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Developmental Biology

Análisis de los productos de escisión familiar del factor de crecimiento transformador ß secretados en el blastocoele de los embriones de Xenopus laevis

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62782
Automatic Translation
1, 2
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Summary

Cuando las proteínas precursoras de la familia ß del factor de crecimiento transformador se expresan ectópicamente en embriones de Xenopus laevis, se dimerizan, se escindin y se secretan en el blastocele, que comienza en la etapa de blástula tardía a la gastrula temprana. Describimos un método para aspirar productos de escisión de la cavidad del blastocoele para el análisis de inmunoblot.

Abstract

Los dos brazos de la superfamilia del factor de crecimiento transformador ß (Tgfß), representados por ligandos Tgfß/Nodal o de proteína morfogenética ósea (Bmp), respectivamente, desempeñan un papel esencial en el desarrollo embrionario y la homeostasis adulta. Los miembros de la familia Tgfß se hacen como precursores inactivos que se dimerizan y se pliegan dentro del retículo endoplásmico. El precursor se divide posteriormente en fragmentos de ligando y prodominio. Aunque solo el ligando dimérico puede activar los receptores Tgfß y activar la señalización aguas abajo, existe un creciente reconocimiento de que la fracción prodominio contribuye a la actividad del ligando. Este artículo describe un protocolo que se puede utilizar para identificar los productos de escisión generados durante la activación de las proteínas precursoras de Tgfß. Los precursores de Tgfß que codifican arnés se microinyectan primero en embriones de X. laevis. Al día siguiente, los productos de escisión se recogen del blastocoele de los embriones en etapa de gastrula y se analizan en Western blots. Este protocolo se puede completar con relativa rapidez, no requiere reactivos costosos y proporciona una fuente de productos concentrados de escisión Tgfß en condiciones fisiológicas.

Introduction

Los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformador ß (Tgfß) se sintetizan como proteínas precursoras inactivas y dimerizadas. Los precursores son luego escindidos por miembros de la familia de la proproteína convertasa (PC), ya sea dentro de la vía secretora o fuera de las células. Esto crea un dímero de ligando activo unido por disulfuro y dos fragmentos de prodominio1. Aunque se sabe desde hace más de 30 años que el prodominio de los precursores de la familia Tgfß es necesario para generar un ligando activo2,la comprensión de cómo los prodominios contribuyen a la función del ligando es incompleta.

Aunque la comprensión del proceso de activación proteolítica de los miembros de la familia Tgfß sigue siendo incompleta, existe un creciente interés en comprender qué motivos de consenso de PC se escindin in vivo,si la escisión ocurre en un compartimento subcelular o extracelular específico, y si el prodominio permanece covalente o no covalentemente asociado con el ligando escindido3. Diversos estudios han demostrado que el prodominio no solo guía el plegamiento del ligando antes de la escisión4,5,sino que también puede influir en la estabilidad del factor de crecimiento y el rango de acción6,7,8,9,impulsar la formación de homodímeros o heterodímeros10,anclar el ligando en la matriz extracelular para mantener la latencia del ligando11,y en algunos casos, funcionar como un ligando por derecho propio para activar heterólogos. señalización12. Las mutaciones puntuales heterocigotas dentro del prodominio de muchos miembros de la familia Tgfß se asocian con defectos oculares, óseos, renales, esqueléticos u otros en humanos3. Estos hallazgos resaltan el papel crítico del prodominio en la generación y el mantenimiento de un ligando activo y enfatizan la importancia de identificar y descifrar el papel de los productos de escisión desarrollados durante la maduración proteolítica de los precursores de la familia Tgfß.

Aquí describimos un protocolo detallado para aspirar productos de escisión generados durante la maduración de precursores de la familia Tgfß a partir del blastocoele de embriones de X. laevis y luego analizarlos en inmunoblots. Este protocolo se puede utilizar para determinar si uno o más motivos de consenso de PC en una proteína precursora se escinden in vivo10,13, identificar los PC endógenos que escinden cada motivo 13 ,14,comparar la formación in vivo de homodímeros de la familia Tgfß versus heterodímeros10 o analizar si las mutaciones puntuales asociadas a enfermedades humanas en precursores de Tgfß afectan su capacidad para formar ligandos diméricos funcionales.

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Protocol

Todos los procedimientos descritos están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah. Las ranas se alojan en una instalación aprobada por la IACUC. Las ranas macho son sacrificadas por inmersión en tricaína después de recortar el ventrículo del corazón. Las ranas hembras se alojan en el laboratorio durante un máximo de 24 horas después de la inducción hormonal del desove para permitir la recolección de huevos y luego se devuelven al centro de atención.

