roll för att generera och upprätthålla en aktiv ligand och betonar vikten av att identifiera och dechiffrera rollen av klyvning produkter som utvecklats under proteolytisk mognad av Tgfß familjen föregångare.

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för aspirerande klyvning produkter genereras under mognad av Tgfß familjen prekursorer från blastocoele av X. laevis embryon och sedan analysera dem på immunoblots. Detta protokoll kan användas för att avgöra om ett eller flera PC konsensus motiv i ett prekursorprotein klyvs in vivo10,13, identifiera de endogena PC som klyver varje motiv13,14, jämför in vivo bildandet av Tgfß familjen homodimers kontra heterodimers10 eller analysera om mänskliga sjukdom-associerade punktmutationer i Tgfß prekursorer påverkar deras förmåga att bilda funktionella dimeric ligands.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla beskrivna förfaranden är godkända av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Utah. Grodor är inrymda i en IACUC-godkänd anläggning. Manliga grodor avlivas av nedsänkning i trikain följt genom att klippa hjärtats ventrikel. Kvinnliga grodor är inrymda i laboratoriet i högst 24 timmar efter hormonell induktion av gytning för att möjliggöra äggsamling och sedan återvända till vårdinrättningen.

1. Insamling av X. laevis testikörer

  1. Bedöva en sexuellt mogen hane i 0,2% Tricaine (Tabell 1) i 30-40 min tills djuret inte svarar på klo nypa.
  2. Använd trubbiga tång för att dra bort huden från kroppsväggen. Gör ett horisontellt snitt i huden över underlivet med hjälp av kirurgisk sax. Gör ett parallellt snitt i den underliggande kroppsväggen och sedan ett tredje, vinkelrätt snitt genom kroppsväggen upp genom bröstkorgen.
    1. Vik tillbaka de resulterande klaffarna, lokalisera hjärtats ventrikel och fäst basen för att exsanguinate och säkerställa döden.
  3. Dra ut de gula fettkropparna ur buken med trubbiga tångar och lokalisera testiklar på varje sida, bakom basen av fettkropparna. Ta bort varje testiklar genom att klippa bort den från fettkropparna och eventuella fästa inälvor med kirurgisk sax.
  4. Överför testiklar till en petriskål som innehåller 1x Modifierad Barths lösning (MBS)(tabell 1). Skölj och ta bort eventuella vidhäftande blodkärl eller fäst inälvor.
    1. Överför en testikel till en 35 mm Petri-skål som innehåller testikelbuffert (tabell 1) för omedelbar användning och förvara den andra i ett 10 ml koniskt rör fyllt med testisbuffert för senare användning. Testiker ska förvaras vid 4 °C när de inte används och förbli livskraftiga i minst två veckor.
      OBS: Fotografier av testiklar isolering finns i referens 15.

2. Insamling och befruktning av X. laevis ägg

OBS: Grodor ska hanteras med vinylhandskar eller händer tvättade före och efter hantering av grodorna. Latexhandskar, lotioner och tvättmedelsrester på mänskliga händer kommer att skada grodornas bräckliga hud.

