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Developmental Biology

Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons xenopus laevis

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62782
Automatic Translation
1, 2
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Summary

Lorsque les protéines précurseurs de la famille ß du facteur de croissance transformant sont exprimées ectopiquement dans les embryons de Xenopus laevis, elles se dimérisent, se clivent et sont sécrétées dans le blastocoele, qui commence à la fin de la blastula au stade précoce de gastrula. Nous décrivons une méthode d’aspiration des produits de clivage de la cavité blastocoèle pour l’analyse immunoblot.

Abstract

Les deux bras de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß), représentés respectivement par les ligands Tgfß/Nodal ou de la protéine morphogénétique osseuse (Bmp), jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie adulte. Les membres de la famille Tgfß sont fabriqués comme des précurseurs inactifs qui dimérisent et se replient dans le réticulum endoplasmique. Le précurseur est ensuite clivé en fragments de ligand et de prodomaine. Bien que seul le ligand dimérique puisse engager les récepteurs Tgfß et activer la signalisation en aval, il est de plus en plus reconnu que la fraction prodomaine contribue à l’activité du ligand. Cet article décrit un protocole qui peut être utilisé pour identifier les produits de clivage générés lors de l’activation des protéines précurseurs de Tgfß. Les précurseurs de Tgfß codant pour l’ARN sont d’abord microinjectés dans les embryons de X. laevis. Le lendemain, les produits de clivage sont collectés à partir de la blastocoele d’embryons au stade gastrula et analysés sur des transferts Occidentaux. Ce protocole peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques.

Introduction

Les membres de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß) sont synthétisés sous forme de protéines précurseurs dimérisées inactives. Les précurseurs sont ensuite clivés par les membres de la famille des proprotéines convertases (PC), soit dans la voie sécrétoire, soit à l’extérieur des cellules. Cela crée un dimère de ligand actif lié au disulfure et deux fragments de prodomaine1. Bien que l’on sache depuis plus de 30 ans que le prodomaine des précurseurs de la famille Tgfß est nécessaire pour générer un ligand2actif, la compréhension de la façon dont les prodomaines contribuent à la fonction du ligand est incomplète.

Bien que la compréhension du processus d’activation protéolytique des membres de la famille Tgfß reste incomplète, il y a un intérêt croissant à comprendre quel(s) motif(s) de consensus PC sont clivés in vivo,si le clivage se produit dans un compartiment subcellulaire ou extracellulaire spécifique, et si le prodomaine reste covalent ou non associé au ligandclivé 3. Plusieurs études ont montré que le prodomaine non seulement guide le repliement des ligands avant leclivage4,5,mais peut également influencer la stabilité du facteur de croissance et l’amplitude d’action6,7,8,9,conduire la formation d’homodimères ou d’hétérodimères10,ancrer le ligand dans la matrice extracellulaire pour maintenir la latence du ligand11et, dans certains cas, fonctionner comme un ligand à part entière pour activer les hétérologues. signalisation12. Les mutations ponctuelles hétérozygotes au sein du prodomaine de nombreux membres de la famille Tgfß sont associées à des anomalies oculaires, osseuses, rénales, squelettiques ou autres chez l’homme3. Ces résultats soulignent le rôle critique du prodomaine dans la génération et le maintien d’un ligand actif et soulignent l’importance d’identifier et de déchiffrer le rôle des produits de clivage développés au cours de la maturation protéolytique des précurseurs de la famille Tgfß.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour aspirer les produits de clivage générés lors de la maturation des précurseurs de la famille Tgfß à partir du blastocoèle des embryons de X. laevis, puis les analyser sur des immunoblots. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si un ou plusieurs motifs de consensus PC dans une protéine précurseur sont clivés in vivo10,13, identifier le ou les PC endogènes qui clivent chaque motif 13,14, comparer la formation in vivo d’homodimères de la famille Tgfß par rapport aux hétérodimères10 ou analyser si les mutations ponctuelles associées à la maladie humaine dans les précurseurs Tgfß ont un impact sur leur capacité à former des ligands dimériques fonctionnels.

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Protocol

Toutes les procédures décrites sont approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Utah. Les grenouilles sont hébergées dans une installation approuvée par l’IACUC. Les grenouilles mâles sont euthanasiées par immersion dans la tricaïne suivie d’une coupe du ventricule du cœur. Les grenouilles femelles sont hébergées dans le laboratoire pendant un maximum de 24 heures après l’induction hormonale du frai pour permettre la collecte des œufs, puis retournées à l’établissement de soins.