1. Colección de X. laevis Testes

  1. Anestesiar a un macho sexualmente maduro en 0.2% de Tricaína(Tabla 1)durante 30-40 min hasta que el animal no responda al pellizco de la garra.
  2. Use forrórceps contundentes para alejar la piel de la pared del cuerpo. Haga una incisión horizontal en la piel a través de la parte inferior del abdomen con tijeras quirúrgicas. Haga una incisión paralela en la pared subyacente del cuerpo, y luego una tercera incisión perpendicular a través de la pared del cuerpo a través de la caja torácica.
    1. Doble hacia atrás los colgajos resultantes, ubique el ventrículo del corazón y corte la base para exanguinar y asegurar la muerte.
  3. Saque los cuerpos de grasa amarilla del abdomen con bórceps contundentes y ubique los testículos a cada lado, subyacentes a la base de los cuerpos gordos. Retire cada testículo cortándolo de los cuerpos gordos y de cualquier víscera adherida con tijeras quirúrgicas.
  4. Transferir los testículos a una placa de Petri que contenga 1x Solución de Barth Modificada (MBS) (Tabla 1). Enjuague y retire los vasos sanguíneos adherentes o las vísceras adheridas.
    1. Transfiera un testículo a una placa de Petri de 35 mm que contenga tampón testis (Tabla 1) para uso inmediato y almacene el otro en un tubo cónico de 10 ml lleno de tampón testis para su uso posterior. Testis debe almacenarse a 4 °C cuando no se usa y seguirá siendo viable durante al menos dos semanas.
      NOTA: Las fotografías del aislamiento de los testículos se pueden encontrar en la Referencia 15.

2. Recolección y fertilización de huevos de X. laevis

NOTA: Las ranas deben manipularse con guantes de vinilo o lavarse las manos antes y después de manipular las ranas. Los guantes de látex, las lociones y los residuos de detergente en las manos humanas dañarán la frágil piel de las ranas.

  1. La noche antes del desove, inyecte 0,3 ml (1200 UI) de gonadotropina coriónica humana(Tabla 1)en el saco linfático dorsal de dos o tres hembras maduras de X. laevis utilizando una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 G. Use una aguja nueva para cada inyección.
  2. Después de la inyección, coloque a las hembras en un recipiente sellado (no hermético) en una incubadora biológica de 18 °C. El desove generalmente comienza 14-16 h más tarde.
    NOTA: Los cajones de plástico o recipientes de plástico con orificios de aire cortados en la tapa funcionan bien para sostener a las hembras durante la noche. Asegúrese de que la tapa esté firmemente puesta para evitar que las ranas escapen y se descaven en la incubadora.
  3. Sostenga a la hembra sobre una placa de Petri de 100 mm que contenga 1x MBS y aplique una presión suave en el abdomen de la rana para expulsar los huevos al plato.
  4. Corte un trozo pequeño del testículo (~1/5) con una cuchilla de afeitar y transfiéralo a un tubo de 1,5 ml que contenga ~500 μL de 1x MBS. Triturar con un mortero de pellets u homogeneizador de tejidos. Almacene la suspensión de espermatozoides resultante en hielo o a 4 °C para su posterior fertilización el mismo día.
  5. Incline la placa de Petri de 100 mm para verter la mayor cantidad posible de 1x MBS y retire el resto con una pipeta de transferencia de plástico. Aplique aproximadamente 100 μL de suspensión de espermatozoides, agregue aproximadamente 1 ml de 0.1x MBS y revuelva para mezclar.
    1. Después de 5 min, inunde el plato con agua del grifo declorada o 0.1x MBS y deje reposar durante 30 min.
      NOTA: El agua se puede declorar utilizando un filtro o el agua del grifo municipal se puede dejar de pie descubierta durante al menos 24 horas para permitir que el cloro se disipe en las regiones donde se agrega cloro convencional al agua. En áreas donde se agrega cloramina para desinfectar el agua potable, el agua debe tratarse con un acondicionador disponible comercialmente que pueda descomponer la cloramina.
      NOTA: Los huevos se recogen en una solución alta en sal (1x MBS) para evitar la formación de una capa de gelatina, lo que proporcionaría una barrera para la fertilización. Después de la fertilización, la solución baja en sal (agua declorada o 0.1x MBS) permite la formación de la capa de gelatina y los huevos se adherirán entre sí y al plato. Los huevos que han sido fertilizados rotarán de tal manera que el polo del animal pigmentado se enfrente hacia arriba dentro de los 30 minutos. Si esto no sucede, y los óvulos se ven sanos bajo el microscopio, la viabilidad de los espermatozoides es sospechosa y puede ser necesario cosechar nuevos testículos.
  6. Vierta la solución que cubre los huevos y llene la placa de Petri con una solución de cisteína al 2% recién preparada (Tabla 1). Revuelva la solución en el plato durante 3-5 minutos hasta que la capa de gelatina se disuelva y los huevos ya no se peguen entre sí o al plato.
    1. Incline el plato y vierta cuidadosamente la solución de cisteína, o retire con una pipeta de plástico. Reemplace con 1x agua del estanque de DeBoer (Tabla 1). Remolino para enjuagar y decantar.
    2. Repita un lavado con la solución de DeBoer, uno con 0.1x MBS, y vuelva a llenar el plato con 0.1x MBS. Después de quitar la capa de gelatina, los huevos se vuelven más frágiles y no deben exponerse a la interfaz aire-líquido.
  7. Mueva los huevos fertilizados a una incubadora biológica de 16 °C o déjelos en el banco a temperatura ambiente. Si se deja a temperatura ambiente, la primera escisión ocurrirá 1-1.5 h después de la fertilización, y las divisiones posteriores ocurrirán aproximadamente cada 30 minutos. Por el contrario, si los embriones se incuban a 15-16 ° C, las divisiones ocurrirán aproximadamente cada hora y será posible inyectar un mayor número de embriones de un desove determinado.