  1. Kvällen före gytning injicera 0,3 ml (1200 IE) av humant korioniskt gonadotropin (tabell 1) i dorsala lymfsäcken hos två eller tre mogna X. laevis honor med en 1 ml spruta utrustad med en 26 G nål. Använd en ny nål för varje injektion.
  2. Efter injektionen, placera honorna i en förseglad behållare (inte lufttät) i en biologisk inkubator på 18 °C. Gytning börjar i allmänhet 14-16 h senare.
    OBS: Plastlådor eller plastbehållare med lufthål i locket fungerar bra för att hålla honor över natten. Se till att locket är på ordentligt för att förhindra att grodor läcker ut och desiccating i inkubatorn.
  3. Håll honan över en 100 mm Petri-skål som innehåller 1x MBS och applicera försiktigt tryck på grodens buk för att utvisa ägg i skålen.
  4. Skär en liten bit av testiklarna (~1/5) med ett rakblad och överför den till ett 1,5 ml-rör som innehåller ~500 μL 1x MBS. Krossa med en pelletspandemin eller vävnadshom homogenisator. Förvara den resulterande spermieupphängningen på is eller vid 4 °C för efterföljande befruktning samma dag.
  5. Luta den 100 mm petriskålen för att hälla av så mycket av 1x MBS som möjligt och ta bort resten med en plastöverföringspipett. Applicera cirka 100 μL spermieupphängning, tillsätt ca 1 ml 0,1x MBS och snurra för att blanda.
    1. Efter 5 min, översvämma skålen med avklorerat kranvatten eller 0,1x MBS och låt stå i 30 min.
      OBS: Vatten kan avkloreras med hjälp av ett filter eller kommunalt kranvatten kan lämnas stående avtäckt i minst 24 timmar för att kloret ska kunna avleda i regioner där konventionellt klor tillsätts i vattnet. I områden där kloramin tillsätts för att desinficera dricksvatten måste vattnet istället behandlas med ett kommersiellt tillgängligt balsam som kan bryta ner kloramin.
      OBS: Ägg samlas i en hög saltlösning (1x MBS) för att förhindra bildandet av en gelébeläggning, vilket skulle utgöra ett hinder för befruktning. Efter befruktning möjliggör den låga saltlösningen (deklorerat vatten eller 0,1x MBS) gelébeläggningsbildning och äggen kommer att hålla fast vid varandra och skålen. Ägg som har befruktats kommer att rotera så att den pigmenterade djurstången vetter uppåt inom 30 minuter. Om detta inte händer, och äggen ser friska ut under mikroskopet, är spermiernas livskraft misstänkt och det kan vara nödvändigt att skörda nya testikörer.
  6. Häll av lösningen som täcker äggen och fyll Petri-skålen med nylagad 2% cysteinlösning(tabell 1). Snurra lösningen i skålen i 3-5 min tills gelébeläggningen är upplöst och äggen inte längre fastnar på varandra eller skålen.
    1. Luta skålen och häll försiktigt av cysteinlösningen eller ta bort med en plastpipett. Ersätt med 1x DeBoers dammvatten (Tabell 1). Snurra för att skölja och dekantcera.
    2. Upprepa en tvätt med DeBoers lösning, en med 0,1x MBS, och fyll på skålen med 0,1x MBS. Efter att ha tagit bort gelébeläggningen blir äggen mer bräckliga och får inte utsättas för luftvätskans gränssnitt.
  7. Flytta de befruktade äggen till en biologisk inkubator på 16 °C eller lämna dem på bänken vid rumstemperatur. Om den lämnas vid rumstemperatur kommer den första klyvningen att uppstå 1-1,5 timmar efter befruktning, och efterföljande klyvningar kommer att uppstå ungefär var 30: e minut. Om embryon däremot inkuberas vid 15-16 °C kommer klyvningar att uppstå ungefär varje timme och det kommer att vara möjligt att injicera ett större antal embryon från en viss lek.