1. Collection de testicules X. laevis

  1. Anesthésier un mâle sexuellement mature dans 0,2% de Tricaine (Tableau 1) pendant 30-40 min jusqu’à ce que l’animal ne réponde pas au pincement des griffes.
  2. Utilisez des pinces contondantes pour éloigner la peau de la paroi du corps. Faites une incision horizontale dans la peau à travers le bas-ventre à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Faites une incision parallèle dans la paroi corporelle sous-jacente, puis une troisième incision perpendiculaire à travers la paroi corporelle à travers la cage thoracique.
    1. Repliez les lambeaux résultants, localisez le ventricule du cœur et coupez la base pour exsanguiner et assurer la mort.
  3. Retirez les corps gras jaunes de l’abdomen avec des pinces contondantes et localisez les testicules de chaque côté, sous-jacents à la base des corps gras. Retirez chaque testicule en l’éloignant des corps gras et de tout viscère attaché à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
  4. Transférer les testicules dans une boîte de Petri contenant 1x solution de Barth modifiée (MBS) (Tableau 1). Rincez et retirez tous les vaisseaux sanguins adhérents ou les viscères attachés.
    1. Transférer un testicule dans une boîte de Petri de 35 mm contenant un tampon testis (Tableau 1) pour une utilisation immédiate et stocker l’autre dans un tube conique de 10 mL rempli de tampon testiculeux pour une utilisation ultérieure. Les testicules doivent être conservés à 4 °C lorsqu’ils ne sont pas utilisés et resteront viables pendant au moins deux semaines.
      REMARQUE : Des photographies de l’isolement des testicules se trouvent dans la référence 15.

2. Collecte et fécondation des œufs de X. laevis

REMARQUE: Les grenouilles doivent être manipulées avec des gants en vinyle ou lavées les mains avant et après avoir manipulé les grenouilles. Les gants en latex, les lotions et les résidus de détergent sur les mains humaines endommageront la peau fragile des grenouilles.

  1. La veille du frai, injecter 0,3 mL (1200 UI) de gonadotrophine chorionique humaine(tableau 1)dans le sac lymphatique dorsal de deux ou trois femelles matures de X. laevis à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G. Utilisez une nouvelle aiguille pour chaque injection.
  2. Après l’injection, placer les femelles dans un récipient scellé (non hermétique) dans un incubateur biologique à 18 °C. Le frai commence généralement 14-16 h plus tard.
    REMARQUE: Les tiroirs en plastique ou les récipients en plastique avec des trous d’air coupés dans le couvercle fonctionnent bien pour retenir les femelles pendant la nuit. Assurez-vous que le couvercle est bien fixé pour empêcher les grenouilles de s’échapper et de se desséchér dans l’incubateur.
  3. Tenez la femelle au-dessus d’une boîte de Petri de 100 mm contenant 1x MBS et appliquez une légère pression sur l’abdomen de la grenouille pour expulser les œufs dans le plat.
  4. Coupez un petit morceau du testicule (~1/5) à l’aide d’une lame de rasoir et transférez-le dans un tube de 1,5 mL contenant ~500 μL de 1x MBS. Écraser avec un pilon à granulés ou un homogénéisateur de tissu. Conservez la suspension de sperme résultante sur de la glace ou à 4 °C pour une fécondation ultérieure le même jour.
  5. Inclinez la boîte de Petri de 100 mm pour verser autant de MBS que possible et retirez le reste à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Appliquer environ 100 μL de suspension de sperme, ajouter environ 1 mL de 0,1x MBS et faire tourbillonner pour mélanger.
    1. Après 5 min, inonder le plat avec de l’eau du robinet déchlorée ou 0,1x MBS et laisser reposer pendant 30 min.
      REMARQUE: L’eau peut être déchlorée à l’aide d’un filtre ou l’eau du robinet municipale peut être laissée à découvert pendant au moins 24 heures pour permettre au chlore de se dissiper dans les régions où du chlore conventionnel est ajouté à l’eau. Dans les zones où la chloramine est ajoutée pour désinfecter l’eau potable, l’eau doit plutôt être traitée avec un conditionneur disponible dans le commerce qui peut décomposer la chloramine.
      REMARQUE: Les œufs sont recueillis dans une solution riche en sel (1x MBS) pour empêcher la formation d’un manteau de gelée, ce qui constituerait une barrière à la fécondation. Après la fécondation, la solution faible en sel (eau déchlorée ou 0,1x MBS) permet la formation d’un manteau de gelée et les œufs adhéreront les uns aux autres et au plat. Les œufs qui ont été fécondés tourneront de telle sorte que le pôle animal pigmenté se tourne vers le haut dans les 30 minutes. Si cela ne se produit pas et que les ovules semblent en bonne santé au microscope, la viabilité des spermatozoïdes est suspecte et il peut être nécessaire de prélever de nouveaux testicules.
  6. Verser la solution recouvrant les œufs et remplir la boîte de Pétri avec une solution de cystéine à 2 % fraîchement préparée (Tableau 1). Faire tourbillonner la solution dans le plat pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce que la couche de gelée soit dissoute et que les œufs ne collent plus les uns aux autres ou au plat.
    1. Inclinez le plat et versez soigneusement la solution de cystéine ou retirez-la avec une pipette en plastique. Remplacer par 1x l’eau de l’étang de DeBoer (Tableau 1). Tourbillonner pour rincer et décanter.
    2. Répétez un lavage avec la solution de DeBoer, un avec 0,1x MBS, et remplissez le plat avec 0,1x MBS. Après avoir enlevé la couche de gelée, les œufs deviennent plus fragiles et ne doivent pas être exposés à l’interface air-liquide.
  7. Déplacez les œufs fécondés dans un incubateur biologique à 16 °C ou laissez-les sur le banc à température ambiante. S’il est laissé à température ambiante, le premier clivage se produira 1 à 1,5 h après la fécondation, et les clivages suivants se produiront environ toutes les 30 minutes. En revanche, si les embryons sont incubés à 15-16 °C, des clivages se produiront environ toutes les heures et il sera possible d’injecter un plus grand nombre d’embryons d’un frai donné.

