Summary
जब विकास कारक को बदलने से परिवार के अग्रदूत प्रोटीन ज़ेनोपस लेविस भ्रूण में व्यक्त किए जाते हैं, तो वे डिमराइज करते हैं, क्लीव हो जाते हैं और ब्लास्टोकोएल में स्रावित होते हैं, जो देर से ब्लास्टुला में शुरू होकर शुरुआती गैस्ट्रूला चरण में शुरू होता है। हम इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए ब्लास्टोकोल गुहा से दरार उत्पादों को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
टीजीएफएस/नोडल या बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) लिगांड्स द्वारा क्रमशः प्रतिनिधित्व किए गए ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर (टीजीएफएस) सुपरफैमिली के दो हथियार भ्रूण विकास और वयस्क होमोस्टेसिस में आवश्यक भूमिकाएं निभाते हैं। टीजीएफके परिवार के सदस्यों को निष्क्रिय अग्रदूत के रूप में बनाया जाता है जो एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम के भीतर मंद और गुना करते हैं। अग्रदूत को बाद में लिगांड और प्रोडोमेन टुकड़ों में छोड़ दिया जाता है। यद्यपि केवल डाइमरिक लिगामेंट Tgfß रिसेप्टर्स को शामिल कर सकता है और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को सक्रिय कर सकता है, इस बात की मान्यता बढ़ रही है कि प्रोडोमेन मोटी लिगांड गतिविधि में योगदान देता है। यह लेख एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग टीजीएफएस अग्रदूत प्रोटीन के सक्रियण के दौरान उत्पन्न क्लीवेज उत्पादों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। आरएनए एन्कोडिंग टीजीएफआर प्रीकर्स पहले एक्स लेविस भ्रूण में माइक्रोइंजेक्टेड होते हैं। अगले दिन, दरार उत्पादों को गैस्ट्रुला चरण भ्रूण के ब्लास्टोकोइल से एकत्र किया जाता है और पश्चिमी ब्लॉट्स पर विश्लेषण किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को अपेक्षाकृत जल्दी पूरा किया जा सकता है, महंगे अभिकर्षकों की आवश्यकता नहीं होती है और शारीरिक परिस्थितियों में केंद्रित Tgfß दरार उत्पादों का स्रोत प्रदान करता है।
Introduction
ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर (टीजीएफएस) सुपरफैमिली के सदस्यों को निष्क्रिय, मंदित अग्रदूत प्रोटीन के रूप में संश्लेषित किया जाता है। अग्रदूत तो प्रॉप्रोटीन कन्वर्टीज (पीसी) परिवार के सदस्यों द्वारा या तो गुप्त मार्ग के भीतर या कोशिकाओं के बाहर क्लीव किया जाता है। यह एक सक्रिय, डिसल्फाइड-बंधुआ लिगर और दो प्रोडोमेन टुकड़े1बनाता है। यद्यपि यह 30 से अधिक वर्षों से जाना जाता है कि टीजीएफएस परिवार अग्रदूतों के प्रोडोमेन को सक्रिय लिगांड2उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है, लेकिन इस बात की समझ अधूरी है कि प्रोडोमेन लिगांड फ़ंक्शन में कैसे योगदान करते हैं।
यद्यपि टीजीएफएस परिवार के सदस्यों की प्रोटियोलिटिक सक्रियण की प्रक्रिया की समझ अधूरी बनी हुई है, लेकिन यह समझने में रुचि बढ़ रही है कि पीसी आम सहमति (एस) वीवो मेंक्लीव किया जाता है, चाहे दरार एक विशिष्ट उपकोशिकीय या बाह्य कोटि के डिब्बे में होती है, और क्या प्रोडोमेन क्लैव्ड लिगे्टेड एनडी3से असंबद्ध या गैर-सहसंयोजक रूप से जुड़ा रहता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि प्रोडोमेन न केवल दरार4, 5से पहले लिगांड तह गाइड करता है, बल्कि विकास कारकस्थिरताऔर कार्रवाई की सीमा को भी प्रभावित कर सकता है6,7,8,9,होमोडिमर्स या हेटेरोडिमर्स10के गठन को चलाता है, लिगांड देर से11,और कुछ मामलों में, लिगांड को बनाए रखने के लिए बाह्य मैट्रिक्स में लिगांड लंगर विषमता को सक्रिय करने के अपने अधिकार में एक लिगामेंट के रूप में कार्य करें सिग्नलिंग12. Tgfß परिवार के कई सदस्यों के प्रोडोमेन के भीतर विषम बिंदु उत्परिवर्तन आंख, हड्डी, गुर्दे, कंकाल या मनुष्यों में अन्य दोषों के साथ जुड़े रहे हैं3। ये निष्कर्ष एक सक्रिय लिगामेंट को उत्पन्न करने और बनाए रखने में प्रोडोमेन की महत्वपूर्ण भूमिका को उजागर करते हैं और टीजीएफएस परिवार अग्रदूतों के प्रोटियोलिटिक परिपक्वता के दौरान विकसित दरार उत्पादों की भूमिका की पहचान करने और समझने के महत्व पर जोर देते हैं।
यहां हम एक्स लेविस भ्रूण के ब्लास्टोकोएल से टीजीएफएस परिवार अग्रदूतों की परिपक्वता के दौरान उत्पन्न दरार उत्पादों को एस्पिर करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और फिर इम्यूनोब्लॉट्स पर उनका विश्लेषण करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या एक अग्रदूत प्रोटीन में एक या अधिक पीसी आम सहमति(एस) वीवो10, 13में क्लीव किए गएहैं,अंतर्जात पीसी (एस) की पहचान करें जो प्रत्येक आकृति13,1 4,टीजीएफएस परिवार होमोसैमर्स बनाम हेट्रोडिमर्स10 के वीवो गठन में तुलना करें या विश्लेषण करें कि टीजीएफएस प्रीकरर्स में मानव रोग से जुड़े बिंदु उत्परिवर्तन कार्यात्मक डाइमेरिक लिगांड बनाने की उनकी क्षमता को प्रभावित करते हैं या नहीं।
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Protocol