3. Mikroinjektion av X. laevis embryon

  1. Värm och dra glaskapillärer till en fin punkt med hjälp av en mikropipettedragare med följande inställningar: Tvåstegsdragning; Värme 1: 67,4 °C. Värme 2: 62 °C.
    OBS: Dessa inställningar är specifika för mikropipette puller och glas kapillärer som används här (Materialförteckning).
  2. Under ett dissekerande mikroskop, klipp av spetsen på en dragen nål nära slutet med Dumont #5 tång. Nålen ska vara skarp men inte så tunn att spetsen böjer sig när den kommer i kontakt med embryot. Figur 1 visar ett exempel på en lämpligt dragen nål som inte har klippts för mikroinjektion (A) och en som har klippts (B).
  3. Sätt in nålen i en nålhållare som är ansluten till en mikroinjektor. Fäst nålhållaren på en mikromanipulator. Placera 2-4 μL av det täckta syntetiska RNA-kodningen av Tgfß-prekursorproteinet som ska analyseras på en liten bit parafilm under ett dissekerande mikroskop.
    1. Använd mikromanipulatorn, sänk nålen i droppen och använd fyllningsfunktionen på mikroinjektorn för att aspirera RNA i nålen. Var noga med att hålla nålen under droppens yta och titta på framstegen under mikroskopet för att undvika att aspirera luft i nålen.
      OBS: Om antikroppar som känner igen prekursorns prodomän och/eller ligand-domän inte är tillgängliga, kan sekvenskodning av en epitope-tagg (t.ex. V5, myc, Flag) infogas i ramen i cDNA som kommer att användas som mall för RNA-transkription. Det märkta proteinet in vivo-bioaktivitet bör jämföras med det ouppföljda proteinet för att säkerställa att epitopen inte stör korrekt vikning, klyvning eller aktivitet.
  4. Mata ut en droppe RNA-lösningen i luften och mät droppstorleken med hjälp av en mikrometer monterad på injektionssteget eller i mikroskopets okular. Justera droppstorleken till cirka 10 nL med hjälp av tids- och tryckkontrollerna på mikroinjektorn.
    OBS: RNA-koncentrationer i intervallet 5-20 ng/μL är lämpliga för att leverera 50-200 PG RNA till varje embryo. Denna mängd RNA är i allmänhet tillräcklig för att upptäcka klyvningsprodukter i aspirater från 10-20 embryon. Det är bäst att sikta på den lägsta dosen av RNA som ger en detekterbar signal på immunoblots. Högre mängder RNA kan orsaka gastrulation defekter, vilket stör expansionen av blastocoele.
  5. Flytta embryon till en injektionsfat eller bricka som innehåller 5 % Ficoll i 0,1x MBS (tabell 1) när de når 2-4-cellsstadiet. En 35 mm Petri-skål utrustad med en bit nylonnät i botten kan fungera som en billig injektionsfat som håller embryona immobiliserade. Sätt in nålen nära djurstången och injicera 10 nL RNA i en cell i varje embryo.
    OBS: Embryon kan lätt injiceras när som helst mellan ett och 16 cellsteg. Att injicera embryot efter att det har klyvts säkerställer att ägget befruktades och att embryot är friskt. Den exakta platsen för injektionen är inte nödvändig. En mer detaljerad beskrivning av lek, kultur och mikroinjektion av RNAs i X. laevis embryon finns i referens 15.
  6. Överför de injicerade embryona till en 35 mm Petri-skål fylld med 5% Ficoll i 0,1x MBS(tabell 1). Placera de små rätterna i en 150 mm Petri-skål och täck löst med lock för att förhindra att kulturmedierna avdunstar. Kultur embryona över natten på °C 15-16.
    OBS: Odling av embryon i Ficoll hjälper till att läka injektionsstället. Om fina nålar används är odling i 2-3% Ficoll tillräcklig, medan 5% Ficoll föredras om uppenbara skador observeras. Att hålla embryona i Ficoll-lösningen i 1-2 timmar efter injektionen är tillräckligt för att underlätta läkning, men inkubation över natten skadar inte embryot så länge lösningen ändras före gastruleringens början.