3. Microinjection d’embryons de X. laevis

  1. Chauffer et tirer les capillaires en verre jusqu’à un point fin à l’aide d’un arracheur de micropipette avec les réglages suivants: Traction en deux étapes; Chauffer 1 : 67,4 °C ; Chauffer 2 : 62 °C.
    REMARQUE: Ces paramètres sont spécifiques pour l’arracheur de micropipette et les capillaires en verre utilisés ici (Table des matériaux).
  2. Sous un microscope à dissection, coupez la pointe d’une aiguille tirée près de l’extrémité à l’aide de la pince Dumont #5. L’aiguille doit être tranchante mais pas si fine que la pointe se plie lorsqu’elle entre en contact avec l’embryon. La figure 1 montre un exemple d’aiguille tirée de manière appropriée qui n’a pas été coupée pour la micro-injection (A) et d’une aiguille qui a été coupée (B).
  3. Insérez l’aiguille dans un porte-aiguille relié à un micro-injecteur. Fixez le porte-aiguille à un micromanipulateur. Placez 2 à 4 μL d’ARN synthétique coiffé codant pour la protéine précurseur de Tgfß à analyser sur un petit morceau de parafilm sous un microscope à disséquer.
    1. À l’aide du micromanipulateur, abaissez l’aiguille dans la goutte et utilisez la fonction de remplissage sur le microinjecteur pour aspirer l’ARN dans l’aiguille. Assurez-vous de garder l’aiguille sous la surface de la goutte et observez les progrès au microscope pour éviter d’aspirer de l’air dans l’aiguille.
      REMARQUE: Si les anticorps qui reconnaissent le domaine prodomaine et / ou ligand du précurseur Tgfß à analyser ne sont pas disponibles, la séquence codant pour une étiquette épitope (par exemple, V5, myc, Flag) peut être insérée dans le cadre dans l’ADNc qui sera utilisé comme modèle pour la transcription de l’ARN. La bioactivité in vivo de la protéine marquée doit être comparée à celle de la protéine non marquée pour s’assurer que l’épitope n’interfère pas avec le repliement, le clivage ou l’activité appropriés.
  4. Éjectez une goutte de la solution d’ARN dans l’air et mesurez la taille de la goutte à l’aide d’un micromètre monté sur l’étage d’injection ou dans l’oculaire du microscope. Ajustez la taille de la goutte à environ 10 nL en utilisant les commandes de temps et de pression sur le micro-injecteur.
    REMARQUE: Des concentrations d’ARN comprises entre 5 et 20 ng / μL sont appropriées pour délivrer 50 à 200 pg d’ARN dans chaque embryon. Cette quantité d’ARN est généralement suffisante pour détecter les produits de clivage dans les aspirations de 10 à 20 embryons. Il est préférable de viser la dose la plus faible d’ARN qui donne un signal détectable sur les immunoblots. Des quantités plus élevées d’ARN peuvent causer des défauts de gastrulation, qui interfèrent avec l’expansion du blastocoele.
  5. Déplacer les embryons dans un bac d’injection ou un plateau contenant 5% de Ficoll dans 0,1x MBS (Tableau 1) lorsqu’ils atteignent le stade 2-4 cellules. Une boîte de Petri de 35 mm équipée d’un morceau de maille de nylon dans le fond peut servir de boîte d’injection peu coûteuse qui maintiendra les embryons immobilisés. Insérez l’aiguille près du pôle animal et injectez 10 nL d’ARN dans une cellule de chaque embryon.
    REMARQUE: Les embryons peuvent facilement être injectés à tout moment entre le stade une et 16 cellules. L’injection de l’embryon après son clivage garantit que l’ovule a été fécondé et que l’embryon est en bonne santé. L’emplacement exact de l’injection n’est pas essentiel. Une description plus détaillée du frai, de la culture et de la microinjection des ARN en embryons de X. laevis se trouve dans la référence 15.
  6. Transférer les embryons injectés dans une boîte de Petri de 35 mm remplie de 5% de Ficoll dans 0,1x MBS (Tableau 1). Placez les petits plats à l’intérieur d’une boîte de Petri de 150 mm et couvrez-les lâchement avec un couvercle pour empêcher le milieu de culture de s’évaporer. Culturez les embryons pendant la nuit à 15-16 °C.
    REMARQUE: La culture d’embryons dans Ficoll aide à guérir le site d’injection. Si des aiguilles fines sont utilisées, la culture dans 2-3% Ficoll est suffisante, tandis que 5% Ficoll est préférable si des dommages apparents sont observés. Garder les embryons dans la solution de Ficoll pendant 1-2 h après l’injection est suffisant pour aider à la guérison, mais l’incubation pendant la nuit n’endommage pas l’embryon tant que la solution est changée avant le début de la gastrulation.