3. Microinyección de embriones de X. laevis

  1. Caliente y tire de los capilares de vidrio hasta un punto fino utilizando un arrancador de micropipetas con los siguientes ajustes: Tirón de dos pasos; Calor 1: 67.4 °C; Calor 2: 62 °C.
    NOTA: Estos ajustes son específicos para el extracdor de micropipetas y los capilares de vidrio utilizados aquí (Tabla de materiales).
  2. Bajo un microscopio de disección, recorte la punta de una aguja tirada cerca del extremo con pinzas Dumont #5. La aguja debe ser afilada pero no tan delgada que la punta se doble cuando entre en contacto con el embrión. La Figura 1 muestra un ejemplo de una aguja tirada apropiadamente que no ha sido recortada para microinyección (A) y una que ha sido recortada (B).
  3. Inserte la aguja en un soporte de aguja conectado a un microinyector. Conecte el soporte de la aguja a un micromanipulador. Coloque 2-4 μL de ARN sintético tapado que codifica la proteína precursora de Tgfß para ser analizada en una pequeña pieza de parapelícula bajo un microscopio de disección.
    1. Usando el micromanipulador, baje la aguja en la gota y use la función de relleno en el microinyector para aspirar ARN en la aguja. Asegúrese de mantener la aguja debajo de la superficie de la gota y observe el progreso bajo el microscopio para evitar aspirar aire en la aguja.
      NOTA: Si no se dispone de anticuerpos que reconozcan el dominio de prodominio y/o ligando del precursor de Tgfß que se analizará, la secuencia que codifica una etiqueta de epítopo (por ejemplo, V5, myc, Flag) se puede insertar en el marco en el ADNc que se utilizará como plantilla para la transcripción de ARN. La bioactividad in vivo de la proteína marcada debe compararse con la de la proteína no etiquetada para garantizar que el epítopo no interfiera con el plegamiento, la escisión o la actividad adecuados.
  4. Expulse una gota de la solución de ARN al aire y mida el tamaño de la gota con un micrómetro montado en la etapa de inyección o en el ocular del microscopio. Ajuste el tamaño de la gota a aproximadamente 10 nL utilizando los controles de tiempo y presión en el microinyector.
    NOTA: Las concentraciones de ARN en el rango de 5-20 ng/μL son apropiadas para entregar 50-200 pg de ARN en cada embrión. Esta cantidad de ARN es generalmente suficiente para detectar productos de escisión en aspirados de 10-20 embriones. Es mejor apuntar a la dosis más baja de ARN que da una señal detectable en los inmunoblots. Cantidades más altas de ARN pueden causar defectos de gastrulación, que interfieren con la expansión del blastocoele.
  5. Mueva los embriones a una placa de inyección o bandeja que contenga 5% de Ficoll en 0.1x MBS (Tabla 1) cuando alcancen la etapa de 2-4 células. Una placa de Petri de 35 mm equipada con un trozo de malla de nylon en la parte inferior puede servir como una placa de inyección económica que mantendrá a los embriones inmovilizados. Inserte la aguja cerca del polo animal e inyecte 10 nL de ARN en una célula de cada embrión.
    NOTA: Los embriones se pueden inyectar fácilmente en cualquier momento entre las etapas de una y 16 células. Inyectar el embrión después de que se haya escindido asegura que el óvulo fue fertilizado y que el embrión está sano. La ubicación exacta de la inyección no es esencial. Una descripción más detallada del desove, cultivo y microinyección de ARN en embriones de X. laevis se puede encontrar en la Referencia 15.
  6. Transferir los embriones inyectados a una placa de Petri de 35 mm llena de Ficoll al 5% en 0,1x MBS (Tabla 1). Coloque los platos pequeños dentro de una placa de Petri de 150 mm y cúbralo holgadamente con una tapa para evitar que los medios de cultivo se evaporen. Culta los embriones durante la noche a 15-16 °C.
    NOTA: El cultivo de embriones en Ficoll ayuda a sanar el sitio de inyección. Si se usan agujas finas, el cultivo en 2-3% de Ficoll es suficiente, mientras que se prefiere 5% de Ficoll si se observa un daño aparente. Mantener los embriones en solución de Ficoll durante 1-2 h después de la inyección es suficiente para ayudar a la curación, pero la incubación nocturna no daña el embrión siempre que la solución se cambie antes del inicio de la gastrulación.