4. Blastocoele Utvinning och analys av Tgfß klyvning produkter

  1. Följande morgon efter injektionen, ta bort Ficoll-lösningen och ta bort eventuella döda eller döende embryon. Skölj embryona en eller två gånger med 0,1x MBS och odla embryona i 0,1x MBS på bänken vid rumstemperatur.
    OBS: Embryon kan också återföras till den biologiska inkubatorn på 16 °C för att bromsa utvecklingen.
  2. Värm och dra glaskapillärer till en fin punkt med hjälp av en mikropipettedragare med följande inställningar: Tvåstegsdragning; Värme 1: 67,4 °C. Värme 2: 62 °C.
    OBS: Dessa inställningar är specifika för dragkroken och glaskapillan som används här (Materialförteckning ).
  3. Under ett dissekerande mikroskop, klipp av spetsen på en dragen nål med tång. För att förhindra igensättning bör öppningen av en nål som används för blastocoele-aspiration vara större än i en nål som används för mikroinjektion. Ett exempel på en bra dragen och urklippt nål som ska användas för blastocoele-aspiration visas i figur 1C. Sätt in aspirationsnålen i nålhållaren som är ansluten till en mikroinjektor och fäst nålhållaren på en mikromanipulator.
    OBS: Den optimala nåldiametern bestäms empiriskt genom försök och fel. Nålar med stor diameter fylls för snabbt och gör det mer troligt att cellulärt skräp kommer in i nålen. Däremot kommer nålar med mycket liten diameter sannolikt att bli igensatta. När en lämplig nål har genererats är det användbart att generera flera nålar klippta i samma position.
  4. Placera embryon i en injektionsbricka eller skål fylld med 0,1x MBS när de når det tidiga till mitten av gastrulastadiet (steg 10-11).
  5. Sätt in nålen under embryots yta nära djurstången. Tryck på påfyllningsknappen på mikroskopet medan du tittar genom det dissekerande mikroskopet för att hålla ett öga på nålen och embryot. Under några sekunder kommer nivån av klar vätska att stiga i nålen och embryot kommer att kollapsa och bli konkavt.
    1. Om grumlig vit materia kommer in i nålen, släpp påfyllningsknappen och pulsera insprutningsknappen en eller flera gånger för att mata ut någon grumlig materia, som består av cellulärt skräp som sannolikt kommer att innehålla proteaser.
      OBS: Om blastocoele kollapsar och cellskräp kommer in i nålen så snart påfyllningsknappen trycks in, indikerar detta att öppningen i nålen är för stor. Om blastocoele misslyckas med att kollapsa men vit materia kommer in i nålen omedelbart, visar detta att nålen sattes in för djupt och vidrör blastocoele golvet. Kasta ut den vita materian och flytta till nästa embryo. Aspirationshastigheten kan styras mer noggrant genom att pulsera påfyllningsknappen i stället för att trycka på den kontinuerligt. Detta är särskilt viktigt om öppningen i nålen är större än optimal.
  6. Upprepa steg 4.5 tills vätskan har aspirerades från blastocoele av 10-20 embryon.
    OBS: I allmänhet är blastocoelevätska insugen från 10-20 embryon tillräcklig för att upptäcka klyvningsprodukter på immunoblots. Detta kan dock variera beroende på antikroppskvalitet och måste bestämmas empiriskt.
  7. Placera en bit paraffin på injektionsbrickan och pipetten 1 μL nukleasfritt vatten på den. Sänk ner nålen under vattendroppen och tryck på insprutningsknappen för att skingra blastocoelevätskan i vattnet.
    1. Alternativt kan du mata ut vätskan direkt på parafilmen, men i det här fallet pulsera insprutningsknappen i stället för att hålla ner den. Detta utvisar vätskan under lägre tryck, vilket förhindrar att den planar ut på parafilmen, vilket gör det svårt att dra upp i en pipett.
  8. Överför blastocoelevätskan till ett sterilt mikrocentrifugrör på is. Räkna med att skörda cirka 0,3-0,5 μL blastocoelevätska per embryo. Tillsätt nukleasfritt vatten för att justera den slutliga volymen till 30 μL.
  9. Överför de blastocoele vätskeutarmade embryona till ett separat rör på is. Avlägsna överskott av 0,1x MBS och tillsätt 200 μL kyld (4 °C) embryolyatbuffert (10 μL per embryo) (tabell 1). Pipett embryona upp och ner 10-20 gånger med en mikropipett tills de är helt homogeniserade och inga klumpar återstår.
  10. Centrifugera de homogeniserade embryona i en kyld mikrocentrifug vid 10 000 x g i 10 min. Ta bort 160 μL av supernatanten med en P200-pipett och överför till ett nytt rör på is, var noga med att undvika de vita äggulaproteinerna och annat cellulärt skräp i den nedre halvan av röret.
    1. Upprepa mikrocentrifugationen en gång och överför 128 μL av det klara supernatanten till ett nytt rör på is. Vid denna tidpunkt kan rensade embryolyater och blastocoelevätska lagras vid -80 °C så länge som önskas.