4. Extraction et analyse des produits de clivage Tgfß

  1. Le lendemain matin après l’injection, retirez la solution de Ficoll et retirez tous les embryons morts ou mourants. Rincez les embryons une ou deux fois avec 0,1x MBS et culturez les embryons dans 0,1x MBS sur le banc à température ambiante.
    REMARQUE: Les embryons peuvent également être renvoyés dans l’incubateur biologique à 16 ° C pour ralentir le développement.
  2. Chauffer et tirer les capillaires en verre jusqu’à un point fin à l’aide d’un arracheur de micropipette avec les réglages suivants: Traction en deux étapes; Chauffer 1 : 67,4 °C ; Chauffer 2 : 62 °C.
    REMARQUE: Ces paramètres sont spécifiques pour le puller et le capillaire en verre utilisés ici (Table des matériaux).
  3. Sous un microscope à dissection, coupez la pointe d’une aiguille tirée à l’aide d’une pince. Pour éviter le colmatage, l’ouverture d’une aiguille utilisée pour l’aspiration du blastocoele doit être plus grande que celle d’une aiguille utilisée pour la micro-injection. Un exemple d’une bonne aiguille tirée et clipsée à utiliser pour l’aspiration de blastocoele est illustré à la figure 1C. Insérez l’aiguille d’aspiration dans un porte-aiguille relié à un micro-injecteur et fixez le porte-aiguille à un micromanipulateur.
    REMARQUE: Le diamètre optimal de l’aiguille est déterminé empiriquement par essais et erreurs. Les aiguilles de grand diamètre se remplissent trop rapidement et augmentent la probabilité que des débris cellulaires pénètrent dans l’aiguille. En revanche, les aiguilles de très petit diamètre sont susceptibles de se boucher. Une fois qu’une aiguille appropriée est générée, il est utile de générer plusieurs aiguilles coupées à la même position.
  4. Placer les embryons dans un plateau d’injection ou un plat rempli de 0,1x MBS lorsqu’ils atteignent le stade précoce à moyen de la gastrula (stade 10-11).
  5. Insérez l’aiguille sous la surface de l’embryon près du pôle animal. Appuyez sur le bouton de remplissage du micro-injecteur tout en regardant à travers le microscope à dissection pour garder un œil sur l’aiguille et l’embryon. En quelques secondes, le niveau de liquide clair augmentera dans l’aiguille et l’embryon s’effondrera et deviendra concave.
    1. Si de la substance blanche trouble pénètre dans l’aiguille, lâchez le bouton de remplissage et pulsez le bouton d’injection une ou plusieurs fois pour éjecter toute matière trouble, qui se compose de débris cellulaires susceptibles de contenir des protéases.
      REMARQUE: Si le blastocoele s’effondre et que des débris cellulaires pénètrent dans l’aiguille dès que le bouton de remplissage est enfoncé, cela indique que l’ouverture de l’aiguille est trop grande. Si le blastocoele ne s’effondre pas mais que la substance blanche pénètre immédiatement dans l’aiguille, cela montre que l’aiguille a été insérée trop profondément et touche le plancher du blastocoele. Éjectez la substance blanche et déplacez-vous vers l’embryon suivant. Le taux d’aspiration peut être contrôlé plus soigneusement en pulsant le bouton de remplissage plutôt que d’appuyer dessus en continu. Ceci est particulièrement important si l’ouverture dans l’aiguille est plus grande qu’optimale.
  6. Répétez l’étape 4.5 jusqu’à ce que le liquide ait été aspiré à partir du blastocoèle de 10 à 20 embryons.
    REMARQUE: Généralement, le liquide blastocoèle aspiré à partir de 10 à 20 embryons est suffisant pour détecter les produits de clivage sur les immunoblots. Cependant, cela peut varier en fonction de la qualité des anticorps et doit être déterminé empiriquement.
  7. Placez un morceau de paraffine sur le plateau d’injection et pipetez 1 μL d’eau sans nucléase dessus. Immergez l’aiguille sous la goutte d’eau et appuyez sur le bouton d’injection pour dissiper le liquide blastocoele dans l’eau.
    1. Alternativement, éjectez le fluide directement sur le parafilm, mais dans ce cas, pulsez le bouton d’injection plutôt que de le maintenir enfoncé. Cela expulse le fluide sous une pression plus basse, l’empêchant de s’aplatir sur le parafilm, ce qui le rend difficile à aspirer dans une pipette.
  8. Transférer le liquide blastocoele dans un tube de microcentrifugation stérile sur de la glace. Attendez-vous à prélever environ 0,3 à 0,5 μL de liquide blastocoele par embryon. Ajouter de l’eau sans nucléase pour régler le volume final à 30 μL.
  9. Transférer les embryons appauvris en liquide blastocoèle dans un tube séparé sur de la glace. Retirer l’excès de 0,1x MBS et ajouter 200 μL de tampon de lysate embryonnaire réfrigéré (4 °C) (10 μL par embryon) (Tableau 1). Pipettez les embryons de haut en bas 10 à 20 fois à l’aide d’une micropipette jusqu’à ce qu’ils soient complètement homogénéisés et qu’il ne reste plus de touffes.