4. Extracción y análisis de blastocoele de productos de escisión Tgfß

  1. A la mañana siguiente después de la inyección, retire la solución de Ficoll y retire los embriones muertos o moribundos. Enjuague los embriones una o dos veces con 0.1x MBS y culta los embriones en 0.1x MBS en el banco a temperatura ambiente.
    NOTA: Los embriones también pueden ser devueltos a la incubadora biológica de 16 °C para ralentizar el desarrollo.
  2. Calentar y tirar de los capilares de vidrio hasta un punto fino utilizando un arrancador de micropipetas con los siguientes ajustes: Tiro de dos pasos; Calor 1: 67.4 °C; Calor 2: 62 °C.
    NOTA: Estos ajustes son específicos para el cajón y el capilar de vidrio utilizados aquí (Tabla de materiales).
  3. Bajo un microscopio de disección, recorte la punta de una aguja tirada con pórceps. Para evitar la obstrucción, la abertura de una aguja utilizada para la aspiración de blastocoele debe ser mayor que la de una aguja utilizada para la microinyección. Un ejemplo de una buena aguja tirada y recortada para ser utilizada para la aspiración de blastocoele se muestra en la Figura 1C. Inserte la aguja de aspiración en el soporte de la aguja conectado a un microinyector y conecte el soporte de la aguja a un micromanipulador.
    NOTA: El diámetro óptimo de la aguja se determina empíricamente por ensayo y error. Las agujas con un diámetro grande se llenan demasiado rápido y hacen que sea más probable que los desechos celulares entren en la aguja. Por el contrario, es probable que las agujas de diámetro muy pequeño se obstruyan. Una vez que se genera una aguja adecuada, es útil generar varias agujas recortadas en la misma posición.
  4. Coloque los embriones en una bandeja de inyección o plato lleno de 0.1x MBS cuando alcancen la etapa temprana a media de la gastrula (etapa 10-11).
  5. Inserte la aguja debajo de la superficie del embrión cerca del polo animal. Presione el botón de relleno en el microinyector mientras mira a través del microscopio de disección para vigilar la aguja y el embrión. Durante unos segundos, el nivel de líquido claro aumentará en la aguja y el embrión colapsará y se volverá cóncavo.
    1. Si la materia blanca turbia entra en la aguja, suelte el botón de relleno y presione el botón de inyección una o más veces para expulsar cualquier materia turbia, que consiste en desechos celulares que probablemente contengan proteasas.
      NOTA: Si el blastocoele colapsa y los restos celulares entran en la aguja tan pronto como se presiona el botón de relleno, esto indica que la abertura en la aguja es demasiado grande. Si el blastocoele no colapsa pero la materia blanca entra en la aguja inmediatamente, esto muestra que la aguja se insertó demasiado profundamente y está tocando el piso del blastocoele. Expulse la materia blanca y pase al siguiente embrión. La velocidad de aspiración se puede controlar con más cuidado pulsando el botón de llenado en lugar de presionarlo continuamente. Esto es particularmente importante si la abertura en la aguja es más grande de lo óptimo.
  6. Repita el paso 4.5 hasta que el líquido haya sido aspirado del blastocoele de 10-20 embriones.
    NOTA: En general, el líquido de blastocoele aspirado a partir de 10-20 embriones es suficiente para detectar productos de escisión en inmunoblots. Sin embargo, esto puede variar dependiendo de la calidad de los anticuerpos y debe determinarse empíricamente.
  7. Coloque un trozo de parafina en la bandeja de inyección y pipetee 1 μL de agua libre de nucleasa sobre ella. Sumerja la aguja bajo la gota de agua y presione el botón de inyección para disipar el líquido de blastocoele en el agua.
    1. Alternativamente, expulse el fluido directamente sobre la parapelícula, pero en este caso, pulse el botón de inyección en lugar de mantenerlo presionado. Esto expulsa el fluido a una presión más baja, evitando que se aplane en la parapelícula, lo que dificulta su elaboración en una pipeta.
  8. Transfiera el líquido de blastocoele a un tubo de microcentrífuga estéril sobre hielo. Espere cosechar aproximadamente 0.3-0.5 μL de líquido blastocoele por embrión. Agregue agua libre de nucleasas para ajustar el volumen final a 30 μL.
  9. Transfiera los embriones agotados de líquido blastocoele a un tubo separado en hielo. Eliminar el exceso de 0,1x MBS y añadir 200 μL de tampón de lisado embrionario refrigerado (4 °C) (10 μL por embrión) (Tabla 1). Pipetear los embriones hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces usando una micropipeta hasta que estén completamente homogeneizados y no queden grumos.