      OBS: Med några få undantag utsöndras inte Tgfß prekursorproteiner i blastocoele och kommer endast att detekteras i de utarmade embryolyaterna. Däremot ses Tgfß familjeklyvningsprodukter främst i blastocoelevätskan. Det är bra att skörda och analysera både embryolyaterna och blastocoelevätskan för de flesta ändamål. Detta ger åtminstone en positiv kontroll för att säkerställa att föregångaren var robust översatt och stabil. Dessutom tillåter det en att jämföra relativa förhållanden mellan klyvningsprodukter med prekursorer mellan olika vilda eller muterade proteiner, för att identifiera mutationer som gör det möjligt att utsöndra intakta prekursorer i blastocoelevätska (t.ex. mutationer inom PC-konsensusmotivet som möjliggör korrekt vikning och utsöndring utan klyvning, i vilket fall den intakta föregångaren detekteras i både embryot och blastocoelevätskan) eller mutationer som genererar felveckade, icke-klyvbara proteiner (i vilket fall föregångaren kommer att detekteras i embryolyat, men klyvningsprodukter kommer att saknas i blastocoelevätskan).
  11. Deglykosylatproteiner som finns i blastocoelevätska med PNGase F vid denna tidpunkt genom att följa tillverkarens instruktioner.
    OBS Det finns inget behov av att deglykosylera prekursorproteiner som finns i embryolysatet eftersom dessa representerar endoplasmatisk retikulum (ER)--bosatta former av föregångaren som saknar de komplexa N-länkade oligosackarider som avlägsnats av PNGase F. Däremot har klyvningsprodukter som finns i blastocoelevätska rört sig genom trans-Golgi-nätverket (TGN) där kolhydrater modifieras ytterligare och nu kan avlägsnas av PNGase F. Efter deglykosylering migrerar klyvningsprodukter som ett mer tätt kondenserat band på SDS-geler, vilket kan bidra till att visualisera, kvantifiera och exakt identifiera klyvningsprodukter. Detta är inte strikt nödvändigt, men det kan vara till hjälp, till exempel om du försöker skilja mellan homodimers och heterodimers baserat på migreringsmönster eller om en klyvningsprodukt innehåller heterogena kolhydrater som gör att den migrerar som ett brett luddigt band.
  12. Tillsätt 5 μL reducerande 4x provbuffert (tabell 1) till 15 μL blastocoelevätska och 15 μL klar embryolyat. Tillsätt 5 μL icke-reducerande 4x provbuffert (tabell 1) till resterande 15 μL blastocoelevätska. Värm till 100 °C i 5 min och lägg på is.
    OBS: Att analysera proteiner under icke-reducerande förhållanden är viktigt för att analysera bildandet av klyvda homodimeriska eller heterodimeriska ligands men behövs inte om man bara analyserar klyvningsplatser eller nivåer av klyvda proteiner. Med några få undantag utsöndras prodomänfragment som monomerer. Dessutom utvecklas prekursorproteiner som finns i embryolyatet främst, ER bosatta monomerer. Således finns det inget behov av att analysera dessa produkter under icke-minskande förhållanden.
  13. Lös prekursorproteiner och klyvningsprodukter med elektrofores på 15% SDS/polyakrylamidgeler.
  14. Överför proteiner från gelén till ett PVDF-membran med hjälp av elektroforesisk överföring.
  15. Inkubera membran med lämpliga antikroppar som känner igen domänen prodomän och ligand (eller epitoptaggar som sätts in i dessa domäner), tvätta och inkubera med rätt sekundära antikroppar. Visualisera proteiner med chemiluminescens eller fluorescerande avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Experimentets mål som beskrivs nedan var att avgöra om Bmp4 och Bmp7 bildar heterodimers (dimers bestående av en Bmp4 ligand och en Bmp7 ligand), homodimers (bestående av två Bmp4 eller två Bmp7 ligands), eller en blandning av var och en när de är samp uttryckta i X. laevis. Data som visas i figur 2 extraheras från en tidigare publicerad studie10. Figur 2A är ett schema som visar klyvningsprodukter som genereras av proteolytisk mognad av Bmp4- eller Bmp7-homodimeriska prekursorer eller Bmp4/7 heterodimeriska prekursorer. Bmp4 klyvs på två platser inom prodomänen för att generera två prodomänfragment (mörkgröna och gula) och ett dimeriskt ligandfragment (ljusgrönt) som migrerar vid ~ 26 kDa på SDS-PAGE geler. Bmp7 klyvs på en enda plats för att generera ett prodomänfragment (rödbrunt) och ett dimeriskt ligandfragment (rosa) som migrerar vid ~ 35 kDa. Heterodimeric ligands migrerar på ~ 30 kDa. Silverstången i ligand dimers representerar en myc-epitope-tagg som sätts in i denna domän.