  10. Centrifuger les embryons homogénéisés dans une microcentrifugeuse réfrigérée à 10 000 x g pendant 10 min. Retirer 160 μL du surnageant à l’aide d’une pipette P200 et transférer dans un nouveau tube sur glace, en prenant soin d’éviter les protéines de jaune blanc et autres débris cellulaires dans la moitié inférieure du tube.
    1. Répétez la microcentrifugation une fois et transférez 128 μL du surnageant clair dans un nouveau tube sur glace. À ce stade, les lysates embryonnaires et le liquide blastocoèle éliminés peuvent être conservés à -80 °C aussi longtemps que vous le souhaitez.
      REMARQUE: À quelques exceptions près, les protéines précurseurs de Tgfß ne sont pas sécrétées dans le blastocoele et ne seront détectées que dans les lysates embryonnaires épuisés. En revanche, les produits de clivage de la famille Tgfß sont principalement observés dans le liquide blastocoele. Il est utile de prélever et d’analyser à la fois les lysates embryonnaires et le liquide blastocoèle à la plupart des fins. Au minimum, cela fournit un contrôle positif pour s’assurer que le précurseur a été traduit de manière robuste et stable. En outre, il permet de comparer les rapports relatifs des produits de clivage aux précurseurs parmi différents types sauvages ou protéines mutantes, d’identifier des mutations qui permettent de sécrétion de précurseurs intacts dans le liquide blastocoèle (par exemple, des mutations dans le motif de consensus PC qui permettent un repliement et une sécrétion appropriés sans clivage, auquel cas le précurseur intact est détecté à la fois dans l’embryon et le liquide blastocoèle) ou des mutations qui génèrent un mauvais pliage, protéines non clivables (auquel cas le précurseur sera détecté dans le lysate embryonnaire, mais les produits de clivage seront absents dans le liquide blastocoele).
  11. Les protéines déglycosylates sont présentes dans le liquide blastocoèle avec PNGase F à ce stade en suivant les instructions du fabricant.
    NOTE Il n’est pas nécessaire de déglycosyler les protéines précurseurs présentes dans le lysate embryonnaire, car elles représentent des formes endoplasmiques réticulum (ER) du précurseur dépourvues des oligosaccharides complexes liés à l’N éliminés par PNGase F. En revanche, les produits de clivage présents dans le liquide blastocoele se sont déplacés à travers le réseau trans-Golgi (TGN) où les glucides sont encore modifiés et peuvent maintenant être éliminés par PNGase F. Après la déglycosylation, les produits de clivage migrent sous forme de bande plus étroitement condensée sur les gels SDS, ce qui peut aider à visualiser, quantifier et identifier avec précision les produits de clivage. Ce n’est pas strictement nécessaire, mais cela peut être utile, par exemple, si vous essayez de faire la distinction entre homodimères et hétérodimères en fonction des schémas de migration ou si un produit de clivage contient des glucides hétérogènes qui le font migrer comme une large bande floue.
  12. Ajouter 5 μL de tampon d’échantillon réducteur 4x(tableau 1)à 15 μL de liquide blastocoélé et 15 μL de lysate embryonnaire clarifié. Ajouter 5 μL de tampon d’échantillon 4x non réducteur(tableau 1)aux 15 μL restants de liquide blastocoèle. Chauffer à 100 °C pendant 5 min et placer sur de la glace.
    REMARQUE: L’analyse des protéines dans des conditions non réductrices est essentielle pour analyser la formation de ligands homodimériques ou hétérodimériques clivés, mais n’est pas nécessaire si seulement l’analyse des sites de clivage ou des niveaux de protéines clivées. À quelques exceptions près, les fragments de prodomaine sont sécrétés sous forme de monomères. De plus, les protéines précurseurs présentes dans le lysate embryonnaire sont principalement dépliées, des monomères résidents des ER. Ainsi, il n’est pas nécessaire d’analyser ces produits dans des conditions non réductrices.
  13. Résoudre les protéines précurseurs et les produits de clivage par électrophorèse sur des gels SDS/polyacrylamide à 15 %.
  14. Transférer les protéines du gel sur une membrane PVDF en utilisant le transfert électrophorétique.
  15. Incuber les membranes avec des anticorps appropriés qui reconnaissent le prodomaine et le domaine ligand (ou les étiquettes d’épitope insérées dans ces domaines), laver et incuber avec des anticorps secondaires appropriés. Visualisez les protéines avec la chimiluminescence ou l’imagerie fluorescente.