  10. Centrifugar los embriones homogeneizados en una microcentrífuga refrigerada a 10.000 x g durante 10 min. Retire 160 μL del sobrenadante con una pipeta P200 y transfiéralo a un nuevo tubo sobre hielo, teniendo cuidado de evitar las proteínas de la yema blanca y otros desechos celulares en la mitad inferior del tubo.
    1. Repita la microcentrifugación una vez y transfiera 128 μL del sobrenadante transparente a un nuevo tubo sobre hielo. En este punto, los lisatos embrionarios eliminados y el líquido de blastocoele se pueden almacenar a -80 ° C durante el tiempo que se desee.
      NOTA: Con algunas excepciones, las proteínas precursoras de Tgfß no se secretan en el blastocoele y solo se detectarán en los lisatos embrionarios agotados. Por el contrario, los productos de escisión de la familia Tgfß se ven principalmente en el líquido de blastocoele. Es útil cosechar y analizar tanto los lisados embrionarios como el líquido blastocoele para la mayoría de los propósitos. Como mínimo, esto proporciona un control positivo para garantizar que el precursor se tradujera de manera sólida y estable. Además, permite comparar las proporciones relativas de productos de escisión con precursores entre diferentes proteínas de tipo silvestre o mutantes, para identificar mutaciones que permiten secretar precursores intactos en el líquido blastocele (por ejemplo, mutaciones dentro del motivo de consenso de PC que permiten un plegamiento y secreción adecuados sin escisión, en cuyo caso el precursor intacto se detecta tanto en el embrión como en el líquido blastocoele) o mutaciones que generan mal plegado, proteínas no escindibles (en cuyo caso el precursor se detectará en el lisato embrionario, pero los productos de escisión estarán ausentes en el líquido de blastocoele).
  11. Las proteínas deglicosilato presentes en el líquido de blastocele con PNGasa F en este punto siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA No hay necesidad de desglicosilatar las proteínas precursoras presentes en el lisado embrionario, ya que representan el retículo endoplásmico (RE), formas residentes del precursor que carecen de los oligosacáridos complejos ligados a N eliminados por la PNGasa F. Por el contrario, los productos de escisión presentes en el líquido de blastocoele se han movido a través de la red trans-Golgi (TGN) donde los carbohidratos se modifican aún más y ahora pueden ser eliminados por la PNGasa F. Después de la desglicosilación, los productos de escisión migran como una banda más condensada en los geles SDS, lo que puede ayudar a visualizar, cuantificar e identificar con precisión los productos de escisión. Esto no es estrictamente necesario, pero puede ser útil, por ejemplo, si está tratando de distinguir entre homodímeros y heterodímeros en función de los patrones de migración o si un producto de escisión contiene carbohidratos heterogéneos que hacen que migre como una amplia banda difusa.
  12. Añadir 5 μL de tampón de muestra reductora 4x (Tabla 1) a 15 μL de líquido blastocoele y 15 μL de lisato embrionario clarificado. Añadir 5 μL de tampón de muestra 4x no reductor (Tabla 1) a los 15 μL restantes de líquido de blastocoele. Calentar a 100 °C durante 5 min y colocar sobre hielo.
    NOTA: El análisis de proteínas en condiciones no reductoras es esencial para analizar la formación de ligandos homodiméricos o heterodímeros escindidos, pero no es necesario si solo se analizan los sitios de escisión o los niveles de proteínas escindidas. Con algunas excepciones, los fragmentos de prodominio se secretan como monómeros. Además, las proteínas precursoras presentes en el lisato embrionario se despliegan principalmente, monómeros residentes en ER. Por lo tanto, no hay necesidad de analizar estos productos en condiciones no reductoras.
  13. Resuelva las proteínas precursoras y los productos de escisión por electroforesis en geles de SDS/poliacrilamida al 15%.
  14. Transfiera proteínas del gel a una membrana de PVDF mediante transferencia electroforética.
  15. Incubar membranas con anticuerpos apropiados que reconozcan el prodominio y el dominio del ligando (o etiquetas de epítopo insertadas en esos dominios), lavar e incubar con anticuerpos secundarios adecuados. Visualice proteínas con quimioluminescencia o imágenes fluorescentes.