वर्णित सभी प्रक्रियाओं को यूटा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाता है । मेंढक एक IACUC अनुमोदित सुविधा में रखे जाते हैं । नर मेंढक हृदय के वेंट्रिकल को क्लिपिंग करके ट्राइकेन में विसर्जन करके इच्छामृत्यु करते हैं। मादा मेंढक अंडे के संग्रह के लिए अनुमति देने के लिए स्पॉन के हार्मोनल प्रेरण के बाद अधिकतम 24 घंटे के लिए प्रयोगशाला में रखे जाते हैं और फिर देखभाल सुविधा में लौट आते हैं।
1. एक्स. लेविस टेस्ट्स का संग्रह
- 30-40 मिनट के लिए 0.2% ट्राइकेन(टेबल 1)में एक यौन परिपक्व पुरुष को एनेस्थेटाइज करें जब तक कि जानवर पंजा चुटकी के लिए अनुत्तरदायी न हो जाए।
- त्वचा को शरीर की दीवार से दूर खींचने के लिए कुंद संदंश का प्रयोग करें। सर्जिकल कैंची का उपयोग कर पेट के निचले हिस्से में त्वचा में एक क्षैतिज चीरा बनाओ। अंतर्निहित शरीर की दीवार में एक समानांतर चीरा बनाओ, और फिर रिब पिंजरे के माध्यम से शरीर की दीवार के माध्यम से एक तिहाई, लंबवत चीरा।
- परिणामी फ्लैप को वापस मोड़ें, दिल के वेंट्रिकल का पता लगाएं और आधार को उत्तेजित करने और मौत सुनिश्चित करने के लिए क्लिप करें।
- पीले वसा शरीर को कुंद संदंश के साथ पेट से बाहर खींचें और वसा निकायों के आधार को अंतर्निहित करते हुए, प्रत्येक तरफ टेस्ट का पता लगाएं। सर्जिकल कैंची का उपयोग कर वसा शरीर और किसी भी संलग्न आंत से दूर कतरन द्वारा प्रत्येक टेस्टिस निकालें।
- 1x संशोधित बार्थ के समाधान (एमबीएस)(टेबल1) युक्त पेट्री डिश में टेस्ट स्थानांतरित करें। कुल्ला और किसी भी अनुयायी रक्त वाहिकाओं या संलग्न आंत को हटा दें।
- एक टेस्टिस को तत्काल उपयोग के लिए टेस्टिस बफर(टेबल 1)युक्त 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और बाद में उपयोग के लिए टेस्टिस बफर से भरे 10 एमएल शंकुनील ट्यूब में दूसरे को स्टोर करें। टेस्टिस का उपयोग नहीं होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और कम से कम दो सप्ताह तक व्यवहार्य रहेगा।
नोट: टेस्ट अलगाव की तस्वीरें संदर्भ 15 में पाया जा सकता है ।
- एक टेस्टिस को तत्काल उपयोग के लिए टेस्टिस बफर(टेबल 1)युक्त 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और बाद में उपयोग के लिए टेस्टिस बफर से भरे 10 एमएल शंकुनील ट्यूब में दूसरे को स्टोर करें। टेस्टिस का उपयोग नहीं होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और कम से कम दो सप्ताह तक व्यवहार्य रहेगा।
2. एक्स. लेविस अंडे का संग्रह और निषेचन
नोट: मेंढक से पहले और मेंढक को संभालने के बाद धोया विनाइल दस्ताने या हाथ के साथ संभाला जाना चाहिए । लेटेक्स दस्ताने, लोशन और मानव हाथों पर डिटर्जेंट अवशेषों मेंढक की नाजुक त्वचा को नुकसान होगा ।
- स्पॉनिंग से पहले शाम को, 26 जी सुई के साथ लगे 1 मिलील सिरिंज का उपयोग करके दो या तीन परिपक्व एक्स. लेविस महिलाओं के पृष्ठीय लिम्फ थैली में मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन(टेबल 1)के 0.3 मिलील (1200 आईयू) इंजेक्ट करें। प्रत्येक इंजेक्शन के लिए एक नई सुई का प्रयोग करें।
- इंजेक्शन के बाद, मादाओं को 18 डिग्री सेल्सियस जैविक इनक्यूबेटर में एक सीलबंद कंटेनर (हवा-तंग नहीं) में रखें। स्पॉनिंग आम तौर पर बाद में 14-16 घंटे शुरू होता है।
नोट: प्लास्टिक दराज या हवा छेद के साथ प्लास्टिक के कंटेनरों के ढक्कन में कटौती महिलाओं को रात भर रखने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं । सुनिश्चित करें कि ढक्कन मजबूती से है ताकि मेंढकों को इनक्यूबेटर में बचने और डिसिकटिंग से रोका जा सके । - 1x एमबीएस युक्त 100 मिमी पेट्री डिश पर मादा को पकड़ें और अंडे को डिश में निष्कासित करने के लिए मेंढक के पेट में कोमल दबाव लागू करें।
- एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके टेस्टिस (~ 1/5) का एक छोटा सा टुकड़ा काटें और इसे 1x एमबीएस के ~ 500 माइक्रोन युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक गोली मूसल या ऊतक समरूपता के साथ क्रश करें। उसी दिन बाद के निषेचन के लिए परिणामी शुक्राणु निलंबन को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 100 मिमी पेट्री डिश को जितना संभव हो उतना 1x एमबीएस बंद करने के लिए झुकाएं, और प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके शेष को हटा दें। शुक्राणु निलंबन के लगभग 100 माइक्रोन लागू करें, मिश्रण करने के लिए 0.1x एमबीएस और भंवर के बारे में 1 मिलीएल जोड़ें।
- 5 मिनट के बाद, डिक्लोरीनेटेड नल के पानी या 0.1x एमबीएस के साथ पकवान बाढ़ और 30 मिनट के लिए खड़े हो जाओ ।
नोट: पानी को फिल्टर या नगरपालिका नल के पानी का उपयोग करके डिक्लोरिनेटेड किया जा सकता है, जहां पारंपरिक क्लोरीन को पानी में जोड़ा जाता है, उन क्षेत्रों में क्लोरीन को नष्ट करने की अनुमति देने के लिए कम से 24 घंटे के लिए खुला खड़ा छोड़ दिया जा सकता है। जिन क्षेत्रों में क्लोरामाइन को कीटाणुरहित पीने के पानी में जोड़ा जाता है, वहां पानी को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कंडीशनर के साथ इलाज किया जाना चाहिए जो क्लोरामाइन को तोड़ सकता है ।
नोट: अंडे एक उच्च नमक समाधान (1x एमबीएस) में एकत्र कर रहे है एक जेली कोट के गठन को रोकने के लिए, जो निषेचन के लिए एक बाधा प्रदान करेगा । निषेचन के बाद, कम नमक समाधान (डिक्लोरीनेटेड पानी या 0.1x एमबीएस) जेली कोट गठन के लिए अनुमति देता है और अंडे एक दूसरे और पकवान का पालन करेंगे। निषेचित किए गए अंडे ऐसे घूमेंगे कि वर्णक पशु ध्रुव 30 मिनट के भीतर ऊपर की ओर सामना करें। यदि ऐसा नहीं होता है, और अंडे माइक्रोस्कोप के नीचे स्वस्थ दिखते हैं, तो शुक्राणु व्यवहार्यता संदिग्ध है और नए वृषण फसल के लिए आवश्यक हो सकता है।