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Representative Results

L’objectif de l’expérience décrit ci-dessous était de déterminer si Bmp4 et Bmp7 forment des hétérodimères (dimères composés d’un ligand Bmp4 et d’un ligand Bmp7), des homodimères (composés de deux ligands Bmp4 ou deux ligands Bmp7), ou un mélange de chacun lorsqu’ils sont co-exprimés dans X. laevis. Les données présentées à la figure 2 sont extraites d’une étude publiée précédemment10. La figure 2A est un schéma montrant les produits de clivage générés par la maturation protéolytique des précurseurs homodimériques Bmp4 ou Bmp7 ou des précurseurs hétérodimériques Bmp4/7. Bmp4 est clivé à deux sites dans le prodomaine pour générer deux fragments de prodomaine (vert foncé et jaune) et un fragment de ligand dimérique (vert clair) qui migre à ~26 kDa sur les gels SDS-PAGE. Bmp7 est clivé sur un seul site pour générer un fragment de prodomaine (marron) et un fragment de ligand dimérique (rose) qui migre à ~35 kDa. Les ligands hétérodimériques migrent à ~30 kDa. La barre d’argent dans les dimères de ligand représente une étiquette myc-épitope insérée dans ce domaine.

Des ARN codant pour les précurseurs de Bmp4myc ou Bmp7myc (200 pg), ou les deux ARN (100 pg de chacun) ont été injectés dans des embryons de X. laevis au stade 2-4 cellules. Les embryons ont été cultivés pendant la nuit à 16 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade précoce de gastrula. À ce stade, du liquide a été aspiré à partir du blastocèle de 20 embryons dans chaque groupe et de l’eau stérile a été ajoutée pour porter le volume à un total de 30 μL. Après la déglycosylation, chaque échantillon a été divisé en deux tubes. Un tampon d’échantillon réducteur a été ajouté à un tube et un tampon d’échantillon non réducteur a été ajouté à l’autre. Les échantillons ont été chauffés à 100 °C pendant 5 min. Les protéines ont ensuite été séparées par SDS/PAGE et les immunoblots ont été sondés avec des anticorps qui reconnaissent la balise myc-épitope (Figure 2B). Dans des conditions réductrices, une seule bande correspondant à des monomères Bmp4 clivés et une bande à migration plus lente correspondant à des monomères BMP7 clivés ont été détectées dans des lysates d’embryons exprimant uniquement Bmp4 ou Bmp7, respectivement (Figure 2C, D, panneau inférieur, voies 1, 2). Les deux bandes ont été détectées chez des embryons co-exprimant Bmp4 et Bmp7(Figure 2C,D,panneau inférieur, voie 3). Des quantités relativement équivalentes de monomères Bmp4 et Bmp7 étaient présentes dans chacun des trois groupes (panneau inférieur, réduction). Dans cette expérience, lorsque les protéines ont été séparées dans des conditions non réductrices, une seule bande hétérodimère mature Bmp4/7 de mobilité intermédiaire a été détectée avec une trace d’homodimère Bmp4 dans des embryons co-exprimant Bmp4 et Bmp7(Figure 2C,panneau supérieur). À partir de ces résultats, nous concluons que si des niveaux équivalents de protéines précurseurs Bmp4 et Bmp7 sont exprimés dans les embryons de Xenopus, ils forment préférentiellement des hétérodimères, plutôt que l’un ou l’autre homodimère. Dans l’expérience montrée à la figure 2D,significativement plus de protéine Bmp7 est présente par rapport à Bmp4 (panneau inférieur, réduction). En conséquence, dans les embryons exprimant à la fois des protéines précurseurs Bmp7 et Bmp4, les homodimères Bmp4 ne sont pas détectés et le Bmp4 disponible est présent sous forme d’hétérodimère Bmp4/7, et l’excès de Bmp7 forme des homodimères. Bien que cette expérience ne soit pas optimale, car l’objectif était de co-exprimer la quantité équivalente de précurseur Bmp4 et Bmp7, les résultats sont toujours cohérents avec la conclusion que Bmp4 et Bmp7 forment préférentiellement des hétérodimères sur l’un ou l’autre homodimère lorsqu’ils sont co-exprimés.