RNA-kodning Bmp4myc eller Bmp7myc prekursorer (200 pg), eller båda RNAs (100 pg av varje) injicerades i X. laevis embryon i 2-4 cellstadiet. Embryona odlades över natten vid 16 °C tills de nådde det tidiga gastrulastadiet. Vid denna tidpunkt aspirerades vätska från blastocele av 20 embryon i varje grupp och sterilt vatten tillsattes för att få volymen till totalt 30 μL. Efter deglykosylering delades varje prov upp i två rör. En minskning av provbufferten lades till i ett rör och den icke-minskande provbufferten lades till i det andra. Proverna värmdes upp till 100 °C i 5 min. Proteiner separerades sedan av SDS/PAGE och immunoblots undersöktes med antikroppar som känner igen myc-epitope-taggen (Figur 2B). Under minskande förhållanden upptäcktes ett enda band som motsvarar klyvda Bmp4 monomerer och ett långsammare migrerande band motsvarande klyvda BMP7 monomerer i lysater från embryon som endast uttrycker Bmp4 respektive Bmp7 (figur 2C, D,nedre panel, körfält 1, 2). Båda banden upptäcktes i embryon som uttryckte Bmp4 och Bmp7 (Figur 2C, D, nedre panelen, körfält 3). Relativt lika stora mängder monomerer Bmp4 och Bmp7 fanns i var och en av de tre grupperna (nedre panelen, vilket minskade). I detta experiment, när proteiner separerades under icke-minskande förhållanden, upptäcktes ett enda moget Bmp4/7 heterodimerband av mellanliggande rörlighet tillsammans med en spårmängd Bmp4 homodimer i embryon som uttrycker Bmp4 och Bmp7(figur 2C, övre panelen). Av dessa resultat drar vi slutsatsen att om motsvarande nivåer av Bmp4 och Bmp7 föregångare proteiner uttrycks i Xenopus embryon, bildar de företrädesvis heterodimers, snarare än någon av homodimer. I experimentet som visas i figur 2Dfinns betydligt mer Bmp7-protein i förhållande till Bmp4 (nedre panelen, vilket minskar). Som ett resultat, i embryon som uttrycker både Bmp7 och Bmp4 föregångare proteiner, Bmp4 homodimers upptäcks inte och istället den tillgängliga Bmp4 är närvarande som en Bmp4/7 heterodimer, och överskott Bmp7 bildar homodimers. Även om detta experiment inte är optimalt, eftersom målet var att samexpressera motsvarande mängd Bmp4 och Bmp7 föregångare, är resultaten fortfarande förenliga med slutsatsen att Bmp4 och Bmp7 företrädesvis bildar heterodimers över antingen homodimer när de uttrycks tillsammans.