- 5 मिनट के बाद, डिक्लोरीनेटेड नल के पानी या 0.1x एमबीएस के साथ पकवान बाढ़ और 30 मिनट के लिए खड़े हो जाओ ।
- अंडे को कवर करने वाले समाधान को बंद करें और पेट्री डिश को ताजा तैयार 2% सिस्टीन समाधान(टेबल 1)के साथ भरें। 3-5 मिनट के लिए पकवान में समाधान भंवर जब तक जेली कोट भंग कर दिया है और अंडे अब एक दूसरे या पकवान से चिपके हुए हैं ।
- पकवान को झुकाएं और ध्यान से सिस्टीन समाधान डालें, या प्लास्टिक के पिपेट के साथ निकालें। 1x DeBoer के तालाब के पानी(तालिका 1)के साथ बदलें । कुल्ला और डिकंट करने के लिए भंवर।
- डेबोअर के समाधान के साथ एक वॉश दोहराएं, 0.1x एमबीएस के साथ एक, और 0.1x एमबीएस के साथ डिश को फिर से भरें। जेली कोट को हटाने के बाद, अंडे अधिक नाजुक हो जाते हैं और हवा-तरल इंटरफेस के संपर्क में नहीं होना चाहिए।
- निषेचित अंडों को 16 डिग्री सेल्सियस जैविक इनक्यूबेटर में ले जाएं या उन्हें कमरे के तापमान पर बेंच पर छोड़ दें। यदि कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है, तो निषेचन के बाद पहला दरार 1-1.5 घंटे हो जाएगा, और बाद में दरार लगभग हर 30 मिनट में हो जाएगी। इसके विपरीत, यदि भ्रूण 15-16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड होते हैं, तो दरार लगभग हर घंटे हो जाएगी और किसी दिए गए अंडे से बड़ी संख्या में भ्रूण इंजेक्ट करना संभव होगा।
3. एक्स. लेविस भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन
- निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके ग्लास केशिकाओं को एक अच्छे बिंदु पर गर्म और खींचें: दो-चरण पुल; हीट 1: 67.4 डिग्री सेल्सियस; गर्मी 2: 62 डिग्री सेल्सियस।
नोट: ये सेटिंग्स माइक्रोपिपेट पुलर और ग्लास केशिकाओं के लिए विशिष्ट हैं जो यहां उपयोग की जातीहैं (सामग्री की तालिका)। - एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ड्यूमोंट #5 संदंश का उपयोग करके अंत के करीब खींची गई सुई की नोक को क्लिप करें। सुई तेज होनी चाहिए लेकिन इतनी पतली नहीं होनी चाहिए कि जब यह भ्रूण से संपर्क करता है तो टिप झुक जाती है। चित्रा 1 एक उचित रूप से खींची गई सुई का एक उदाहरण दिखाता है जिसे माइक्रोइंजेक्शन (ए) और एक के लिए काटा नहीं गया है जिसे काटा गया है (बी)।
- सुई को माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े सुई धारक में डालें। सुई धारक को माइक्रोमैनीपुलेटर से अटैच करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पैराफिल्म के एक छोटे से टुकड़े पर विश्लेषण करने के लिए टीजीएफएस अग्रदूत प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले कैप्ड सिंथेटिक आरएनए एन्कोडिंग के 2-4 माइक्रोन रखें।
- माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करके, सुई को बूंद में कम करें और सुई में आरएनए को एस्पिरेट करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर पर फिल फ़ंक्शन का उपयोग करें। बूंद की सतह के नीचे सुई रखने के लिए सुनिश्चित करें, और सुई में हवा एस्पिरेशन से बचने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे प्रगति देखो ।
नोट: यदि विश्लेषण किए जाने वाले टीजीएफएस अग्रदूत के प्रोडोमेन और/या लिगांड डोमेन को पहचानने वाले एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, तो एक एपिटोप टैग (जैसे, V5, myc, फ्लैग) को सीडीएनए में इन-फ्रेम में डाला जा सकता है जिसका उपयोग आरएनए ट्रांसक्रिप्टियन के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाएगा। टैग किए गए प्रोटीन की वीवो बायोएक्टिविटी की तुलना बिना टैग वाले प्रोटीन से की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एपिटोप उचित तह, दरार या गतिविधि में हस्तक्षेप न करे।
- माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करके, सुई को बूंद में कम करें और सुई में आरएनए को एस्पिरेट करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर पर फिल फ़ंक्शन का उपयोग करें। बूंद की सतह के नीचे सुई रखने के लिए सुनिश्चित करें, और सुई में हवा एस्पिरेशन से बचने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे प्रगति देखो ।
- आरएनए समाधान की एक बूंद को हवा में बाहर निकालें और इंजेक्शन चरण पर या माइक्रोस्कोप के आईपीस में चढ़कर माइक्रोमीटर का उपयोग करके ड्रॉप आकार को मापें। माइक्रोइंजेक्टर पर समय और दबाव नियंत्रण का उपयोग करते हुए ड्रॉप आकार को लगभग 10 एनएल में समायोजित करें।
नोट: 5-20 एनजी/μL की सीमा में आरएनए सांद्रता प्रत्येक भ्रूण में आरएनए के 50-200 स्नातकोत्तर देने के लिए उपयुक्त हैं । आरएनए की यह मात्रा आम तौर पर 10-20 भ्रूण से एस्पिरेट में दरार उत्पादों का पता लगाने के लिए पर्याप्त है। आरएनए की सबसे कम खुराक के लिए लक्ष्य करना सबसे अच्छा है जो इम्यूनोब्लॉट्स पर एक पता लगाने योग्य संकेत देता है। आरएनए की उच्च मात्रा गैस्ट्रुलेशन दोष पैदा कर सकती है, जो ब्लास्टोकोल के विस्तार में हस्तक्षेप करती है। - भ्रूण को 2-4 सेल चरण तक पहुंचने पर 0.1x एमबीएस(टेबल 1)में 5% फिकोल युक्त इंजेक्शन डिश या ट्रे में ले जाएं। नीचे नायलॉन जाल के एक टुकड़े के साथ लगे एक ३५ मिमी पेट्री डिश एक सस्ती इंजेक्शन पकवान है कि भ्रूण स्थिर रखना होगा के रूप में काम कर सकते हैं । पशु ध्रुव के पास सुई डालें और प्रत्येक भ्रूण की एक कोशिका में आरएनए के 10 एनएल इंजेक्ट करें।