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Representative Results

El objetivo del experimento descrito a continuación fue determinar si Bmp4 y Bmp7 forman heterodímeros (dímeros compuestos por un ligando Bmp4 y un ligando Bmp7), homodímeros (compuestos por dos ligandos Bmp4 o dos Bmp7), o una mezcla de cada uno cuando se co-expresan en X. laevis. Los datos mostrados en la Figura 2 se extraen de un estudio publicado previamente10. La Figura 2A es un esquema que muestra los productos de escisión generados por la maduración proteolítica de los precursores homodímeros Bmp4 o Bmp7 o los precursores heterodímeros Bmp4/7. Bmp4 se escinde en dos sitios dentro del prodominio para generar dos fragmentos de prodominio (verde oscuro y amarillo) y un fragmento de ligando dimérico (verde claro) que migra a ~ 26 kDa en geles SDS-PAGE. Bmp7 se escinde en un solo sitio para generar un fragmento de prodominio (granate) y un fragmento de ligando dimérico (rosa) que migra a ~ 35 kDa. Los ligandos heterodiméricos migran a ~30 kDa. La barra de plata en los dímeros de ligando representa una etiqueta myc-epitope insertada en este dominio.

Los precursores de ARN que codifican Bmp4myc o Bmp7myc (200 pg), o ambos ARN (100 pg de cada uno) se inyectaron en embriones de X. laevis en la etapa de 2-4 células. Los embriones se cultivaron durante la noche a 16 °C hasta que alcanzaron la etapa temprana de gastrula. En este punto, se aspiró líquido del blastocele de 20 embriones en cada grupo y se agregó agua estéril para llevar el volumen a un total de 30 μL. Después de la desglicosilación, cada muestra se dividió en dos tubos. Se agregó un tampón de muestra reductor a un tubo y un tampón de muestra no reductor al otro. Las muestras se calentaron a 100 °C durante 5 min. Las proteínas fueron separadas por SDS/PAGE y los inmunoblots fueron sondeadas con anticuerpos que reconocen la etiqueta myc-epitope(Figura 2B). En condiciones de reducción, se detectó una sola banda correspondiente a monómeros Bmp4 escindidos y una banda de migración más lenta correspondiente a monómeros BMP7 escindidos en lisados de embriones que expresaban solo Bmp4 o Bmp7, respectivamente(Figura 2C,D,panel inferior, carriles 1, 2). Ambas bandas se detectaron en embriones co-expresando Bmp4 y Bmp7(Figura 2C,D,panel inferior, carril 3). Cantidades relativamente equivalentes de monómeros Bmp4 y Bmp7 estuvieron presentes en cada uno de los tres grupos (panel inferior, reductor). En este experimento, cuando las proteínas se separaron en condiciones no reductoras, se detectó una sola banda heterodímero Bmp4/7 madura de movilidad intermedia junto con una traza de homodímero Bmp4 en embriones coextrofizantes Bmp4 y Bmp7(Figura 2C,panel superior). De estos resultados concluimos que si se expresan niveles equivalentes de proteínas precursoras de Bmp4 y Bmp7 en embriones de Xenopus, preferentemente forman heterodímeros, en lugar de cualquiera de los homodímeros. En el experimento que se muestra en la Figura 2D,significativamente más proteína Bmp7 está presente en relación con Bmp4 (panel inferior, reductor). Como resultado, en embriones que expresan proteínas precursoras de Bmp7 y Bmp4, no se detectan homodímeros de Bmp4 y, en cambio, el Bmp4 disponible está presente como un heterodímero Bmp4/7, y el exceso de Bmp7 forma homodímeros. Si bien este experimento no es óptimo, ya que el objetivo era co-expresar la cantidad equivalente de Bmp4 y Bmp7 precursor, los resultados siguen siendo consistentes con la conclusión de que Bmp4 y Bmp7 forman preferentemente heterodímeros sobre cualquiera de los homodímeros cuando se co-expresan.

