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Developmental Biology

Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62782
Automatic Translation
1, 2
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Summary

Quando as proteínas precursoras do Fator de Crescimento Transformador são expressas em embriões xenopus laevis, elas escurecem, são cortadas e são secretadas na blastocoele, que começa no final da blastula até o estágio gastrula inicial. Descrevemos um método para aspirar produtos de decote da cavidade blastocoele para análise de imunoblot.

Abstract

Os dois braços da superfamília Fator de Crescimento Transformador ß (Tgfß), representados por ligantes de proteína morfogenética Tgfß/Nodal ou Bone (Bmp), respectivamente, desempenham papéis essenciais no desenvolvimento embrionário e na homeostase adulta. Membros da família Tgfß são feitos como precursores inativos que escurecem e dobram dentro do ânticulo endoplasmático. O precursor é posteriormente cortado em fragmentos de ligante e prodomínio. Embora apenas o ligante dimeric possa engajar receptores Tgfß e ativar a sinalização a jusante, há um reconhecimento crescente de que a moiety prodomínio contribui para a atividade de ligante. Este artigo descreve um protocolo que pode ser usado para identificar produtos de decote gerados durante a ativação das proteínas precursoras de Tgfß. Os precursores de RNA são primeiro microinjetados em embriões X. laevis. No dia seguinte, os produtos de decote são coletados da blastocoele de embriões do estágio gastrula e analisados em manchas ocidentais. Este protocolo pode ser concluído relativamente rapidamente, não requer reagentes caros e fornece uma fonte de produtos concentrados de decote Tgfß em condições fisiológicas.

Introduction

Os membros da superfamília Fator de Crescimento Transformador ß (Tgfß) são sintetizados como proteínas precursoras inativas e dimerizadas. Os precursores são então cortados por membros da família proproteína convertase (PC), seja dentro da via secreta ou fora das células. Isso cria um mais fraco ligante ativo e ligado a dissulfeto e dois fragmentos de prodomínio1. Embora seja sabido há mais de 30 anos que o prodomínio dos precursores da família Tgfß é necessário para gerar um ligante ativo2, o entendimento de como os prodomínios contribuem para a função ligante é incompleto.

Embora o entendimento do processo de ativação proteolítica dos membros da família Tgfß permaneça incompleto, há um interesse crescente em entender quais motivos de consenso do PC são cleaved in vivo, se o decote ocorre em um compartimento subcelular específico ou extracelular, e se o prodomínio permanece covalentemente ou não covalentemente associado à ligadura3. Vários estudos têm demonstrado que o prodomínio não só guia a dobra de ligadura antes do decote4,5, mas também pode influenciar a estabilidade do fator de crescimento e a faixa de ação6,7,8,9, conduzir a formação de homodimers ou heterodimers10, ancorar o ligante na matriz extracelular para manter a latência de ligadura11, e em alguns casos, funcionar como um ligante em seu próprio direito de ativar heterologos sinalização12. Mutações heterozygous no prodomínio de muitos membros da família Tgfß estão associadas a olhos, ossos, rins, esqueléticos ou outros defeitos em humanos3. Esses achados destacam o papel crítico do prodomínio na geração e manutenção de um ligante ativo e ressaltam a importância de identificar e decifrar o papel dos produtos de decote desenvolvidos durante o amadurecimento proteolítico dos precursores da família Tgfß.

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para aspirar produtos de decote gerados durante a maturação de precursores da família Tgfß a partir da blastocoele de embriões X. laevis e, em seguida, analisá-los em imunoblots. Este protocolo pode ser usado para determinar se um ou mais motivos de consenso do PC em uma proteína precursora são cortados in vivo10,13, identificar os PC(s) endógenos que apertam cada motivo13,14, compare a formação in vivo de homodimers da família Tgfß versus heterodimers10 ou analise se mutações de pontos associadas a doenças humanas em precursores de Tgfß afetam sua capacidade de formar ligantes diméricos funcionais.

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Protocol

Todos os procedimentos descritos são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Utah. Os sapos estão alojados em uma instalação aprovada pela IACUC. Sapos machos são eutanizados pela imersão em tricaine seguindo cortando o ventrículo do coração. As sapos fêmeas são alojadas em laboratório por um máximo de 24 horas após a indução hormonal da desova para permitir a coleta de óvulos e depois devolvidas ao centro de cuidados.