नोट: भ्रूण आसानी से एक और 16 सेल चरणों के बीच किसी भी समय इंजेक्शन किया जा सकता है । भ्रूण को इंजेक्शन लगाने के बाद यह सुनिश्चित करता है कि अंडा निषेचित था और भ्रूण स्वस्थ है । इंजेक्शन की सही लोकेशन जरूरी नहीं है। एक्स. लेविस भ्रूण में आरएनए के स्पॉनिंग, कल्चर और माइक्रोइंजेक्शन का अधिक विस्तृत विवरण संदर्भ 15 में पाया जा सकता है। - इंजेक्शन भ्रूण को 0.1x एमबीएस(टेबल1) में 5% फिकोल से भरे 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। एक १५० मिमी पेट्री पकवान के अंदर छोटे व्यंजन रखें और एक ढक्कन के साथ शिथिल कवर करने के लिए वाष्पीकरण से संस्कृति मीडिया को रोकने के । 15-16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भ्रूण संस्कृति।
नोट: Ficoll में भ्रूण Culturing इंजेक्शन साइट को चंगा करने में मदद करता है । यदि ठीक सुइयों का उपयोग किया जाता है, तो 2-3% फिकोल में खेती पर्याप्त है, जबकि यदि स्पष्ट क्षति देखी जाती है तो 5% फिकोल को प्राथमिकता दी जाती है। इंजेक्शन के बाद 1-2 घंटे के लिए Ficoll समाधान में भ्रूण रखते हुए चिकित्सा सहायता करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन रात भर इनक्यूबेशन भ्रूण को नुकसान नहीं पहुंचाता है जब तक समाधान गैस्ट्रेशन की शुरुआत से पहले बदल जाता है।
4. ब्लास्टोकोएल निष्कर्षण और Tgfß दरार उत्पादों का विश्लेषण
- इंजेक्शन के बाद अगली सुबह, Ficoll समाधान को हटा दें और किसी भी मृत या मरने वाले भ्रूण को हटा दें। 0.1x एमबीएस और संस्कृति के साथ एक या दो बार भ्रूण कुल्ला कमरे के तापमान पर बेंच पर 0.1x एमबीएस में भ्रूण ।
नोट: भ्रूण भी विकास को धीमा करने के लिए 16 डिग्री सेल्सियस जैविक इनक्यूबेटर को वापस किया जा सकता है । - निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके ग्लास केशिकाओं को एक महीन बिंदु पर गर्म करें और खींचें: दो कदम पुल; हीट 1: 67.4 डिग्री सेल्सियस; गर्मी 2: 62 डिग्री सेल्सियस।
नोट: ये सेटिंग्स यहां उपयोग किए जाने वाले पुलर और ग्लास केशिका(सामग्रियों की तालिका) केलिए विशिष्ट हैं। - एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश का उपयोग कर एक खींची सुई की नोक से क्लिप । क्लोजिंग को रोकने के लिए, ब्लास्टोकोल आकांक्षा के लिए उपयोग की जाने वाली सुई का उद्घाटन माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सुई की तुलना में बड़ा होना चाहिए। ब्लास्टोकोल आकांक्षा के लिए उपयोग की जाने वाली एक अच्छी खींची गई और काटी गई सुई का एक उदाहरण चित्र 1सीमें दिखाया गया है। आकांक्षा सुई को माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े सुई धारक में डालें और सुई धारक को माइक्रोमैनीपुलेटर से अटैच करें।
नोट: इष्टतम सुई व्यास अनुभवजन्य परीक्षण और त्रुटि से निर्धारित किया जाता है। एक बड़े व्यास के साथ सुई भी जल्दी से भरें और यह अधिक संभावना है कि सेलुलर मलबे सुई में प्रवेश करेंगे बनाते हैं । इसके विपरीत, बहुत छोटे व्यास सुई भरा होने की संभावना है । एक बार एक उपयुक्त सुई उत्पन्न होने के बाद, एक ही स्थिति में कई सुइयों को उत्पन्न करना उपयोगी है। - एक इंजेक्शन ट्रे या 0.1x एमबीएस से भरा पकवान में भ्रूण प्लेस जब वे मध्य गैस्ट्रूला चरण (चरण 10-11) के लिए जल्दी तक पहुंचने ।
- जानवर ध्रुव के पास भ्रूण की सतह के नीचे सुई डालें। सुई और भ्रूण पर नजर रखने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते समय माइक्रोइंजेक्टर पर फिल बटन दबाएं। कुछ सेकंड से अधिक, स्पष्ट तरल पदार्थ का स्तर सुई में वृद्धि होगी और भ्रूण ढह जाएगा और अवतल हो जाएगा ।
- यदि बादल सफेद पदार्थ सुई में प्रवेश करती है, तो किसी भी बादल के मामले को बाहर निकालने के लिए एक या अधिक बार इंजेक्ट बटन को भरने और पल्स को छोड़ दें, जिसमें सेलुलर मलबे होते हैं जिसमें प्रोटीज होने की संभावना होती है।
नोट: यदि ब्लास्टोकोएल गिर जाता है और सेल मलबे को भरने बटन दबाया जाता है जैसे ही सुई में प्रवेश करती है, यह इंगित करता है कि सुई में खोलने बहुत बड़ा है । यदि ब्लास्टोकोएल पतन में विफल रहता है लेकिन सफेद पदार्थ तुरंत सुई में प्रवेश करता है, तो इससे पता चलता है कि सुई बहुत गहराई से डाली गई थी और ब्लास्टोकोएल फर्श को छू रही है। सफेद पदार्थ को बाहर निकालें, और अगले भ्रूण में जाएं। आकांक्षा दर को लगातार दबाने के बजाय फिल बटन को स्पंदित करके अधिक सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जा सकता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि सुई में उद्घाटन इष्टतम से बड़ा है।
- यदि बादल सफेद पदार्थ सुई में प्रवेश करती है, तो किसी भी बादल के मामले को बाहर निकालने के लिए एक या अधिक बार इंजेक्ट बटन को भरने और पल्स को छोड़ दें, जिसमें सेलुलर मलबे होते हैं जिसमें प्रोटीज होने की संभावना होती है।
