Cuando las proteínas precursoras de la familia ß del factor de crecimiento transformador se expresan ectópicamente en embriones de Xenopus laevis, se dimerizan, se escindin y se secretan en el blastocele, que comienza en la etapa de blástula tardía a la gastrula temprana. Describimos un método para aspirar productos de escisión de la cavidad del blastocoele para el análisis de inmunoblot.
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Artículo de método
Análisis de los productos de escisión familiar del factor de crecimiento transformador ß secretados en el blastocoele de los embriones de Xenopus laevis
En este artículo
Resumen
Resumen
Los dos brazos de la superfamilia del factor de crecimiento transformador ß (Tgfß), representados por ligandos Tgfß/Nodal o de proteína morfogenética ósea (Bmp), respectivamente, desempeñan un papel esencial en el desarrollo embrionario y la homeostasis adulta. Los miembros de la familia Tgfß se hacen como precursores inactivos que se dimerizan y se pliegan dentro del retículo endoplásmico. El precursor se divide posteriormente en fragmentos de ligando y prodominio. Aunque solo el ligando dimérico puede activar los receptores Tgfß y activar la señalización aguas abajo, existe un creciente reconocimiento de que la fracción prodominio contribuye a la actividad del ligando. Este artículo describe un protocolo que se puede utilizar para identificar los productos de escisión generados durante la activación de las proteínas precursoras de Tgfß. Los precursores de Tgfß que codifican arnés se microinyectan primero en embriones de X. laevis. Al día siguiente, los productos de escisión se recogen del blastocoele de los embriones en etapa de gastrula y se analizan en Western blots. Este protocolo se puede completar con relativa rapidez, no requiere reactivos costosos y proporciona una fuente de productos concentrados de escisión Tgfß en condiciones fisiológicas.
Introducción
Los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformador ß (Tgfß) se sintetizan como proteínas precursoras inactivas y dimerizadas. Los precursores son luego escindidos por miembros de la familia de la proproteína convertasa (PC), ya sea dentro de la vía secretora o fuera de las células. Esto crea un dímero de ligando activo unido por disulfuro y dos fragmentos de prodominio1. Aunque se sabe desde hace más de 30 años que el prodominio de los precursores de la familia Tgfß es necesario para generar un ligando activo2,la comprensión de cómo los prodominios contribuyen a la función del ligando es incompleta.<....
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah. Las ranas se alojan en una instalación aprobada por la IACUC. Las ranas macho son sacrificadas por inmersión en tricaína después de recortar el ventrículo del corazón. Las ranas hembras se alojan en el laboratorio durante un máximo de 24 horas después de la inducción hormonal del desove para permitir la recolección de huevos y luego se devuelven al centro de atención.
1. Colección de X. laevis Testes
- Anestesiar a un macho sexualmente maduro en 0.2% de Tricaína(Tabla 1)
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Resultados
El objetivo del experimento descrito a continuación fue determinar si Bmp4 y Bmp7 forman heterodímeros (dímeros compuestos por un ligando Bmp4 y un ligando Bmp7), homodímeros (compuestos por dos ligandos Bmp4 o dos Bmp7), o una mezcla de cada uno cuando se co-expresan en X. laevis. Los datos mostrados en la Figura 2 se extraen de un estudio publicado previamente10. La Figura 2A es un esquema que muestra los productos de escisión .......
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Discusión
Las principales ventajas del protocolo descrito aquí son que se puede completar con relativa rapidez, no requiere reactivos costosos y proporciona una fuente de productos concentrados de escisión Tgfß en condiciones fisiológicas. Otra ventaja es que permite analizar las proteínas marcadas con epítopos y así eludir la escasez de anticuerpos disponibles comercialmente que reconocen la mayoría de los prodominios de la familia Tgfß. Aunque también es posible analizar la escisión de las proteínas precursoras de Tgfß marcadas .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Mary Sánchez por el excelente cuidado de los animales. La investigación de los autores está respaldada por el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NICHD) otorga R01HD067473-08 y R21 HD102668-01 y por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK / NIH) subvención R01DK128068-01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ß-mercaptoetanol | Fisher | AC125470100 | |
| Azul de bromofenol | Fisher | B392-5 | |
| Cloruro de calcio | Fisher | C79-500 | |
| Nitrato de calcio | Fisher | C109-500 | |
| Molinillo de pellets desechable/tisú | Fisher | 12-141-364 | |
| Pinzas | Dumont #5Herramientas de Fine Science | 11251-10 | |
| Suero fetal bovino | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Capilar de vidrio, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glicerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Coriónico humano gonadotropina | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Jeringa inyectable, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-cisteína | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Sulfato de magnesio | Fisher | M63-500 | |
| Aguja, 26 g | |||
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140148 | |
| Microinyector de picolitro | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Extractor de pipetas | Narashige | PC-100 | |
| Cloruro de potasio | Fisher | P217-500 | |
| Membrana PVDF | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Bicarbonato de sodio | Fisher | S233-500 | |
| Cloruro de sodio | Fisher | S271-10 | |
| Dodecil Sulfato de Sodio | Fisher | BP166-500 | |
| Hidróxido de Sodio | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
Referencias
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J.
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Reimpresiones y permisos