1. Coleção de X. laevis Testes

  1. Anestesiar um macho sexualmente maduro em 0,2% tricaine(Tabela 1) por 30-40 min até que o animal não responda ao aperto de garras.
  2. Use fórceps sem cortes para afastar a pele da parede do corpo. Faça uma incisão horizontal na pele através do abdômen inferior usando uma tesoura cirúrgica. Faça uma incisão paralela na parede do corpo subjacente, e então uma terceira incisão perpendicular através da parede do corpo através da caixa torácica.
    1. Dobre os retalhos resultantes, localize o ventrículo do coração e corte a base para exsanguinar e garantir a morte.
  3. Retire os corpos de gordura amarelas do abdômen com fórceps sem cortes e localize os testículos de cada lado, subjacentes à base dos corpos gordos. Remova cada teste cortando-o dos corpos de gordura e de todas as vísceras presas usando uma tesoura cirúrgica.
  4. Transfira testículos para uma placa de Petri contendo 1x Solução de Barth Modificada (MBS) (Tabela 1). Enxágüe e remova quaisquer vasos sanguíneos aderentes ou vísceras anexadas.
    1. Transfira um teste para uma placa de Petri de 35 mm contendo tampão de testículo(Tabela 1) para uso imediato e armazene o outro em um tubo cônico de 10 mL preenchido com tampão de testis para uso posterior. Os testis devem ser armazenados a 4 °C quando não forem utilizados e permanecerão viáveis por pelo menos duas semanas.
      NOTA: Fotografias de isolamento de testículos podem ser encontradas na Referência 15.

2. Coleta e Fertilização de Ovos X. laevis

NOTA: Os sapos devem ser manuseados com luvas de vinil ou mãos lavadas antes e depois de manusear os sapos. Luvas de látex, loções e resíduos de detergente nas mãos humanas danificarão a pele frágil dos sapos.

  1. Na noite anterior à desova, injete 0,3 mL (1200 UI) de gonadotropina coriônica humana(Tabela 1) no saco linfático dorsal de duas ou três fêmeas X. laevis maduras usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 26 G. Use uma agulha nova para cada injeção.
  2. Após a injeção, coloque as fêmeas em um recipiente selado (não com ar apertado) em uma incubadora biológica de 18 °C. A desova geralmente começa 14-16 h depois.
    NOTA: Gavetas de plástico ou recipientes plásticos com orifícios de ar cortados na tampa funcionam bem para segurar as fêmeas durante a noite. Certifique-se de que a tampa está firmemente ligada para evitar que os sapos escapem e dessecam na incubadora.
  3. Segure a fêmea sobre uma placa de Petri de 100 mm contendo 1x MBS e aplique pressão suave no abdômen do sapo para expulsar ovos no prato.
  4. Corte um pequeno pedaço do testis (~1/5) usando uma lâmina de barbear e transfira-a para um tubo de 1,5 mL contendo ~500 μL de 1x MBS. Esmague com um pilão de pelota ou homogeneizador de tecido. Armazene a suspensão resultante do esperma no gelo ou a 4 °C para fertilização subsequente no mesmo dia.
  5. Incline a placa de Petri de 100 mm para derramar o máximo possível de 1x MBS e remova o restante usando uma pipeta de transferência de plástico. Aplique aproximadamente 100 μL de suspensão de esperma, adicione cerca de 1 mL de 0,1x MBS e gire para misturar.
    1. Depois de 5 min, inunde o prato com água da torneira descalorada ou 0,1x MBS e deixe ficar por 30 minutos.
      NOTA: A água pode ser desclolorada usando um filtro ou a água da torneira municipal pode ser deixada de pé por pelo menos 24 horas para permitir que o cloro se dissipe em regiões onde o cloro convencional é adicionado à água. Em áreas onde a clororamina é adicionada para desinfetar a água potável, a água deve, em vez disso, ser tratada com um condicionador comercialmente disponível que pode quebrar a cloromina.
      NOTA: Os ovos são coletados em uma solução de sal alto (1x MBS) para evitar a formação de uma camada de geleia, o que proporcionaria uma barreira à fertilização. Após a fertilização, a solução de baixo sal (água descalorada ou 0,1x MBS) permite a formação de jaleco e os ovos aderirão uns aos outros e ao prato. Os ovos fertilizados irão girar de tal forma que o polo animal pigmentado enfrente para cima dentro de 30 minutos. Se isso não acontecer, e os óvulos parecerem saudáveis sob o microscópio, a viabilidade do esperma é suspeita e pode ser necessário colher novos testículos.
  6. Despeje a solução que cobre os ovos e encha a placa de Petri com solução de cisteína recém-preparada(Tabela 1). Gire a solução no prato por 3-5 min até que a camada de geleia seja dissolvida e os ovos não estejam mais grudados um no outro ou no prato.
    1. Incline o prato e despeje cuidadosamente a solução de cisteína, ou remova com uma pipeta de plástico. Substitua por 1x água da lagoa de DeBoer(Tabela 1). Redemoinho para enxaguar e decantar.
    2. Repita uma lavagem com a solução de DeBoer, uma com 0,1x MBS e rechee o prato com 0,1x MBS. Depois de remover a camada de geleia, os ovos ficam mais frágeis e não devem ser expostos à interface ar-líquido.
  7. Mova os óvulos fertilizados para uma incubadora biológica de 16 °C ou deixe-os no banco à temperatura ambiente. Se deixado à temperatura ambiente, o primeiro decote ocorrerá 1-1,5 h após a fertilização, e os decotes subsequentes ocorrerão aproximadamente a cada 30 minutos. Em contrapartida, se os embriões forem incubados a 15-16 °C, os decotes ocorrerão aproximadamente a cada hora e será possível injetar um número maior de embriões de uma determinada desova.