Figure 1
Figura 1. Agujas de inyección y aspiración. Se muestran fotografías de agujas representativas que han sido tiradas pero no recortadas (A) tiradas y recortadas para su uso como aguja de inyección (B) o tiradas y recortadas para su uso como aguja de aspiración (C). La flecha y la punta de flecha en (A) indican el punto en el que se recortó el vidrio para generar una aguja para inyección y aspiración, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Análisis de ligandos Bmp escindidos extraídos del líquido blastocele de X. laevis. (A) Los productos de escisión generados a partir de proteínas precursoras homodiméricas o heterodméricas Bmp4 y Bmp7 y la posición de la etiqueta del epítopo myc (barra de plata) se muestran esquemáticamente (B) Diagrama esquemático que muestra el momento de la inyección y la extracción del líquido blastocoele. (C-D) Los embriones de Xenopus fueron inyectados con 200 pg de ARN Bmp7 o Bmp4, o con ARN Bmp4 y Bmp7 mezclados (100 pg cada uno). En la etapa de gastrula, se extrajo líquido del blastocoele del mismo número de embriones en cada grupo experimental. Las proteínas presentes en el líquido blastocoele fueron desglicosiladas y separadas por SDS-PAGE. Se utilizaron anticuerpos que reconocían la etiqueta myc-epitope para sondear inmunoblots. La posición relativa de los monómeros y dímeros de ligando inmunorreactivos se muestra esquemáticamente a la derecha de cada gel. La línea negra en (C) indica la eliminación de un carril intermedio en la mancha. Los datos mostrados se extraen de un estudio publicado previamente10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución Composición
0.2% Tricaine 20 g de Tricaine disuelto en agua desionizada, ajustar el pH a 7.4 mediante la adición de bicarbonato de sodio
10x MBS 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgSO4, 0.14 mM Ca(NO3)2, 0.41 mM CaCl2; Ajuste a pH 7.5 con NaOH. El stock de 10x MBS se puede almacenar a 4 °C y diluir según sea necesario.
Solución de cisteína al 2% 2 g de cisteína por 100 ml de agua desionizada, ajuste el pH a 7.8-8.0 con hidróxido de sodio.  Hacer fresco cada día.
20x agua del estanque de DeBoer 100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Ajustar a pH 7.4 con NaHCO3. 20x stock de agua del estanque de DeBoer se puede almacenar a 4 ° C y diluir según sea necesario.
4x búfer de muestra no reductor 200 mM Tris pH 6.8, 8% SDS, 0.4% azul de bromofenol, 40% glicerol.
4x reducción del búfer de muestras 200 mM Tris pH 6.8, 8% SDS, 0.4% azul de bromofenol, 40% glicerol, 14.4 M ß-mercaptoetanol
Solución Ficoll al 5% 25 g de Ficoll en 500 mL 0.1x MBS, ajuste el pH a 7.5 con hidróxido de sodio.  Conservar a 4 °C.
Tampón de lisato embrionario 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Tritón X-100, 0.1% SDS, 2.5% NP-40.  Conservar a 4 °C.
Gonadotropina coriónica humana Usando una jeringa de 3 ml conectada a una aguja de 19 G, inyecte 2,5 ml de agua estéril a través del tapón de goma de un vial de gonadotropina coriónica humana (10.000 UI). Conservar a 4 °C.
Búfer testis 10% de suero fetal bovino, 1% de pluma/estreptococo (100U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina en 1x MBS

Tabla 1.