- 10-20 भ्रूण के ब्लास्टोकोइल से तरल पदार्थ को एस्पिरेटेड होने तक चरण 4.5 दोहराएं।
नोट: आम तौर पर, 10-20 भ्रूण से एस्पिरेटेड ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ इम्यूनोब्लॉट्स पर दरार उत्पादों का पता लगाने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, यह एंटीबॉडी गुणवत्ता के आधार पर भिन्न हो सकता है और अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। - उस पर नाभिक मुक्त पानी के इंजेक्शन ट्रे और पिपेट 1 माइक्रोन पर पैराफिन का एक टुकड़ा रखें। पानी की बूंद के नीचे सुई को जलमग्न करें और ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ को पानी में दूर करने के लिए इंजेक्ट बटन दबाएं।
- वैकल्पिक रूप से, तरल पदार्थ को सीधे पैराफिल्म पर बाहर निकालें, लेकिन इस मामले में, इसे पकड़ने के बजाय इंजेक्ट बटन को पल्स करें। यह कम दबाव में तरल पदार्थ को निष्कासित करता है, इसे पैराफिल्म पर सपाट होने से रोकता है, जिससे पिपेट में आकर्षित करना मुश्किल हो जाता है।
- ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ को बर्फ पर एक बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रति भ्रूण ब्लास्टोकोइल तरल पदार्थ के लगभग 0.3-0.5 माइक्रोन फसल की उम्मीद है। अंतिम मात्रा को 30 माइक्रोन में समायोजित करने के लिए नाभिक मुक्त पानी जोड़ें।
- ब्लास्टोकोएल तरल पदार्थ से समाप्त होने वाले भ्रूण को बर्फ पर एक अलग ट्यूब में स्थानांतरित करें। अतिरिक्त 0.1x एमबीएस निकालें और ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) भ्रूण के 200 माइक्रोन जोड़ें बफर (10 माइक्रोन प्रति भ्रूण)(तालिका 1)। एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 10-20 बार भ्रूण को ऊपर और नीचे तब तक पिपेट करें जब तक कि वे पूरी तरह से समरूप न हों और कोई झुरमुट न रहें।
- 10 मिनट के लिए 10,000 x g पर एक रेफ्रिजरेटेड माइक्रोसेंट्रफ्यूज में समरूप भ्रूण को सेंट्रलाइज करें। एक P200 पिपेट का उपयोग कर supernatant के १६० μL निकालें और बर्फ पर एक नई ट्यूब के लिए हस्तांतरण, सफेद जर्दी प्रोटीन और ट्यूब के नीचे आधे में अंय सेलुलर मलबे से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है ।
- माइक्रोसेंट्रफ्यूगेशन को एक बार दोहराएं और बर्फ पर एक नई ट्यूब में स्पष्ट सुपरनेट्ट के 128 माइक्रोन को स्थानांतरित करें। इस बिंदु पर, साफ किए गए भ्रूण और ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ को वांछित होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
नोट: कुछ अपवादों के साथ, Tgfß अग्रदूत प्रोटीन ब्लास्टोकोएल में स्रावित नहीं किए जाते हैं और केवल समाप्त भ्रूण में पता लगाया जाएगा। इसके विपरीत, टीजीएफएस परिवार दरार उत्पादों को मुख्य रूप से ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ में देखा जाता है। यह अधिकांश उद्देश्यों के लिए भ्रूण ों और ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ दोनों की कटाई और विश्लेषण करने में सहायक है। कम से कम, यह सुनिश्चित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है कि अग्रदूत का मजबूती से अनुवाद और स्थिर था। इसके अलावा, यह एक दरार उत्पादों के सापेक्ष अनुपात की तुलना विभिन्न जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती प्रोटीन के बीच अग्रदूत के लिए करने की अनुमति देता है, म्यूटेशन की पहचान करने के लिए जो अक्षुण्ण अग्रदूतों को ब्लास्टोकोल द्रव में स्रावित करने में सक्षम बनाते हैं (उदाहरण के लिए, पीसी आम सहमति आकृति के भीतर उत्परिवर्तन जो दरार के बिना उचित तह और स्राव के लिए अनुमति देते हैं, जिस स्थिति में भ्रूण और ब्लास्टोकोएल दोनों तरल पदार्थ में बरकरार अग्रदूत का पता लगाया जाता है) या उत्परिवर्तन जो गलत, अफोर्डेबल प्रोटीन (जिस स्थिति में भ्रूण में अग्रदूत का पता लगाया जाएगा, लेकिन ब्लास्टोकोले तरल पदार्थ में दरार उत्पाद नदारद होंगे)।
- माइक्रोसेंट्रफ्यूगेशन को एक बार दोहराएं और बर्फ पर एक नई ट्यूब में स्पष्ट सुपरनेट्ट के 128 माइक्रोन को स्थानांतरित करें। इस बिंदु पर, साफ किए गए भ्रूण और ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ को वांछित होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करके इस बिंदु पर PNGase एफ के साथ ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ में मौजूद डिग्लिकोसिलेट प्रोटीन।