Figure 1
Figur 1. Injektions- och aspirationsnålar. Fotografier av representativa nålar som har dragits men inte klippts (A) dragits och klippts för användning som injektionsnål(B)eller dragits och klippts för användning som aspirationsnål(C)visas. Pilen och pilspetseni ( A) anger vid vilken punkt glaset klipptes för att generera en nål för injektion respektive aspiration. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. Analys av klyvda Bmp ligands extraheras från X. laevis blastocele vätska. A)Klyvningsprodukter som genereras av homodimeriska eller heterodimeriska prekursorproteiner Bmp4 och Bmp7 och myc epitope tag (silverstång) visas schematiskt (B) Schematiskt diagram som visar tidpunkten för injektion och blastocoele extraktion. (C-D) Xenopus embryon injicerades med 200 pg av Bmp7 eller Bmp4 RNA, eller med Bmp4 och Bmp7 RNA blandas ihop (100 pg vardera). På gastrulastadiet extraherades vätska från blastocoele av samma antal embryon i varje experimentell grupp. Proteiner som finns i blastocoele vätska var deglycosylated och separeras av SDS-PAGE. Antikroppar som känner igen myc-epitope taggen användes för att sond immunoblots. Den relativa positionen för immunoreactive ligand monomerer och dimers visas schematiskt till höger om varje gel. Svart linje i (C) indikerar avlägsnande av ett mellanliggande körfält på fläcken. Data som visas extraheras från en tidigare publicerad studie10. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Lösning Sammansättning
0.2% Tricaine 20 g Trikain upplöst i avjoniserat vatten, justera pH till 7,4 genom tillsats av natriumbikarbonat
10x MBS 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgSO4,0,14 mM Ca(NO3)2,0,41 mM CaCl2; Justera till pH 7.5 med NaOH. 10x MBS-beståndet kan förvaras vid 4 °C och spädas ut efter behov.
2% cysteinlösning 2 g cystein per 100 ml avjoniserat vatten, justera pH till 7,8-8,0 med natriumhydroxid.  Gör färsk varje dag.
20x DeBoers dammvatten 100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Justera till pH 7.4 med NaHCO3. 20x lager av DeBoers dammvatten kan förvaras vid 4 °C och spädas vid behov.
4x icke-reducerande provbuffert 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% bromophenol blå, 40% glycerol.
4x minskar provbufferten 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% bromophenol blå, 40% glycerol, 14,4 M ß-mercaptoethanol
5% Ficoll-lösning 25 g Ficoll i 500 ml 0,1x MBS, justera pH till 7,5 med natriumhydroxid.  Förvara vid 4 °C.
Embryolyatbuffert 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 2,5 % NP-40.  Förvara vid 4 °C.
Mänskliga chorionic gonadotropin Använd en 3 ml spruta fäst vid en 19 G nål och injicera 2,5 ml sterilt vatten genom gummiproppen på en flaska humant korion gonadotropin (10 000 IE ). Förvaras vid 4 °C.
Testis buffert 10% fetala nötkreatur serum, 1% penna/strep (100U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin i 1x MBS

Tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De främsta fördelarna med protokollet som beskrivs här är att det kan slutföras relativt snabbt, kräver inte dyra reagenser och ger en källa till koncentrerade Tgfß klyvningsprodukter under fysiologiska förhållanden. En annan fördel är att det gör det möjligt att analysera epitopmärkta proteiner och därmed kringgå bristen på kommersiellt tillgängliga antikroppar som känner igen de flesta Tgfß-familjens prodomäner. Även om det också är möjligt att analysera klyvningen av epitopmärkta Tgfß prekursorproteiner i transfekterade odlade däggdjursceller, finns det flera fördelar med att använda X. laevis. Tidiga X. laevis embryon uttrycker alla fyra medlemmar av PC-familjen som är kandidater för endogena Tgfß convertases (Furin, Pcsk5, Pcsk6 och Pcsk7)13,14,16. Vissa däggdjurs cellinjer uttrycker inte en eller flera PC, vilket kräver det ectopic uttrycket av både föregångare proteinet och dess omvandlas för att undersöka klyvning17. En viktigare faktor är att mycket höga nivåer av prekursorproteiner som genereras av transient transfekt av omvandlade celler kan leda till artefakter, såsom utsöndring av felveckade klyvningsprodukter, vilket kan uppstå om prekursornivåerna överstiger kapaciteten för kvalitetskontroll i ER18. Detta kan maskera effekten av skadliga mutationer på prekursor dimerization och klyvning eftersom de felveckade klyvning produkterna visas i media och felfoldering inte skulle upptäckas om inte aktiviteten analyseras. Däremot upptäcker experiment som använder X. laevis-embryon lätt defekter i vikning, vilket leder antingen till förlust av prekursor på grund av felveckat proteinsvar i ER eller avvikande migration av klyvningsprodukter under icke-reducerande förhållanden10,18.