3. Microinjeção de Embriões X. laevis

  1. Aqueça e puxe capilares de vidro para um ponto fino usando um puxador de micropipette com as seguintes configurações: Tração de duas etapas; Calor 1: 67,4 °C; Calor 2: 62 °C.
    NOTA: Estas configurações são específicas para o puxador de micropipette e capilares de vidro utilizados aqui(Tabela de Materiais).
  2. Sob um microscópio dissecando, corte a ponta de uma agulha puxada perto do final usando fórceps Dumont #5. A agulha deve ser afiada, mas não tão fina que a ponta se dobra quando entra em contato com o embrião. A Figura 1 mostra um exemplo de uma agulha apropriadamente puxada que não foi cortada para microinjeção (A) e uma que foi cortada (B).
  3. Insira a agulha em um suporte de agulha conectado a um microinjetor. Coloque o suporte da agulha em um micromanípulo. Coloque 2-4 μL de RNA sintético tampado codificando a proteína precursora de Tgfß para ser analisada em um pequeno pedaço de parafilme sob um microscópio dissecando.
    1. Usando o micromanipulador, abaixe a agulha na gota e use a função de preenchimento no microinjetor para aspirar RNA na agulha. Certifique-se de manter a agulha abaixo da superfície da gota, e observar o progresso sob o microscópio para evitar aspirar ar na agulha.
      NOTA: Se os anticorpos que reconhecem o domínio prodomínio e/ou ligante do precursor de Tgfß a serem analisados não estiverem disponíveis, a sequência de codificação de uma tag de epitope (por exemplo, V5, myc, Flag) pode ser inserida no quadro cDNA que será usado como modelo para transcrição de RNA. A bioatividade in vivo da proteína marcada deve ser comparada com a de proteína não marcada para garantir que o epítope não interfira com a dobra adequada, o decote ou a atividade.
  4. Ejete uma gota da solução RNA no ar e meça o tamanho da gota usando um micrômetro montado no estágio de injeção ou na ocular do microscópio. Ajuste o tamanho da gota para aproximadamente 10 nL utilizando os controles de tempo e pressão no microinjetor.
    NOTA: As concentrações de RNA na faixa de 5-20 ng/μL são apropriadas para fornecer 50-200 pg de RNA em cada embrião. Essa quantidade de RNA é geralmente suficiente para detectar produtos de decote em aspirados de 10-20 embriões. É melhor apontar para a menor dose de RNA que dá um sinal detectável em imunoblots. Maiores quantidades de RNA podem causar defeitos gastrulatórios, que interferem na expansão da blastocoele.
  5. Mova os embriões para um prato de injeção ou bandeja contendo 5% de Ficoll em 0,1x MBS(Tabela 1) quando chegarem ao estágio celular 2-4. Uma placa de Petri de 35 mm equipada com um pedaço de malha de nylon na parte inferior pode servir como uma placa de injeção barata que manterá os embriões imobilizados. Insira a agulha perto do polo animal e injete 10 nL de RNA em uma célula de cada embrião.
    NOTA: Os embriões podem ser facilmente injetados a qualquer momento entre os estágios de uma e 16 células. Injetar o embrião depois de ter cortado garante que o óvulo foi fertilizado e que o embrião é saudável. A localização exata da injeção não é essencial. Uma descrição mais detalhada da desova, cultura e microinjeção de RNAs em embriões X. laevis pode ser encontrada na Referência 15.
  6. Transfira os embriões injetados em uma placa de Petri de 35 mm preenchida com 5% de Ficoll em 0,1x MBS(Tabela 1). Coloque as pequenas placas dentro de uma placa de Petri de 150 mm e cubra livremente com uma tampa para evitar que a mídia cultural evapore. Cultura os embriões durante a noite em 15-16 °C.
    NOTA: A colheita de embriões em Ficoll ajuda a curar o local da injeção. Se forem utilizadas agulhas finas, o cultivo em 2-3% ficoll é suficiente, enquanto 5% ficoll é preferido se o dano aparente for observado. Manter os embriões na solução Ficoll por 1-2 h após a injeção é suficiente para ajudar na cura, mas a incubação noturna não danifica o embrião desde que a solução seja alterada antes do início da gastrulação.