नोट भ्रूण में मौजूद प्रीकरन प्रोटीन को डिग्लिकोसिलेट करने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि ये प्रीक्वेल्म रेटिकुलम (ईआर) का प्रतिनिधित्व करते हैं- अग्रदूत के निवासी रूपों में जो पीएनगासे एफ द्वारा हटाए गए जटिल एन-लिंक्ड ओलिगोसैकराइड्स की कमी है। इसके विपरीत, ब्लास्टोकोल द्रव में मौजूद दरार उत्पाद ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क (टीजीएन) के माध्यम से चले गए हैं जहां कार्बोहाइड्रेट को और संशोधित किया जाता है और अब PNGase एफ द्वारा हटाया जा सकता है। deglycosylation के बाद, दरार उत्पादों एसडीएस जैल पर एक और अधिक कसकर गाढ़ा बैंड के रूप में प्रवास, जो कल्पना, मात्रा और सही दरार उत्पादों की पहचान करने में सहायता कर सकते हैं । यह सख्ती से आवश्यक नहीं है, लेकिन यह उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, यदि आप माइग्रेशन पैटर्न के आधार पर होमोडिमर और विषममर्स के बीच अंतर करने की कोशिश कर रहे हैं या यदि एक दरार उत्पाद में विषम कार्बोहाइड्रेट होते हैं जो इसे एक व्यापक फजी बैंड के रूप में माइग्रेट करने का कारण बनते हैं। - 4x नमूना बफर(टेबल 1)को घटाकर 15 माइक्रोन ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ और 15 माइक्रोन को कम करने के 5 माइक्रोन जोड़ें। ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ के शेष 15 माइक्रोन में 4x नमूना बफर(तालिका 1)को कम न करने के 5 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी और बर्फ पर जगह है।
नोट: गैर-कम करने वाली स्थितियों के तहत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए क्लीव्ड होमोसिडेमिक या विषममिरिक लिगांड के गठन का विश्लेषण करना आवश्यक है, लेकिन यदि केवल क्लीव्ड प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण करने की आवश्यकता नहीं है। कुछ अपवादों के साथ, प्रोडोमेन टुकड़े मोनोमर के रूप में स्रावित होते हैं। इसके अलावा, भ्रूण में मौजूद अग्रदूत प्रोटीन मुख्य रूप से सामने आते हैं, ईआर निवासी मोनोमर। इस प्रकार, गैर-कम करने वाली स्थितियों के तहत इन उत्पादों का विश्लेषण करने की कोई आवश्यकता नहीं है। - 15% एसडीएस/पॉलीएक्रीलामाइड जैल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अग्रदूत प्रोटीन और क्लीवेज उत्पादों को हल करें।
- इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रांसफर का उपयोग करके पीवीडीएफ झिल्ली पर जेल से प्रोटीन स्थानांतरित करें।
- उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें जो प्रोडोमेन और लिगांड डोमेन (या उन डोमेन में डाले गए एपिटोप टैग) को पहचानते हैं, उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धोते और इनक्यूबेट करते हैं। रसायनिनेसेंस या फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ प्रोटीन की कल्पना करें।
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Representative Results
नीचे वर्णित प्रयोग का लक्ष्य यह निर्धारित करना था कि क्या बीएमपी 4 और बीएमपी 7 फॉर्म हेट्रोडिमर्स (एक बीएमपी 4 लिगांड और एक बीएमपी 7 लिगांड से बना डिमर्स), होमोडिमर्स (दो बीएमपी 4 या दो बीएमपी 7 लिगांड से बना), या एक्स में सह-व्यक्त किए जाने पर प्रत्येक का मिश्रण। चित्रा 2 में दिखाए गए आंकड़े पहले प्रकाशित अध्ययन10से निकाले जाते हैं । चित्रा 2A एक योजनाबद्ध दिखा दरार बीएमपी 4 या Bmp7 होमोडिमेरिक अग्रदूत या Bmp4/7 heterodimeric अग्रदूत के प्रोटियोलिटिक परिपक्वता द्वारा उत्पन्न उत्पादों है । बीएमपी 4 को दो प्रोडोमेन टुकड़े (गहरे हरे और पीले) और एक डिमरिक लिगांड टुकड़ा (हल्का हरा) उत्पन्न करने के लिए प्रोडोमेन के भीतर दो साइटों पर क्लीव किया गया है जो एसडीएस-पेज जैल पर ~ 26 केडीए पर माइग्रेट करता है। बीएमपी 7 को एक साइट पर एक प्रोडोमेन टुकड़ा (मैरून) और एक डाइमरिक लिगांड टुकड़ा (गुलाबी) उत्पन्न करने के लिए तैयार किया गया है जो ~ 35 केडीए पर माइग्रेट करता है। हेटेरिडिमेरिक लिगामेंट्स ~ 30 केडीए पर माइग्रेट होते हैं। लिगांड डिमर्स में सिल्वर बार इस डोमेन में डाले गए माइक-एपिटोप टैग का प्रतिनिधित्व करता है।
आरएनए एन्कोडिंग बीएमपी4माइक या बीएमपी 7माइक अग्रदूत (200 स्नातकोत्तर), या दोनों आरएनए (प्रत्येक के 100 स्नातकोत्तर) को 2-4 सेल चरण में एक्स लेविस भ्रूण में इंजेक्ट किया गया था। भ्रूण रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत थे जब तक वे जल्दी गैस्स्ट्रla चरण तक पहुंच गया । इस बिंदु पर, तरल पदार्थ प्रत्येक समूह में 20 भ्रूण के ब्लास्टोसाइल से एस्पिर्ATED किया गया था और बाँझ पानी 30 μL की कुल करने के लिए मात्रा लाने के लिए जोड़ा गया था । deglycosylation के बाद, प्रत्येक नमूना दो ट्यूबों में विभाजित किया गया था । नमूना बफर को कम करने के लिए एक ट्यूब में जोड़ा गया था, और गैर कम नमूना बफर दूसरे में जोड़ा गया था । नमूने 5 मिनट के लिए १०० डिग्री सेल्सियस तक गर्म किए गए थे । प्रोटीन तो SDS/पेज द्वारा अलग किया गया और इम्यूनोब्लॉट एंटीबॉडी है कि myc-epitope टैग(चित्रा 2B)पहचान के साथ जांच की गई । कम करने की स्थिति में, एक बैंड क्लीव्ड बीएमपी 4 मोनोमर के अनुरूप और एक अधिक धीरे-धीरे माइग्रेट बैंड क्लीव्ड बीएमपी 7 मोनोमर के अनुरूप केवल बीएमपी 4 या बीएमपी 7 को व्यक्त करने वाले भ्रूणों से lysates में पाया गया, क्रमशः(चित्रा 2C,D,लोअर पैनल, लेन 1, 2)। दोनों बैंड भ्रूण सह BMP4 और BMP7(चित्रा 2C,डी, कमपैनल,लेन 3) व्यक्त में पाया गया । तीन समूहों (निचले पैनल, कम करने) में से प्रत्येक में बीएमपी 4 और बीएमपी 7 मोनोमर की अपेक्षाकृत बराबर मात्रा मौजूद थी। इस प्रयोग में, जब प्रोटीन को गैर-कम करने की स्थितियों के तहत अलग किया गया था, तो मध्यवर्ती गतिशीलता के एक परिपक्व बीएमपी 4/7 हेटेरोडिमर बैंड का पता लगाया गया था, साथ ही भ्रूण में बीएमपी 4 होमोडिमर की एक ट्रेस मात्रा के साथ बीएमपी 4 और बीएमपी 7(चित्रा 2 सी,ऊपरी