Figure 1
Graphique 1. Aiguilles d’injection et d’aspiration. Des photographies d’aiguilles représentatives qui ont été tirées mais non clipsées (A) tirées et clipsées pour être utilisées comme aiguille d’injection (B) ou tirées et clipsées pour être utilisées comme aiguille d’aspiration (C) sont montrées. La flèche et la pointe de flèche en (A) indiquent le point auquel le verre a été clipsé pour générer une aiguille pour l’injection et l’aspiration, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Analyse des ligands Bmp clivés extraits du liquide blastocèle X. laevis. (A) Les produits de clivage générés à partir des protéines précurseurs homodimériques ou hétérodimériques Bmp4 et Bmp7 et la position de la balise d’épitope myc (barre d’argent) sont représentés schématiquement (B) Diagramme schématique montrant le moment de l’injection et de l’extraction du liquide blastocoele. (C-D) Les embryons de Xenopus ont été injectés avec 200 pg d’ARN Bmp7 ou Bmp4, ou avec de l’ARN Bmp4 et Bmp7 mélangés ensemble (100 pg chacun). Au stade gastrula, le liquide a été extrait du blastocoele du même nombre d’embryons dans chaque groupe expérimental. Les protéines présentes dans le liquide blastocoele ont été déglycosylées et séparées par SDS-PAGE. Des anticorps reconnaissant la marque myc-épitope ont été utilisés pour sonder les immunoblots. La position relative des monomères et des dimères de ligand immunoréactifs est représentée schématiquement à droite de chaque gel. La ligne noire en (C) indique la suppression d’une voie intermédiaire sur le blot. Les données présentées sont extraites d’une étude publiée précédemment10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Solution Composition
0,2 % Tricaïne 20 g de Tricaïne dissous dans de l’eau désionisée, ajuster le pH à 7,4 par addition de bicarbonate de sodium
10x MBS 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgSO4, 0,14 mM Ca(NO3)2, 0,41 mM CaCl2; Ajuster à un pH de 7,5 avec NaOH. Le stock 10x MBS peut être stocké à 4 °C et dilué au besoin.
Solution de cystéine à 2% 2 g de cystéine pour 100 mL d’eau désionisée, ajuster le pH à 7,8-8,0 avec de l’hydroxyde de sodium.  Faire frais chaque jour.
20x l’eau de l’étang de DeBoer 100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Ajuster à pH 7,4 avec NaHCO3. 20x stock d’eau de bassin de DeBoer peut être stocké à 4 ° C et dilué au besoin.
4x tampon d’échantillon non réducteur 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% de bleu de bromophénol, 40% de glycérol.
4x réduction du tampon d’échantillon 200 mM Tris pH 6,8, 8 % SDS, 0,4 % de bleu de bromophénol, 40 % de glycérol, 14,4 M de ß-mercaptoéthanol
Solution Ficoll à 5 % 25 g de Ficoll dans 500 mL 0,1x MBS, ajuster le pH à 7,5 avec de l’hydroxyde de sodium.  Conserver à 4 °C.
Tampon de lysate d’embryon 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 2,5 % NP-40.  Conserver à 4 °C.
Gonadotrophine chorionique humaine À l’aide d’une seringue de 3 mL attachée à une aiguille de 19 G, injecter 2,5 mL d’eau stérile à travers le bouchon en caoutchouc d’un flacon de gonadotrophine chorionique humaine (10 000 UI). Conserver à 4 °C.
Tampon Testis 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de stylo/streptocoque (100U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine dans 1x MBS

Tableau 1.