4. Extração e Análise de Blastocoele de produtos de decote Tgfß

  1. Na manhã seguinte após a injeção, remova a solução Ficoll e remova os embriões mortos ou moribundos. Enxágüe os embriões uma ou duas vezes com 0,1x MBS e cultue os embriões em 0,1x MBS no banco à temperatura ambiente.
    NOTA: Os embriões também podem ser devolvidos à incubadora biológica de 16 °C para retardar o desenvolvimento.
  2. Aqueça e puxe capilares de vidro para um ponto fino usando um puxador de micropipette com as seguintes configurações: Tração de dois passos; Calor 1: 67,4 °C; Calor 2: 62 °C.
    NOTA: Estas configurações são específicas para o puxador e capilar de vidro usado aqui (Tabela de Materiais).
  3. Sob um microscópio dissecando, corte a ponta de uma agulha puxada usando fórceps. Para evitar entupimento, a abertura de uma agulha usada para aspiração blastocoele deve ser maior do que em uma agulha usada para microinjeção. Um exemplo de uma boa agulha puxada e recorada para ser usada para aspiração blastocoele é mostrado na Figura 1C. Insira a agulha de aspiração no suporte da agulha conectada a um microinjetor e conecte o suporte da agulha a um micromanipulador.
    NOTA: O diâmetro ideal da agulha é determinado empiricamente por tentativa e erro. Agulhas com um grande diâmetro enchem muito rapidamente e tornam mais provável que detritos celulares entrem na agulha. Em contraste, agulhas de diâmetro muito pequeno provavelmente ficam entupidas. Uma vez que uma agulha apropriada é gerada, é útil gerar múltiplas agulhas cortadas na mesma posição.
  4. Coloque embriões em uma bandeja de injeção ou prato recheado com 0,1x MBS quando chegarem cedo ao estágio gastrula médio (estágio 10-11).
  5. Insira a agulha abaixo da superfície do embrião perto do polo animal. Pressione o botão de preenchimento no microinjetor enquanto olha através do microscópio dissecando para manter um olho na agulha e no embrião. Ao longo de alguns segundos, o nível de fluido claro aumentará na agulha e o embrião entrará em colapso e se tornará côncavo.
    1. Se a matéria branca turva entrar na agulha, solte o botão de preenchimento e pulso o botão de injeção uma ou mais vezes para ejetar qualquer matéria nublada, que consiste em detritos celulares que provavelmente contêm proteases.
      NOTA: Se a blastocoele entrar em colapso e os detritos celulares entrarem na agulha assim que o botão de preenchimento for pressionado, isso indica que a abertura na agulha é muito grande. Se a blastocoele não entrar em colapso, mas a matéria branca entra na agulha imediatamente, isso mostra que a agulha foi inserida muito profundamente e está tocando o chão blastocoele. Ejete a matéria branca, e passe para o próximo embrião. A taxa de aspiração pode ser mais cuidadosamente controlada pulsando o botão de preenchimento em vez de pressioná-lo continuamente. Isso é particularmente importante se a abertura na agulha for maior do que a ideal.
  6. Repita o passo 4.5 até que o fluido tenha sido aspirado a partir da blastocoele de 10-20 embriões.
    NOTA: Geralmente, o fluido blastocoele aspirado de 10-20 embriões é suficiente para detectar produtos de decote em imunoblots. No entanto, isso pode variar dependendo da qualidade do anticorpo e deve ser determinado empiricamente.
  7. Coloque um pedaço de parafina na bandeja de injeção e pipeta 1 μL de água sem nuclease sobre ele. Submergir a agulha sob a gota de água e pressione o botão de injeção para dissipar o fluido blastocoele na água.
    1. Alternativamente, ejete o fluido diretamente no parafilme, mas neste caso, pulso o botão de injeção em vez de segurá-lo para baixo. Isso expulsa o fluido sob menor pressão, impedindo-o de achatamento no parafilme, dificultando a elaboração em uma pipeta.
  8. Transfira o fluido blastocoele para um tubo de microcentrífuga estéril no gelo. Espere colher aproximadamente 0,3-0,5 μL de fluido blastocoele por embrião. Adicione água sem nuclease para ajustar o volume final a 30 μL.
  9. Transfira os embriões esgotados por fluido blastocoele para um tubo separado no gelo. Remova o excesso de 0,1x MBS e adicione 200 μL de tampão de embrião refrigerado (4 °C) (10 μL por embrião)(Tabela 1). Pipeta os embriões para cima e para baixo 10-20 vezes usando uma micropipette até que eles estejam totalmente homogeneizados e nenhum aglomerado permaneça.