पैनल) को व्यक्त किया गया था। इन परिणामों से हम निष्कर्ष निकालते हैं कि यदि जेनोपस भ्रूण में बीएमपी 4 और बीएमपी 7 अग्रदूत प्रोटीन के समकक्ष स्तर व्यक्त किए जाते हैं, तो वे या तो होमोडिमर के बजाय अधिमानत हेट्रोडिमर बनाते हैं। चित्रा 2 डीमें दिखाए गए प्रयोग में, बीएमपी 4 (लोअर पैनल, कम करने) के सापेक्ष काफी अधिक बीएमपी 7 प्रोटीन मौजूद है। नतीजतन, बीएमपी 7 और बीएमपी 4 अग्रदूत प्रोटीन दोनों को व्यक्त करने वाले भ्रूणों में, बीएमपी 4 होमोसैमर का पता नहीं लगाया जाता है और इसके बजाय उपलब्ध बीएमपी 4 बीएमपी 4 एक बीएमपी 4/7 हेटेरोडिमर के रूप में मौजूद है, और अतिरिक्त बीएमपी 7 होमोसैमर्स बनाता है। हालांकि यह प्रयोग इष्टतम नहीं है, क्योंकि लक्ष्य बीएमपी 4 और बीएमपी 7 अग्रदूत की समकक्ष राशि को सह-व्यक्त करना था, परिणाम अभी भी इस निष्कर्ष के अनुरूप हैं कि बीएमपी 4 और बीएमपी 7 अधिमानतः या तो होमोडिमर पर हेट्रोडिमर बनाते हैं जब सह-व्यक्त किया जाता है।
चित्रा 1। इंजेक्शन और आकांक्षा सुई। प्रतिनिधि सुई की तस्वीरें जो खींची गई हैं लेकिन काटा नहीं गया है(ए)एक इंजेक्शन सुई(बी)के रूप में उपयोग के लिए खींचा गया और काटा गया या एक आकांक्षा सुई(सी)के रूप में उपयोग के लिए खींचा और काटा जाता है। तीर और तीर(ए)में क्रमशः इंजेक्शन और आकांक्षा के लिए सुई उत्पन्न करने के लिए कांच को काटा गया था, उस बिंदु को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। एक्स लेविस ब्लास्टोसेले तरल पदार्थ से निकाले गए क्लीव्ड बीएमपी लिगामेंट्स का विश्लेषण। (A)बीएमपी 4 और बीएमपी 7 होमोसेडिमेरिक या विषमप्राक्षक प्रोटीन और माईसी एपिटोप टैग (सिल्वर बार) की स्थिति से उत्पन्न क्लीवेज उत्पादों को इंजेक्शन और ब्लास्टोकोइल द्रव निष्कर्षण के समय को दिखाते हुए योजनाबद्ध रूप से(बी)योजनाबद्ध आरेख दिखाया गया है । (सी-डी) Xenopus भ्रूण BMP7 या BMP4 आरएनए के २०० स्नातकोत्तर के साथ इंजेक्शन थे, या Bmp4 और Bmp7 आरएनए के साथ एक साथ मिश्रित (१०० स्नातकोत्तर प्रत्येक) । गैस्ट्रुला चरण में, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में भ्रूण की एक ही संख्या के ब्लास्टोकोएल से तरल पदार्थ निकाला गया था। ब्लास्टोकोइल तरल पदार्थ में मौजूद प्रोटीन को डीग्लिकोसिलेटेड और एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था। मायसी-एपिटोप टैग को पहचानने वाले एंटीबॉडी का इस्तेमाल इम्यूनोब्लॉट्स की जांच के लिए किया जाता था । इम्यूनोरेक्टिव लिगामेंट मोनोमर और डिमर्स की सापेक्ष स्थिति प्रत्येक जेल के अधिकार के लिए योजनाबद्ध रूप से दिखाई जाती है। (ग)में काली रेखा दाग पर एक बीच लेन को हटाने का संकेत देता है । दिखाए गए आंकड़े पहले प्रकाशित अध्ययन10से निकाले जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| घोल | संयोजन |
| 0.2% ट्राइकेन | 20 ग्राम ट्राइकेन डिओनाइज्ड पानी में भंग, सोडियम बाइकार्बोनेट के अलावा पीएच को 7.4 तक समायोजित करें |
| 10x एमबीएस | 880 एमएमएम एनएसीएल, 10 एमएमएम केसीएल, 25 एमएमएम नाएचसीओ3, 100 एमएम एचईपीई (पीएच 7.5), 10 एमएम एमजीएसओ4, 0.14 एमएम सीए (नंबर3)2,0.41 एमएम सीसीएल2; NaOH के साथ पीएच 7.5 को समायोजित करें। 10x एमबीएस स्टॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है और आवश्यकतानुसार पतला किया जा सकता है। |
| 2% सिस्टीन समाधान | डिएकोनाइज्ड पानी के 100 एमएल पर 2 ग्राम सिस्टीन, सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ पीएच को 7.8-8.0 में समायोजित करें। हर दिन फ्रेश करें। |
| 20x है DeBoer तालाब पानी | 100 एमएमएल एनएसीएल, 1.3 एमएल केसीएल, 0.44 एमएमएल सीसीएल2; नाएचसीओ3के साथ पीएच 7.4 में समायोजित करें। डेबोअर के तालाब के पानी का 20x स्टॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है और आवश्यकतानुसार पतला किया जा सकता है। |
| 4x गैर कम करने नमूना बफर | 200 mM Tris पीएच 6.8, 8% एसडीएस, 0.4% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 40% ग्लाइसरोल। |
| 4x कम करने का नमूना बफर | 200 m Tris पीएच 6.8, 8% एसडीएस, 0.4% ब्रोमोफेनोल ब्लू, 40% ग्लाइसरोल, 14.4 एम एस एस-मर्केप्टोथेन |
| 5% फिकोल सॉल्यूशन | 500 एमएल 0.1x एमबीएस में फिकोल के 25 ग्राम, सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ पीएच को 7.5 में समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। |
| भ्रूण को लसमेट बफर | 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.5, 150 एमएमएम एनएसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 1% ट्राइटन एक्स-100, 01% एसडीएस, 2.5% एनपी-40। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। |
| मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन | 19 जी सुई से जुड़ी 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन (10,000 आईयू) की एक शीशी के रबर डाट के माध्यम से बाँझ पानी की 2.5 मिलील इंजेक्ट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। |
| टेस्टिस बफर | 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेन/स्ट्रेप (100U/एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन में 1x एमबीएस |
तालिका 1.