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Discussion

Les principaux avantages du protocole décrit ici sont qu’il peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques. Un autre avantage est qu’il permet d’analyser les protéines marquées par épitope et de contourner ainsi la pénurie d’anticorps disponibles dans le commerce qui reconnaissent la plupart des prodomaines de la famille Tgfß. Bien qu’il soit également possible d’analyser le clivage des protéines précurseurs de Tgfß marquées par épitope dans des cellules de mammifères en culture transfectées, l’utilisation de X. laevisprésente plusieurs avantages. Les embryons précoces de X. laevis expriment les quatre membres de la famille PC qui sont candidats aux convertases endogènes de Tgfß (Furin, Pcsk5, Pcsk6 et Pcsk7)13,14,16. Certaines lignées cellulaires de mammifères n’expriment pas un ou plusieurs PC, ce qui nécessite l’expression ectopique de la protéine précurseur et de sa convertase pour examiner le clivage17. Une considération plus importante est que des niveaux très élevés de protéines précurseurs générées par le transfect transitoire des cellules transformées peuvent conduire à des artefacts, tels que la sécrétion de produits de clivage mal repliés, qui peuvent se produire si les niveaux de précurseurs dépassent la capacité de contrôle de la qualité dans l’ER18. Cela peut masquer l’effet des mutations délétères sur la dimérisation et le clivage des précurseurs, car les produits de clivage mal repliés apparaissent dans le milieu et un mauvais repliement ne serait pas détecté à moins que l’activité ne soit effectuée. En revanche, les expériences utilisant des embryons de X. laevis détectent facilement des défauts de repliement, conduisant soit à la perte de précurseur due à la réponse protéique mal repliée dans l’ER, soit à une migration aberrante des produits de clivage dans des conditions non réductrices10,18.

Au cours de la procédure d’aspiration des blastocoèles, il est essentiel d’essayer d’extraire une quantité approximativement équivalente de liquide blastocoèle de chaque embryon, en particulier si, par exemple, l’objectif était de comparer les produits de clivage générés à partir de précurseurs de type sauvage et mutants. C’est une science inexacte, mais aspirer pendant une durée à peu près égale à partir de chaque embryon aide à normaliser le volume. En outre, l’aspiration de liquide à partir d’un plus grand nombre d’embryons dans chaque groupe aide à normaliser les différences de volume entre les embryons individuels.

Les réactions de clivage in vitro sont une procédure alternative qui peut être utilisée pour déterminer si un motif PC particulier présent dans une protéine précurseur de Tgfß est clivé et pour identifier et/ou exclure les PC potentiels en tant que convertases endogènes pour un substrat donné. Les protocoles existants décrivent un essai simple dans lequel des protéines précurseurs radiomarquées sont générées in vitro, en utilisant des réticulocytes de lapin, par exemple, ou in vivo, enutilisant des ovocytes de X. laevis. Les substrats sont ensuite incubés in vitro avec des PC recombinants candidats et des produits de clivage analysés par électrophorèse et autoradiographie19. Bien que ce protocole fournisse un moyen rapide et facile de déterminer si une protéine est un substrat PC et d’identifier quels sites de clivage potentiels sont utilisés in vivo,il est peu probable que les protéines précurseurs soient correctement repliées ou dimérisées et, par conséquent, les informations de clivage obtenues à partir de ces expériences peuvent ne pas refléter la situation in vivo.

Une lacune du protocole que nous décrivons ici est qu’il est impossible de visualiser correctement la protéine précurseur dimérisée et repliée dans les embryons de X. laevis. Il en va de même dans d’autres systèmes d’expression ectopique, tels que les cellules de mammifères transfectées transitoirement, car la protéine précurseur monomère uncleaved s’accumule dans l’ER à des niveaux beaucoup plus élevés que les précurseurs dimérisés et repliés post-RE. Le précurseur dimérisé est rapidement clivé et sécrété une fois qu’il quitte l’ER. S’il est essentiel d’analyser la dimérisation et le repliement des protéines précurseurs, une autre procédure utile consiste à examiner le trafic et le clivage des précurseurs radiomarqués dans les ovocytes de X. laevis 20. La grande sensibilité de l’autoradiographie, couplée au fait que les protéines se déplacent dans le système sécrétoire plus lentement dans les ovocytes que dans les cellules ou embryons de mammifères en culture, permet de détecter les protéines précurseurs dimérisées dans les ovocytes et de tester si les protéines sont correctement repliées et ont quitté le RE en examinant leur statut de glycosylation18, 21.

En résumé, ce protocole fournit une méthode rapide et simple pour analyser les produits de clivage générés par la maturation des protéines précurseurs de la famille Tgfß.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Mary Sanchez pour les excellents soins aux animaux. La recherche des auteurs est soutenue par le National Institute of Child Health and Human Development des National Institutes of Health (NIH / NICHD) subventions R01HD067473-08 et R21 HD102668-01 et par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subvention R01DK128068-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

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References

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  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

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Biologie du développement numéro 173
Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons <em>xenopus laevis</em>
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Kim, H. S., Christian, J. L.… More

Kim, H. S., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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