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Discussion

Las principales ventajas del protocolo descrito aquí son que se puede completar con relativa rapidez, no requiere reactivos costosos y proporciona una fuente de productos concentrados de escisión Tgfß en condiciones fisiológicas. Otra ventaja es que permite analizar las proteínas marcadas con epítopos y así eludir la escasez de anticuerpos disponibles comercialmente que reconocen la mayoría de los prodominios de la familia Tgfß. Aunque también es posible analizar la escisión de las proteínas precursoras de Tgfß marcadas con epítopos en células de mamíferos cultivadas transfectadas, hay varias ventajas en el uso de X. laevis. Los embriones tempranos de X. laevis expresan los cuatro miembros de la familia PC que son candidatos a las convertasas endógenas de Tgfß (Furin, Pcsk5, Pcsk6 y Pcsk7)13,14,16. Algunas líneas celulares de mamíferos no expresan uno o más PC, requiriendo la expresión ectópica tanto de la proteína precursora como de su convertasa para examinar la escisión17. Una consideración más importante es que los niveles muy altos de proteínas precursoras generadas por la transfección transitoria de las células transformadas pueden conducir a artefactos, como la secreción de productos de escisión mal plegados, que pueden ocurrir si los niveles de precursores exceden la capacidad de control de calidad en el ER18. Esto puede enmascarar el efecto de las mutaciones deletéreas en la dimerización y escisión de precursores, ya que los productos de escisión mal plegados aparecen en los medios y el plegamiento erróneo no se detectaría a menos que se ensaye la actividad. Por el contrario, los experimentos que utilizan embriones de X. laevis detectan fácilmente defectos en el plegamiento, lo que lleva a la pérdida de precursor debido a la respuesta de proteína mal plegada en el RE o a la migración aberrante de productos de escisión en condiciones no reductoras10,18.

Durante el procedimiento de aspiración de blastocoele, es esencial tratar de extraer una cantidad aproximadamente equivalente de líquido de blastocoele de cada embrión, particularmente si, por ejemplo, el objetivo era comparar los productos de escisión generados a partir de precursores de tipo salvaje y mutantes. Esta es una ciencia inexacta, pero aspirar por una cantidad aproximadamente igual de tiempo de cada embrión ayuda a normalizar el volumen. Además, la aspiración de líquido de un mayor número de embriones en cada grupo ayuda a normalizar cualquier diferencia de volumen entre embriones individuales.

Las reacciones de escisión in vitro son un procedimiento alternativo que se puede utilizar para determinar si un motivo de PC particular presente en una proteína precursora de Tgfß está escindido y para identificar y / o descartar posibles PC como convertasas endógenas para un sustrato dado. Los protocolos existentes describen un ensayo simple en el que se generan proteínas precursoras radiomarcadas in vitro, utilizando reticulocitos de conejo, por ejemplo, o in vivo,utilizando ovocitos X. laevis. A continuación, los sustratos se incuban in vitro con PCs recombinantes candidatos y productos de escisión analizados por electroforesis y autorradiografía19. Si bien este protocolo proporciona una forma rápida y fácil de determinar si una proteína es un sustrato de PC e identificar qué posibles sitios de escisión se utilizan in vivo,es poco probable que las proteínas precursoras se plieguen o dimericen adecuadamente y, por lo tanto, la información de escisión obtenida de estos experimentos puede no reflejar la situación in vivo.

Una deficiencia del protocolo que describimos aquí es que es imposible visualizar correctamente la proteína precursora dimerizada plegada en embriones de X. laevis. Lo mismo es cierto en otros sistemas de expresión ectópica, como las células de mamíferos transfectadas transitoriamente, ya que la proteína precursora monomérica uncleaved se acumula dentro del ER a niveles mucho más altos que los precursores dimerizados y plegados post-ER. El precursor dimerizado se escinde y secreta rápidamente una vez que sale de la ER. Si es esencial analizar la dimerización y el plegamiento de las proteínas precursoras, un procedimiento alternativo útil es examinar el tráfico y la escisión de precursores radiomarcados en ovocitos X. laevis 20. La alta sensibilidad de la autorradiografía, junto con el hecho de que las proteínas se mueven a través del sistema secretor más lentamente en los ovocitos que en las células o embriones de mamíferos cultivados, permite detectar proteínas precursoras dimerizadas dentro de los ovocitos y probar si las proteínas están correctamente plegadas y han abandonado el RE examinando su estado de glicosilación18, 21.

En resumen, este protocolo proporciona un método rápido y sencillo para analizar los productos de escisión generados por la maduración de las proteínas precursoras de la familia Tgfß.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Mary Sánchez por el excelente cuidado de los animales. La investigación de los autores está respaldada por el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NICHD) otorga R01HD067473-08 y R21 HD102668-01 y por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK / NIH) subvención R01DK128068-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

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References

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Biología del Desarrollo Número 173
Análisis de los productos de escisión familiar del factor de crecimiento transformador ß secretados en el blastocoele de los embriones de <em>Xenopus laevis</em>
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Kim, H. S., Christian, J. L.… More

Kim, H. S., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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