Under blastocoele-aspirationsförfarandet är det viktigt att försöka extrahera en ungefär motsvarande mängd blastocoelevätska från varje embryo, särskilt om målet till exempel var att jämföra klyvningsprodukter som genereras från vilda typer och mutantprekursorer. Detta är en inexakt vetenskap men att aspirera under ungefär lika lång tid från varje embryo hjälper till att normalisera volymen. Dessutom bidrar aspirerande vätska från ett större antal embryon i varje grupp till att normalisera eventuella skillnader i volym mellan enskilda embryon.

In vitro klyvningsreaktioner är ett alternativt förfarande som kan användas för att avgöra om ett visst PC-motiv som finns i ett Tgfß prekursorprotein klyvs och för att identifiera och/eller utesluta potentiella datorer som endogena omvandlare för ett visst substrat. Befintliga protokoll beskriver en enkel analys där radiomärkta prekursorproteiner genereras in vitro, med hjälp av kanin retikulocyter, till exempel, eller in vivo, med X. laevis oocyter. Substrat inkuberas sedan in vitro med kandidatrekombinanta datorer och klyvningsprodukter analyserade av elektrofores och autoradiografi19. Även om detta protokoll ger ett snabbt och enkelt sätt att avgöra om ett protein är ett PC-substrat och för att identifiera vilka potentiella klyvningsplatser som används in vivo, är det osannolikt att prekursorproteinerna är tillräckligt vikta eller dimeriserade och därmed kan klyvningsinformation som erhållits från dessa experiment inte återspegla in vivo-situationen.

En brist i protokollet vi beskriver här är att det är omöjligt att visualisera korrekt vikt, dimeriserat prekursorprotein i X. laevis embryon. Detsamma gäller i andra utomkvedshavandessystem, såsom transientt transfekterade däggdjursceller, eftersom orenat monomeriskt prekursorprotein ackumuleras inom akuten på mycket högre nivåer än dimeriserade och vikta prekursorer efter ER. Den dimeriserade föregångaren klyvs snabbt och utsöndras när den lämnar akuten. Om det är viktigt att analysera dimerisering och vikning av prekursorproteiner, är ett användbart alternativt förfarande att undersöka handel och klyvning av radiomärkta prekursorer i X. laevis oocyter20. Autoradiografins höga känslighet, i kombination med det faktum att proteiner rör sig långsammare genom sekreterarsystemet i äggceller än de gör i odlade däggdjursceller eller embryon, gör det möjligt att upptäcka dimeriserade prekursorproteiner inom äggceller och att testa om proteinerna är ordentligt vikta och har lämnat akuten genom att undersöka deras glykosyleringsstatus18, 21. I artikel 21.1 i eu

Sammanfattningsvis ger detta protokoll en snabb och enkel metod för att analysera klyvningsprodukter som genereras av mognaden av Tgfß familjeprekursorproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Mary Sanchez för utmärkt djurvård. Författarnas forskning stöds av National Institute of Child Health and Human Development of the National Institutes of Health (NIH/NICHD) beviljar R01HD067473-08 och R21 HD102668-01 och av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK/NIH) anslag R01DK128068-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L. Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 173
Analys av transformerande tillväxtfaktor ß Familjeklyvningsprodukter utsöndras i Blastocoele <em>av Xenopus laevis</em> embryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, H. S., Christian, J. L.… More

Kim, H. S., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter