Summary
Quando le proteine precursori della famiglia Transforming Growth Factor ß sono espresse ectopicamente negli embrioni di Xenopus laevis, si dimerizzano, si scindono e vengono secrete nel blastocoele, che inizia nella blastula tardiva fino allo stadio iniziale di gastrula. Descriviamo un metodo per aspirare i prodotti di scissione dalla cavità del blastocoele per l'analisi immunoblot.
Abstract
I due bracci della superfamiglia del fattore di crescita trasformante ß (Tgfß), rappresentati rispettivamente dai ligandi Tgfß/nodali o della proteina morfogenetica ossea (Bmp), svolgono ruoli essenziali nello sviluppo embrionale e nell'omeostasi adulta. I membri della famiglia Tgfß sono fatti come precursori inattivi che dimerizzano e si piegano all'interno del reticolo endoplasmatico. Il precursore viene successivamente scisso in frammenti di ligando e prodominio. Sebbene solo il ligando dimerico possa coinvolgere i recettori Tgfß e attivare la segnalazione a valle, vi è un crescente riconoscimento che la parte del prodominio contribuisce all'attività del ligando. Questo articolo descrive un protocollo che può essere utilizzato per identificare i prodotti di scissione generati durante l'attivazione delle proteine precursori di Tgfß. L'RNA che codifica per i precursori di Tgfß viene prima microiniettato negli embrioni di X. laevis. Il giorno seguente, i prodotti di scissione vengono raccolti dal blastocoele degli embrioni allo stadio di gastrula e analizzati su macchie occidentali. Questo protocollo può essere completato in tempi relativamente brevi, non richiede reagenti costosi e fornisce una fonte di prodotti concentrati di scissione Tgfß in condizioni fisiologiche.
Introduction
I membri della superfamiglia Del fattore di crescita trasformante ß (Tgfß) sono sintetizzati come proteine precursori inattive e dimerizzate. I precursori vengono quindi scissi dai membri della famiglia della proproteina convertasi (PC), sia all'interno della via secretoria che al di fuori delle cellule. Questo crea un dimero di ligando attivo legato al disolfuro e due frammenti di prodominio1. Sebbene sia noto da oltre 30 anni che il prodominio dei precursori della famiglia Tgfß è necessario per generare un ligandoattivo 2, la comprensione di come i prodomini contribuiscono alla funzione del ligando è incompleta.
Sebbene la comprensione del processo di attivazione proteolitica dei membri della famiglia Tgfß rimanga incompleta, vi è un crescente interesse nel capire quali motivi di consenso PC sono scissi in vivo, se la scissione si verifica in uno specifico compartimento subcellulare o extracellulare e se il prodominio rimane covalentemente o non covalentemente associato al ligando scisso3. Diversi studi hanno dimostrato che il prodominio non solo guida il ripiegamento del ligandoprima della scissione4,5,ma può anche influenzare la stabilità del fattore di crescita e il raggio d'azione6,7,8,9,guidare la formazione di omodimeri o eterodimeri10,ancorare il ligando nella matrice extracellulare per mantenere la latenza del ligando11e, in alcuni casi, funzionare come un ligando a sé stante per attivare eterologo segnalazione12. Le mutazioni puntiformi eterozigoti all'interno del prodominio di molti membri della famiglia Tgfß sono associate a difetti oculari, ossei, renali, scheletrici o di altro tiponell'uomo 3. Questi risultati evidenziano il ruolo critico del prodominio nella generazione e nel mantenimento di un ligando attivo e sottolineano l'importanza di identificare e decifrare il ruolo dei prodotti di scissione sviluppati durante la maturazione proteolitica dei precursori della famiglia Tgfß.
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per aspirare i prodotti di scissione generati durante la maturazione dei precursori della famiglia Tgfß dal blastocoele degli embrioni di X. laevis e poi analizzarli su immunoblot. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare se uno o più motivi di consenso PC in una proteina precursore sono scissi in vivo10,13, identificare i PC endogeni che scissono ciascunmotivo 13,14, confrontare la formazione in vivo di omodimeri della famiglia Tgfß rispetto agli eterodimeri10 o analizzare se le mutazioni puntiformi associate alla malattia umana nei precursori di Tgfß influenzano la loro capacità di formare ligandi dimerici funzionali.
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Protocol
Tutte le procedure descritte sono approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dello Utah. Le rane sono ospitate in una struttura approvata dalla IACUC. Le rane maschio vengono eutanasizzate mediante immersione nella tricaina che segue tagliando il ventricolo del cuore. Le rane femmine sono ospitate in laboratorio per un massimo di 24 ore dopo l'induzione ormonale della deposizione delle uova per consentire la raccolta delle uova e quindi restituite alla struttura di cura.
1. Raccolta di testicoli di X. laevis
- Anestetizzare un maschio sessualmente maturo in 0,2% di tricaina (Tabella 1) per 30-40 minuti fino a quando l'animale non risponde al pizzico artiglio.
- Utilizzare una pince smussata per allontanare la pelle dalla parete del corpo. Fare un'incisione orizzontale nella pelle attraverso l'addome inferiore usando le forbici chirurgiche. Fai un'incisione parallela nella parete del corpo sottostante e poi una terza incisione perpendicolare attraverso la parete del corpo attraverso la gabbia toracica.
- Ripiegare i lembi risultanti, individuare il ventricolo del cuore e agganciare la base per dissanguare e garantire la morte.
- Estrarre i corpi grassi gialli dall'addome con una pinffa smussata e individuare i testicoli su ciascun lato, sotto la base dei corpi grassi. Rimuovere ogni testicolo tagliandolo via dai corpi grassi e da eventuali visceri attaccati usando le forbici chirurgiche.
- Trasferire i testicoli in una capsula di Petri contenente 1x Soluzione di Barth modificata (MBS) (Tabella 1). Risciacquare e rimuovere eventuali vasi sanguigni aderenti o visceri attaccati.
- Trasferire un testicolo in una capsula di Petri da 35 mm contenente tampone testicolo (Tabella 1) per un uso immediato e conservare l'altro in un tubo conico da 10 ml riempito con tampone testicolo per un uso successivo. Il testicolo deve essere conservato a 4 °C quando non viene utilizzato e rimarrà vitale per almeno due settimane.
NOTA: le fotografie dell'isolamento dei testicoli sono disponibili nel riferimento 15.
- Trasferire un testicolo in una capsula di Petri da 35 mm contenente tampone testicolo (Tabella 1) per un uso immediato e conservare l'altro in un tubo conico da 10 ml riempito con tampone testicolo per un uso successivo. Il testicolo deve essere conservato a 4 °C quando non viene utilizzato e rimarrà vitale per almeno due settimane.
2. Raccolta e fecondazione delle uova X. laevis
NOTA: le rane devono essere maneggiate con guanti in vinile o le mani lavate prima e dopo aver maneggiato le rane. Guanti in lattice, lozioni e residui di detergenti sulle mani umane danneggeranno la fragile pelle delle rane.
- La sera prima della deposizione delle uova, iniettare 0,3 mL (1200 UI) di gonadotropina corionica umana (Tabella 1) nel sacco linfatico dorsale di due o tre femmine mature di X. laevis utilizzando una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G. Utilizzare un nuovo ago per ogni iniezione.
- Dopo l'iniezione, mettere le femmine in un contenitore sigillato (non ermetico) in un incubatore biologico a 18 °C. La deposizione delle uova inizia generalmente 14-16 ore dopo.
NOTA: i cassetti di plastica o i contenitori di plastica con fori d'aria tagliati nel coperchio funzionano bene per trattenere le femmine durante la notte. Assicurati che il coperchio sia saldamente acceso per evitare che le rane fuoriesceno e si disiccano nell'incubatrice. - Tenere la femmina su una capsula di Petri di 100 mm contenente 1 MBS e applicare una leggera pressione sull'addome della rana per espellere le uova nel piatto.
- Tagliare un piccolo pezzo del testicolo (~1/5) usando una lama di rasoio e trasferirlo in un tubo da 1,5 ml contenente ~ 500 μL di 1x MBS. Schiacciare con un pestello di pellet o un omogeneizzatore di tessuto. Conservare la sospensione spermatica risultante sul ghiaccio o a 4 °C per la successiva fecondazione lo stesso giorno.
- Inclinare la capsula di Petri da 100 mm per versare il più possibile 1 MBS e rimuovere il resto utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Applicare circa 100 μL di sospensione spermatica, aggiungere circa 1 mL di 0,1x MBS e ruotare per mescolare.
- Dopo 5 minuti, inondare il piatto con acqua di rubinetto declorurata o 0,1x MBS e lasciare riposare per 30 minuti.
NOTA: L'acqua può essere declorata utilizzando un filtro o l'acqua del rubinetto comunale può essere lasciata in piedi scoperta per almeno 24 ore per consentire al cloro di dissiparsi nelle regioni in cui il cloro convenzionale viene aggiunto all'acqua. Nelle aree in cui la cloramina viene aggiunta per disinfettare l'acqua potabile, l'acqua deve invece essere trattata con un condizionatore disponibile in commercio in grado di abbattere la cloramina.
NOTA: Le uova vengono raccolte in una soluzione ad alto contenuto di sale (1x MBS) per prevenire la formazione di una gelatina, che fornirebbe una barriera alla fecondazione. Dopo la fecondazione, la soluzione a basso contenuto salino (acqua declorurata o 0,1x MBS) consente la formazione di jelly coat e le uova aderiranno l'una all'altra e al piatto. Le uova che sono state fecondate ruoteranno in modo tale che il palo animale pigmentato sia rivolto verso l'alto entro 30 minuti. Se ciò non accade e le uova sembrano sane al microscopio, la vitalità dello sperma è sospetta e potrebbe essere necessario raccogliere nuovi testicoli.
- Dopo 5 minuti, inondare il piatto con acqua di rubinetto declorurata o 0,1x MBS e lasciare riposare per 30 minuti.
- Versare la soluzione che copre le uova e riempire la capsula di Petri con una soluzione di cisteina al 2% preparata al momento (Tabella 1). Ruotare la soluzione nel piatto per 3-5 minuti fino a quando la gelatina non si scioglie e le uova non si attaccano più l'una all'altra o al piatto.
- Inclinare il piatto e versare con attenzione la soluzione di cisteina o rimuovere con una pipetta di plastica. Sostituire con 1x acqua del laghetto di DeBoer (Tabella 1). Ruotare per risciacquare e decantare.
- Ripetere un lavaggio con la soluzione di DeBoer, uno con 0,1x MBS, e riempire la parabola con 0,1x MBS. Dopo aver rimosso la gelatina, le uova diventano più fragili e non devono essere esposte all'interfaccia aria-liquido.
- Spostare le uova fecondate in un incubatore biologico a 16 °C o lasciarle sul banco a temperatura ambiente. Se lasciato a temperatura ambiente, la prima scissione avverrà 1-1,5 ore dopo la fecondazione e le successive scissioni si verificheranno circa ogni 30 minuti. Al contrario, se gli embrioni vengono incubati a 15-16 °C, le scissioni si verificheranno all'incirca ogni ora e sarà possibile iniettare un numero maggiore di embrioni da una data progenie.
3. Microiniezione di embrioni di X. laevis
- Riscaldare e tirare i capillari di vetro fino a un punto fine utilizzando un estrattore di micropipette con le seguenti impostazioni: trazione in due fasi; Calore 1: 67.4 °C; Calore 2: 62 °C.
NOTA: Queste impostazioni sono specifiche per l'estrattore di micropipette e i capillari di vetro utilizzati qui (Tabella dei materiali). - Sotto un microscopio di dissezione, ritaglia la punta di un ago tirato vicino all'estremità usando la pinna Dumont #5. L'ago deve essere affilato ma non così sottile che la punta si piega quando entra in contatto con l'embrione. La Figura 1 mostra un esempio di ago opportunamente estratto che non è stato tagliato per la microiniezione (A) e uno che è stato tagliato (B).
- Inserire l'ago in un supporto per ago collegato a un microiniettore. Collegare il supporto dell'ago a un micromanipolatore. Posizionare 2-4 μL di RNA sintetico tappato che codifica per la proteina precursore Tgfß da analizzare su un piccolo pezzo di parafilm sotto un microscopio di dissezione.
- Utilizzando il micromanipolatore, abbassare l'ago nella goccia e utilizzare la funzione di riempimento sul microiniettore per aspirare l'RNA nell'ago. Assicurati di tenere l'ago sotto la superficie della goccia e osserva i progressi al microscopio per evitare di aspirare aria nell'ago.
NOTA: Se gli anticorpi che riconoscono il prodominio e/o il dominio del ligando del precursore Tgfß da analizzare non sono disponibili, la sequenza che codifica un tag epitopo (ad esempio, V5, myc, Flag) può essere inserita nel frame nel cDNA che verrà utilizzato come modello per la trascrizione dell'RNA. La bioattività in vivo della proteina marcata deve essere confrontata con quella della proteina senza tag per garantire che l'epitopo non interferisca con il corretto ripiegamento, scissione o attività.
- Utilizzando il micromanipolatore, abbassare l'ago nella goccia e utilizzare la funzione di riempimento sul microiniettore per aspirare l'RNA nell'ago. Assicurati di tenere l'ago sotto la superficie della goccia e osserva i progressi al microscopio per evitare di aspirare aria nell'ago.
- Espellere una goccia della soluzione di RNA nell'aria e misurare la dimensione della goccia utilizzando un micrometro montato sullo stadio di iniezione o nell'oculare del microscopio. Regolare la dimensione della goccia a circa 10 nL utilizzando i controlli di tempo e pressione sul microiniettore.
NOTA: concentrazioni di RNA nell'intervallo 5-20 ng/μL sono appropriate per fornire 50-200 pg di RNA in ciascun embrione. Questa quantità di RNA è generalmente sufficiente per rilevare i prodotti di scissione negli aspirati da 10-20 embrioni. È meglio mirare alla dose più bassa di RNA che dà un segnale rilevabile sugli immunoblot. Quantità più elevate di RNA possono causare difetti di gastrulazione, che interferiscono con l'espansione del blastocoele. - Spostare gli embrioni in un piatto o vassoio contenente il 5% di Ficoll in 0,1x MBS (Tabella 1) quando raggiungono lo stadio di 2-4 cellule. Una capsula di Petri da 35 mm dotata di un pezzo di rete di nylon nella parte inferiore può servire come piatto di iniezione economico che manterrà gli embrioni immobilizzati. Inserire l'ago vicino al polo animale e iniettare 10 nL di RNA in una cellula di ciascun embrione.
NOTA: Gli embrioni possono essere facilmente iniettati in qualsiasi momento tra uno e 16 stadi cellulari. L'iniezione dell'embrione dopo che si è scisso assicura che l'uovo sia stato fecondato e che l'embrione sia sano. La posizione esatta dell'iniezione non è essenziale. Una descrizione più dettagliata della deposizione delle uova, della coltura e della microiniezione di RNA negli embrioni di X. laevis è disponibile nel riferimento 15. - Trasferire gli embrioni iniettati in una capsula di Petri da 35 mm riempita con ficoll al 5% in 0,1x MBS (Tabella 1). Posizionare i piccoli piatti all'interno di una capsula di Petri da 150 mm e coprire liberamente con un coperchio per evitare che il mezzo di coltura evapori. Coltura gli embrioni durante la notte a 15-16 °C.
NOTA: La coltivazione di embrioni in Ficoll aiuta a guarire il sito di iniezione. Se si puoi usare aghi sottili, è sufficiente coltivare in Ficoll al 2-3%, mentre il 5% di Ficoll è preferito se si osserva un danno apparente. Mantenere gli embrioni in soluzione di Ficoll per 1-2 ore dopo l'iniezione è sufficiente per aiutare la guarigione, ma l'incubazione notturna non danneggia l'embrione finché la soluzione viene cambiata prima dell'inizio della gastrulazione.
4. Estrazione e analisi del blastocoele dei prodotti Tgfß Cleavage
- La mattina seguente, dopo l'iniezione, rimuovere la soluzione di Ficoll e rimuovere eventuali embrioni morti o morenti. Risciacquare gli embrioni una o due volte con 0,1x MBS e colturare gli embrioni in 0,1x MBS sul banco a temperatura ambiente.
NOTA: Gli embrioni possono anche essere restituiti all'incubatrice biologica a 16 °C per rallentare lo sviluppo. - Riscaldare e tirare i capillari di vetro fino a un punto fine utilizzando un estrattore di micropipette con le seguenti impostazioni: Trazione a due fasi; Calore 1: 67.4 °C; Calore 2: 62 °C.
NOTA: Queste impostazioni sono specifiche per l'estrattore e il capillare di vetro qui utilizzati (Tabella dei materiali). - Sotto un microscopio sezionante, tagliare la punta di un ago tirato usando una pinna. Per evitare l'intasamento, l'apertura di un ago utilizzato per l'aspirazione del blastocoele deve essere più grande di quella di un ago utilizzato per la microiniezione. Un esempio di un buon ago tirato e tagliato da utilizzare per l'aspirazione del blastocoele è mostrato nella Figura 1C. Inserire l'ago di aspirazione nel supporto dell'ago collegato a un microiniettore e collegare il supporto dell'ago a un micromanipolatore.
NOTA: il diametro ottimale dell'ago è determinato empiricamente per tentativi ed errori. Gli aghi con un grande diametro si riempiono troppo rapidamente e rendono più probabile che i detriti cellulari entrino nell'ago. Al contrario, è probabile che gli aghi di diametro molto piccolo si intasino. Una volta generato un ago appropriato, è utile generare più aghi agganciati nella stessa posizione. - Mettere gli embrioni in un vassoio per iniezione o in un piatto pieno di 0,1 MBS quando raggiungono lo stadio precoce fino alla fase intermedia della gastrula (stadio 10-11).
- Inserire l'ago sotto la superficie dell'embrione vicino al palo animale. Premere il pulsante di riempimento sul microiniettore mentre si guarda attraverso il microscopio di dissezione per tenere d'occhio l'ago e l'embrione. In pochi secondi, il livello di liquido trasparente aumenterà nell'ago e l'embrione collasserà e diventerà concavo.
- Se la sostanza bianca torbida entra nell'ago, lasciare andare il pulsante di riempimento e pulsare il pulsante di iniezione una o più volte per espellere qualsiasi materia torbida, che consiste in detriti cellulari che potrebbero contenere proteasi.
NOTA: se il blastocoele collassa e i detriti cellulari entrano nell'ago non appena viene premuto il pulsante di riempimento, ciò indica che l'apertura nell'ago è troppo grande. Se il blastocoele non riesce a collassare ma la sostanza bianca entra immediatamente nell'ago, questo dimostra che l'ago è stato inserito troppo profondamente e sta toccando il pavimento di blastocoele. Espellere la sostanza bianca e passare all'embrione successivo. La velocità di aspirazione può essere controllata con maggiore attenzione facendo pulsare il pulsante di riempimento piuttosto che premendolo continuamente. Ciò è particolarmente importante se l'apertura nell'ago è più grande di quella ottimale.
- Se la sostanza bianca torbida entra nell'ago, lasciare andare il pulsante di riempimento e pulsare il pulsante di iniezione una o più volte per espellere qualsiasi materia torbida, che consiste in detriti cellulari che potrebbero contenere proteasi.
- Ripetere il passaggio 4.5 fino a quando il fluido non è stato aspirato dal blastocoelo di 10-20 embrioni.
NOTA: Generalmente, il liquido blastocoele aspirato da 10-20 embrioni è sufficiente per rilevare i prodotti di scissione sugli immunoblot. Tuttavia, questo può variare a seconda della qualità degli anticorpi e deve essere determinato empiricamente. - Posizionare un pezzo di paraffina sul vassoio di iniezione e pipettare 1 μL di acqua priva di nucleasi su di esso. Immergere l'ago sotto la goccia d'acqua e premere il pulsante di iniezione per dissipare il liquido blastocoele nell'acqua.
- In alternativa, espellere il fluido direttamente sul parafilm, ma in questo caso, pulsare il pulsante di iniezione piuttosto che tenerlo premuto. Questo espelle il fluido a una pressione inferiore, impedendogli di appiattirsi sul parafilm, rendendo difficile il traino in una pipetta.
- Trasferire il liquido blastocoele in un tubo microcentrifuga sterile su ghiaccio. Aspettatevi di raccogliere circa 0,3-0,5 μL di liquido blastocoele per embrione. Aggiungere acqua priva di nucleasi per regolare il volume finale a 30 μL.
- Trasferire gli embrioni impoveriti di liquido blastocoele in un tubo separato su ghiaccio. Rimuovere l'eccesso di 0,1 MBS e aggiungere 200 μL di tampone di lisato embrionale refrigerato (4 °C) (10 μL per embrione) (Tabella 1). Pipettare gli embrioni su e giù 10-20 volte usando una micropipetta fino a quando non sono completamente omogeneizzati e non rimangono grumi.
- Centrifugare gli embrioni omogeneizzati in una microcentrifuga refrigerata a 10.000 x g per 10 min. Rimuovere 160 μL del surnatante utilizzando una pipetta P200 e trasferirla in un nuovo tubo su ghiaccio, facendo attenzione ad evitare le proteine del tuorlo bianco e altri detriti cellulari nella metà inferiore del tubo.
- Ripetere la microcentrifugazione una volta e trasferire 128 μL del surnatante trasparente in un nuovo tubo su ghiaccio. A questo punto, i lasati embrionali eliminati e il liquido blastocoele possono essere conservati a -80 °C per tutto il tempo desiderato.
NOTA: Con poche eccezioni, le proteine precursori di Tgfß non sono secrete nel blastocoelo e saranno rilevate solo nei lizzati embrionali impoveriti. Al contrario, i prodotti di scissione della famiglia Tgfß sono principalmente visibili nel fluido blastocoele. È utile raccogliere e analizzare sia i lasati embrionali che il liquido blastocoele per la maggior parte degli scopi. Come minimo, questo fornisce un controllo positivo per garantire che il precursore sia stato tradotto in modo robusto e stabile. Inoltre, consente di confrontare i rapporti relativi dei prodotti di scissione con i precursori tra diverse proteine wild type o mutanti, di identificare mutazioni che consentono ai precursori intatti di essere secreti nel liquido blastocoele (ad esempio, mutazioni all'interno del motivo di consenso PC che consentono un corretto ripiegamento e secrezione senza scissione, nel qual caso il precursore intatto viene rilevato sia nell'embrione che nel liquido blastocoele) o mutazioni che generano mal ripiegamento, proteine non scissibili (nel qual caso il precursore verrà rilevato nel lisato embrionale, ma i prodotti di scissione saranno assenti nel liquido blastocoele).
- Ripetere la microcentrifugazione una volta e trasferire 128 μL del surnatante trasparente in un nuovo tubo su ghiaccio. A questo punto, i lasati embrionali eliminati e il liquido blastocoele possono essere conservati a -80 °C per tutto il tempo desiderato.
- Proteine deglicosilate presenti nel liquido blastocoele con PNGasi F a questo punto seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA Non è necessario deglicosilare le proteine precursori presenti nel lisato embrionale poiché queste rappresentano il reticolo endoplasmatico (ER) - forme residenti del precursore che mancano dei complessi oligosaccaridi legati all'N rimossi dalla PNGasi F. Al contrario, i prodotti di scissione presenti nel liquido blastocoele si sono spostati attraverso la rete trans-Golgi (TGN) dove i carboidrati sono ulteriormente modificati e ora possono essere rimossi dalla PNGasi F. Dopo la deglicosilazione, i prodotti di scissione migrano come una banda più strettamente condensata sui gel SDS, che può aiutare a visualizzare, quantificare e identificare con precisione i prodotti di scissione. Questo non è strettamente richiesto, ma può essere utile, ad esempio, se si sta cercando di distinguere tra omodimeri ed eterodimeri in base a modelli di migrazione o se un prodotto di scissione contiene carboidrati eterogenei che lo fanno migrare come un'ampia banda sfocata. - Aggiungere 5 μL di tampone campione riducente 4x (Tabella 1) a 15 μL di liquido blastocoele e 15 μL di lisato embrionale chiarificato. Aggiungere 5 μL di tampone campione 4x non riducente (Tabella 1) ai restanti 15 μL di liquido blastocoele. Riscaldare a 100 °C per 5 minuti e mettere sul ghiaccio.
NOTA: L'analisi delle proteine in condizioni non riducenti è essenziale per analizzare la formazione di ligandi omodimerici o eterodimerici scissi, ma non è necessaria se si analizzano solo i siti di scissione o i livelli di proteine scisse. Con poche eccezioni, i frammenti di prodomain sono secreti come monomeri. Inoltre, le proteine precursori presenti nel llisito embrionale sono principalmente dispiegate, monomeri residenti in ER. Pertanto, non è necessario analizzare questi prodotti in condizioni non riducenti. - Risolvere le proteine precursori e i prodotti di scissione mediante elettroforesi su gel SDS/poliacrilammide al 15%.
- Trasferire le proteine dal gel su una membrana PVDF utilizzando il trasferimento elettroforetico.
- Incubare le membrane con anticorpi appropriati che riconoscano il prodominio e il dominio del ligando (o tag epitopi inseriti in tali domini), lavare e incubare con anticorpi secondari appropriati. Visualizza le proteine con chemiluminescenza o imaging fluorescente.
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Representative Results
L'obiettivo dell'esperimento descritto di seguito era determinare se Bmp4 e Bmp7 formano eterodimeri (dimeri composti da un ligando Bmp4 e un ligando Bmp7), omodimeri (composti da due ligandi Bmp4 o due Bmp7) o una miscela di ciascuno quando sono co-espressi in X. laevis. I dati mostrati nella Figura 2 sono estratti da uno studio precedentemente pubblicato10. La Figura 2A è uno schema che mostra i prodotti di scissione generati dalla maturazione proteolitica dei precursori omodimerici Bmp4 o Bmp7 o dei precursori eterodimerici Bmp4/7. Bmp4 viene scisso in due siti all'interno del prodomain per generare due frammenti di prodomain (verde scuro e giallo) e un frammento di ligando dimerico (verde chiaro) che migra a ~ 26 kDa su gel SDS-PAGE. Bmp7 viene scisso in un singolo sito per generare un frammento di prodominio (marrone) e un frammento di ligando dimerico (rosa) che migra a ~ 35 kDa. I ligandi eterodimerici migrano a ~30 kDa. La barra d'argento nei dimeri del ligando rappresenta un tag myc-epitope inserito in questo dominio.
L'RNA che codifica per i precursori Bmp4myc o Bmp7myc (200 pg), o entrambi gli RNA (100 pg di ciascuno) sono stati iniettati in embrioni di X. laevis allo stadio di 2-4 cellule. Gli embrioni sono stati coltivati durante la notte a 16 °C fino a raggiungere lo stadio precoce di gastrula. A questo punto, il fluido è stato aspirato dal blastocele di 20 embrioni in ciascun gruppo ed è stata aggiunta acqua sterile per portare il volume a un totale di 30 μL. Dopo la deglicosilazione, ogni campione è stato diviso in due provette. Il buffer di campionamento riducente è stato aggiunto a una provetta e il buffer di campione non riducente è stato aggiunto all'altro. I campioni sono stati riscaldati a 100 °C per 5 minuti. Le proteine sono state poi separate da SDS/PAGE e gli immunoblot sono stati sondati con anticorpi che riconoscono il tag myc-epitope (Figura 2B). In condizioni di riduzione, una singola banda corrispondente ai monomeri Bmp4 scissi e una banda a migrazione più lenta corrispondente ai monomeri BMP7 scissi sono stati rilevati in lisati da embrioni che esprimono solo Bmp4 o Bmp7, rispettivamente (Figura 2C, D, pannello inferiore, corsie 1, 2). Entrambe le bande sono state rilevate in embrioni co-espressivi Bmp4 e Bmp7(Figura 2C,D,pannello inferiore, corsia 3). Quantità relativamente equivalenti di monomeri Bmp4 e Bmp7 erano presenti in ciascuno dei tre gruppi (pannello inferiore, riduzione). In questo esperimento, quando le proteine sono state separate in condizioni non riducenti, è stata rilevata una singola banda di eterodimero Bmp4/7 maturo di mobilità intermedia insieme a una traccia di omodimero Bmp4 in embrioni co-espressivi Bmp4 e Bmp7(Figura 2C,pannello superiore). Da questi risultati concludiamo che se livelli equivalenti di proteine precursori Bmp4 e Bmp7 sono espressi negli embrioni di Xenopus, formano preferenzialmente eterodimeri, piuttosto che entrambi omodimeri. Nell'esperimento mostrato in Figura 2D,è presente significativamente più proteina Bmp7 rispetto a Bmp4 (pannello inferiore, riducente). Di conseguenza, negli embrioni che esprimono sia le proteine precursori Bmp7 che Bmp4, gli omodimeri Bmp4 non vengono rilevati e invece il Bmp4 disponibile è presente come eterodimero Bmp4/7 e l'eccesso di Bmp7 forma omodimeri. Mentre questo esperimento non è ottimale, poiché l'obiettivo era quello di co-esprimere la quantità equivalente di precursore Bmp4 e Bmp7, i risultati sono ancora coerenti con la conclusione che Bmp4 e Bmp7 formano preferenzialmente eterodimeri su entrambi gli omodimeri quando co-espressi.
Figura 1. Aghi per iniezione e aspirazione. Vengono mostrate fotografie di aghi rappresentativi che sono stati tirati ma non tagliati (A) tirati e tagliati per l'uso come ago per iniezione (B) o tirati e ritagliati per l'uso come ago di aspirazione (C). La freccia e la punta di freccia in (A) indicano il punto in cui il vetro è stato tagliato per generare un ago per l'iniezione e l'aspirazione, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi di ligandi Bmp scissi estratti dal liquido blastocele X. laevis. (A) I prodotti di scissione generati dalle proteine precursori omodimeriche o eterodimeriche Bmp4 e Bmp7 e la posizione del tag dell'epitopo myc (barra d'argento) sono mostrati schematicamente (B) Diagramma schematico che mostra i tempi di iniezione e di estrazione del liquido blastocoele. (C-D) Gli embrioni di Xenopus sono stati iniettati con 200 pg di RNA Bmp7 o Bmp4, o con RNA Bmp4 e Bmp7 mescolati insieme (100 pg ciascuno). Allo stadio di gastrula, il fluido è stato estratto dal blastocoele dello stesso numero di embrioni in ciascun gruppo sperimentale. Le proteine presenti nel liquido blastocoele sono state deglicosilate e separate da SDS-PAGE. Gli anticorpi che riconoscono il tag myc-epitope sono stati utilizzati per sondare gli immunoblot. La posizione relativa dei monomeri e dei dimeri del ligando immunoreattivo è mostrata schematicamente a destra di ciascun gel. La linea nera in (C) indica la rimozione di una corsia intermedia sulla macchia. I dati mostrati sono estratti da uno studio precedentemente pubblicato10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Composizione |
| 0,2% Tricaina | 20 g di Tricaina disciolta in acqua deionizzata, regolare il pH a 7,4 con l'aggiunta di bicarbonato di sodio |
| 10 MBS | 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgSO4, 0,14 mM Ca(NO3)2, 0,41 mM CaCl2; Regolare a pH 7,5 con NaOH. Lo stock di 10 MBS può essere conservato a 4 °C e diluito secondo necessità. |
| Soluzione di cisteina al 2% | 2 g di cisteina per 100 mL di acqua deionizzata, regolare il pH a 7,8-8,0 con idrossido di sodio. Fai fresco ogni giorno. |
| 20x l'acqua dello stagno di DeBoer | 100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Regolare a pH 7,4 con NaHCO3. 20x stock di acqua del laghetto di DeBoer possono essere immagazzinati a 4 °C e diluiti secondo necessità. |
| 4x buffer campione non riducente | 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% blu bromofenolo, 40% glicerolo. |
| 4x riduzione del buffer del campione | 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% blu bromofenolo, 40% glicerolo, 14,4 M ß-mercaptoetanolo |
| Soluzione Ficoll al 5% | 25 g di Ficoll in 500 mL 0,1x MBS, regolare il pH a 7,5 con idrossido di sodio. Conservare a 4 °C. |
| Tampone di lisi embrionale | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 2,5% NP-40. Conservare a 4 °C. |
| Gonadotropina corionica umana | Utilizzando una siringa da 3 mL attaccata a un ago da 19 G, iniettare 2,5 mL di acqua sterile attraverso il tappo di gomma di una fiala di gonadotropina corionica umana (10.000 UI). Conservare a 4 °C . |
| Tampone testicolo | 10% siero bovino fetale, 1% penna/streptococco (100U/mL penicillina, 100 mg/mL streptomicina in 1x MBS |
Tabella 1.
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Discussion
I principali vantaggi del protocollo qui descritto sono che può essere completato in tempi relativamente brevi, non richiede reagenti costosi e fornisce una fonte di prodotti concentrati di scissione Tgfß in condizioni fisiologiche. Un altro vantaggio è che consente di analizzare le proteine marcate con epitopi e quindi aggirare la carenza di anticorpi disponibili in commercio che riconoscono la maggior parte del prodominio della famiglia Tgfß. Sebbene sia anche possibile analizzare la scissione delle proteine precursori Tgfß marcate con epitopi in cellule di mammifero trasfettate in coltura, ci sono diversi vantaggi nell'usare X. laevis. I primi embrioni di X. laevis esprimono tutti e quattro i membri della famiglia PC che sono candidati per le convertasi endogene di Tgfß (Furin, Pcsk5, Pcsk6 e Pcsk7)13,14,16. Alcune linee cellulari di mammiferi non esprimono uno o più PC, richiedendo l'espressione ectopica sia della proteina precursore che della sua convertasi per esaminare la scissione17. Una considerazione più importante è che livelli molto elevati di proteine precursori generate da trasfetti transitori di cellule trasformate possono portare a artefatti, come la secrezione di prodotti di scissione mal ripiegati, che possono verificarsi se i livelli di precursori superano la capacità di controllo di qualità nell'ER18. Ciò può mascherare l'effetto delle mutazioni deleterie sulla dimerizzazione e la scissione dei precursori poiché i prodotti di scissione mal ripiegati appaiono nei mezzi e il ripiegamento errato non verrebbe rilevato a meno che l'attività non venga analizzata. Al contrario, gli esperimenti che utilizzano embrioni di X. laevis rilevano prontamente difetti nel ripiegamento, portando alla perdita di precursori a causa della risposta proteica mal ripiegata nel ER o alla migrazione aberrante dei prodotti di scissione in condizioni non riducenti10,18.
Durante la procedura di aspirazione del blastocoele, è essenziale cercare di estrarre una quantità approssimativamente equivalente di liquido blastocoele da ciascun embrione, in particolare se, ad esempio, l'obiettivo era quello di confrontare i prodotti di scissione generati da precursori wild type e mutanti. Questa è una scienza inesatta, ma aspirare per un periodo di tempo approssimativamente uguale da ciascun embrione aiuta a normalizzare il volume. Inoltre, aspirare il fluido da un numero maggiore di embrioni in ciascun gruppo aiuta a normalizzare eventuali differenze di volume tra i singoli embrioni.
Le reazioni di scissione in vitro sono una procedura alternativa che può essere utilizzata per determinare se un particolare motivo PC presente in una proteina precursore di Tgfß è scisso e per identificare e/o escludere potenziali PC come convertasi endogene per un dato substrato. I protocolli esistenti descrivono un semplice saggio in cui le proteine precursori radiomarcate vengono generate in vitro, utilizzando reticolociti di coniglio, ad esempio, o in vivo, utilizzando ovociti X. laevis. I substrati vengono quindi incubati in vitro con PC ricombinanti candidati e prodotti di scissione analizzati mediante elettroforesi e autoradiografia19. Mentre questo protocollo fornisce un modo semplice e veloce per determinare se una proteina è un substrato PC e per identificare quali potenziali siti di scissione sono utilizzati in vivo, è improbabile che le proteine precursori siano adeguatamente piegate o dimerizzate e quindi le informazioni di scissione ottenute da questi esperimenti potrebbero non riflettere la situazione in vivo.
Un difetto del protocollo che descriviamo qui è che è impossibile visualizzare una proteina precursore dimerizzata correttamente piegata negli embrioni di X. laevis. Lo stesso vale in altri sistemi di espressione ectopica, come le cellule di mammifero trasfettate transitoriamente, poiché la proteina precursore monomerica uncleaved si accumula all'interno dell'ER a livelli molto più elevati rispetto ai precursori dimerizzati e piegati post-ER. Il precursore dimerizzato viene rapidamente scisso e secreto una volta che lascia il ER. Se è essenziale analizzare la dimerizzazione e il ripiegamento delle proteine precursori, una procedura alternativa utile è quella di esaminare il traffico e la scissione dei precursori radiomarcati negli ovociti X. laevis 20. L'elevata sensibilità dell'autoradiografia, unita al fatto che le proteine si muovono attraverso il sistema secretorio più lentamente negli ovociti di quanto non facciano nelle cellule di mammifero o negli embrioni in coltura, consente di rilevare le proteine precursori dimerizzate all'interno degli ovociti e di verificare se le proteine sono correttamente piegate e hanno lasciato il ER esaminando il loro stato di glicosilazione18, 21.
In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo rapido e diretto per analizzare i prodotti di scissione generati dalla maturazione delle proteine precursori della famiglia Tgfß.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Mary Sanchez per l'eccellente cura degli animali. La ricerca degli autori è sostenuta dal National Institute of Child Health and Human Development del National Institutes of Health (NIH / NICHD) sovvenzioni R01HD067473-08 e R21 HD102668-01 e dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) grant R01DK128068-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
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