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Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल के मुख्य फायदे यह हैं कि इसे अपेक्षाकृत जल्दी पूरा किया जा सकता है, महंगे अभिकर्षकों की आवश्यकता नहीं होती है और फिजियोलॉजिकल परिस्थितियों में केंद्रित Tgfß दरार उत्पादों का स्रोत प्रदान करता है। एक और लाभ यह है कि यह एक epitope टैग प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है और इस तरह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की कमी को दरकिनार है कि सबसे Tgfß परिवार prodomain पहचान । यद्यपि संक्रमित सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में एपिटोप-टैग किए गए टीजीएफएस अग्रदूत प्रोटीन के दरार का विश्लेषण करना भी संभव है, लेकिन एक्स लेविसका उपयोग करने के कई फायदे हैं। प्रारंभिक एक्स. लेविस भ्रूण पीसी परिवार के सभी चार सदस्यों को व्यक्त करते हैं जो अंतर्जात टीजीएफएस कन्वर्टेसेस (फर्न, पीसीके 5, पीसीस्क 6 और पीसीएसके 7)13,14,16के लिए उम्मीदवार हैं। कुछ स्तनधारी कोशिका रेखाएं एक या अधिक पीसी व्यक्त नहीं करती हैं, जिसमें प्रीकर प्रोटीन और इसके परिवर्तन दोनों की एक्टोपिक अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है ताकि दरार17की जांच की जा सके। एक अधिक महत्वपूर्ण विचार यह है कि परिवर्तित कोशिकाओं के क्षणिक ट्रांसफेक्ट द्वारा उत्पन्न अग्रदूत प्रोटीन के बहुत उच्च स्तर कलाकृतियों को जन्म दे सकते हैं, जैसे कि गलत मुड़ा हुआ दरार उत्पादों का स्राव, जो ईआर18में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए क्षमता से अधिक होने पर हो सकता है। यह अग्रदूत डामरीकरण और दरार पर हानिकारक उत्परिवर्तनों के प्रभाव को मुखौटा कर सकता है क्योंकि मीडिया में गलत गुना दरार उत्पाद दिखाई देते हैं और जब तक गतिविधि को परख नहीं किया जाता है तब तक गलत तरीके से पता नहीं लगाया जाएगा। इसके विपरीत, एक्स लेविस भ्रूण का उपयोग करने वाले प्रयोग आसानी से तह में दोषों का पता लगाते हैं, जिससे या तो ईआर में गलत मोड़ वाले प्रोटीन प्रतिक्रिया या गैर-कम करने वाली स्थितियों के तहत दरार उत्पादों के अवर्णनीय प्रवास के कारण अग्रदूत की हानि होती है10,18।
ब्लास्टोकोएल आकांक्षा प्रक्रिया के दौरान, प्रत्येक भ्रूण से ब्लास्टोकोल तरल पदार्थ की लगभग बराबर मात्रा निकालने की कोशिश करना आवश्यक है, खासकर यदि, उदाहरण के लिए, लक्ष्य जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती अग्रदूतों से उत्पन्न दरार उत्पादों की तुलना करना था। यह एक सटीक विज्ञान है, लेकिन प्रत्येक भ्रूण से समय की लगभग बराबर राशि के लिए एस्पिरेशन मात्रा को सामान्य करने में मदद करता है । इसके अलावा, प्रत्येक समूह में भ्रूण की एक बड़ी संख्या से तरल पदार्थ एस्पिरेशन व्यक्तिगत भ्रूण के बीच मात्रा में किसी भी अंतर को सामान्य करने में मदद करता है ।
इन विट्रो क्लीवेज प्रतिक्रियाएं एक वैकल्पिक प्रक्रिया है जिसका उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि टीजीएफएस अग्रदूत प्रोटीन में मौजूद एक विशेष पीसी आकृति को क्लीव्ड किया गया है और किसी दिए गए सब्सट्रेट के लिए अंतर्जात परिवर्तन के रूप में संभावित पीसी की पहचान और/या शासन करना है । मौजूदा प्रोटोकॉल एक साधारण परख का वर्णन करते हैं जिसमें रेडियोलेबल अग्रदूत प्रोटीन विट्रो में उत्पन्न होते हैं, उदाहरण के लिए, खरगोश रेटिकुलोसाइट्स का उपयोग करके, या वीवो में, एक्स लेविस ओसाइट्स का उपयोग करके। इसके बाद इलेक्ट्रोफोरेसिस और ऑटोरेडियोग्राफी19द्वारा विश्लेषण किए गए उम्मीदवार रिकॉम्बिनेंट पीसी और क्लीवेज उत्पादों के साथ विट्रो में सब्सट्रेट्स को इनक्यूबेटेड किया जाता है । हालांकि यह प्रोटोकॉल यह निर्धारित करने का एक तेज़ और आसान तरीका प्रदान करता है कि क्या प्रोटीन पीसी सब्सट्रेट है और वीवो मेंकिस संभावित क्लीवेज साइटों का उपयोग किया जाता है, अग्रदूत प्रोटीन को पर्याप्त रूप से जोड़ या मंद होने की संभावना नहीं है और इस प्रकार इन प्रयोगों से प्राप्त दरार जानकारी वीवो स्थिति में प्रतिबिंबित नहीं हो सकती है।
प्रोटोकॉल हम यहां वर्णन की एक कमी यह है कि यह ठीक से मुड़ा हुआ कल्पना असंभव है, एक्स laevis भ्रूण में मंद अग्रदूत प्रोटीन । अन्य एक्टोपिक अभिव्यक्ति प्रणालियों में भी यही सच है, जैसे कि क्षणिक रूप से संक्रमित स्तनधारी कोशिकाएं, क्योंकि अशुद्ध मोनोमेरिक अग्रदूत प्रोटीन ईआर के भीतर पोस्ट-ईआर डिमराइज्ड और मुड़ा हुआ अग्रदूतों की तुलना में बहुत अधिक स्तर पर जमा होता है। डिमराइज्ड अग्रदूत तेजी से क्लीव किया जाता है और एक बार ईआर छोड़ देता है। यदि अग्रदूत प्रोटीन के डामरीकरण और तह का विश्लेषण करना आवश्यक है, तो एक उपयोगी वैकल्पिक प्रक्रिया एक्स. लेविस ओसाइट्स20में रेडियोलेबल अग्रदूतों की तस्करी और दरार की जांच करना है। ऑटोरेडियोग्राफी की उच्च संवेदनशीलता, इस तथ्य के साथ मिलकर कि प्रोटीन स्र्केटर सिस्टम के माध्यम से अधिक धीरे-धीरे ओसाइट्स में चलते हैं, क्योंकि वे सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं या भ्रूणों में करते हैं, एक को ओसाइट्स के भीतर मंद अग्रदूत प्रोटीन का पता लगाने और यह परीक्षण करने की अनुमति देता है कि क्या प्रोटीन ठीक से मुड़ा हुआ है और उनके ग्लाइकोसिलेशन स्थिति18की जांच करके ईआर छोड़ दियाहै, 21.
संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल टीजीएफए परिवार अग्रदूत प्रोटीन की परिपक्वता से उत्पन्न दरार उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और सरल विधि प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम उत्कृष्ट पशु देखभाल के लिए मैरी सांचेज का शुक्रिया अदा करते हैं । लेखकों के अनुसंधान राष्ट्रीय स्वास्थ्य और स्वास्थ्य संस्थान (NIH/NICHD) अनुदान R01HD067473-08 और R21 HD102668-01 और राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के संस्थान (NIDDK/NIH) अनुदान R01DK128068-01 के मानव विकास के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
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