  10. Centrifugar os embriões homogeneizados em uma microcentrifuuagem refrigerada a 10.000 x g por 10 min. Remova 160 μL do supernante usando uma pipeta P200 e transfira para um novo tubo no gelo, tomando cuidado para evitar as proteínas da gema branca e outros detritos celulares na metade inferior do tubo.
    1. Repita a microcentrifugação uma vez e transfira 128 μL do supernatante claro para um novo tubo no gelo. Neste ponto, os lises de embrião limpos e o fluido blastocoele podem ser armazenados a -80 °C pelo tempo desejado.
      NOTA: Com algumas exceções, as proteínas precursoras de Tgfß não são secretadas na blastocoele e só serão detectadas nos lises embriões empobrecidos. Em contraste, os produtos de decote da família Tgfß são vistos principalmente no fluido blastocoele. É útil para colher e analisar tanto os licosatos embrionários quanto o fluido blastocoele para a maioria dos propósitos. No mínimo, isso fornece um controle positivo para garantir que o precursor seja robustamente traduzido e estável. Além disso, permite comparar proporções relativas de produtos de decote com precursores entre diferentes tipos selvagens ou proteínas mutantes, identificar mutações que permitem que precursores intactos sejam secretados em fluido blastocoele (por exemplo, mutações dentro do motivo de consenso do PC que permitem dobrar e secreção adequada sem decote, nesse caso o precursor intacto é detectado tanto no embrião quanto no fluido blastocoele) ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram dobras erradas, ou mutações que geram desdobrados, proteínas não cleaváveis (nesse caso, o precursor será detectado no lise embrião, mas os produtos de decote estarão ausentes no fluido blastocoele).
  11. Proteínas deglycosilato presentes no fluido blastocoele com PNGase F neste momento, seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA Não há necessidade de desglicar as proteínas precursoras presentes no lise embrionário, uma vez que representam reguloso endoplasmático (ER)--formas residentes do precursor que não possuem os complexos oligossacarídeos ligados ao N removidos pela PNGase F. Em contrapartida, os produtos de decote presentes no fluido blastocoele passaram pela rede trans-Golgi (TGN) onde os carboidratos são modificados e agora podem ser removidos pela PNGase F. Após a deglycosylation, os produtos de decote migram como uma banda mais fortemente condensada em géis SDS, o que pode ajudar na visualização, quantificação e identificação precisa de produtos de decote. Isso não é estritamente necessário, mas pode ser útil, por exemplo, se você está tentando distinguir entre homodimers e heterodimers com base em padrões de migração ou se um produto de decote contém carboidratos heterogêneos que fazem com que ele migrem como uma banda ampla e difusa.
  12. Adicione 5 μL de redução de 4x tampão de amostra(Tabela 1) a 15 μL de fluido blastocoele e 15 μL de lise de embrião esclarecido. Adicione 5 μL de tampão de amostra 4x não redutor(Tabela 1) aos 15 μL restantes do fluido blastocoele. Aqueça a 100 °C por 5 min e coloque no gelo.
    NOTA: Analisar proteínas em condições não redutoras é essencial para analisar a formação de ligantes homodimericos ou heterodimericos, mas não é necessário se analisar apenas locais de decote ou níveis de proteínas cortadas. Com algumas exceções, fragmentos de prodomínio são secretados como monômeros. Além disso, as proteínas precursoras presentes no lisenato embrionário são desdobradas principalmente, monômeros residentes do ER. Assim, não há necessidade de analisar esses produtos em condições não redutoras.
  13. Resolva proteínas precursoras e produtos de decote por eletroforese em 15% de Géis SDS/poliacrilamida.
  14. Transfira proteínas do gel para uma membrana PVDF usando transferência eletroforética.
  15. Incubar membranas com anticorpos apropriados que reconhecem o prodomínio e o domínio de ligantes (ou tags de epítope inseridas nesses domínios), lave e incuba com anticorpos secundários adequados. Visualize proteínas com chemiluminescência ou imagem fluorescente.

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Representative Results

O objetivo do experimento descrito abaixo foi determinar se bmp4 e Bmp7 formam heterodimers (dimers compostos de um ligante Bmp4 e um ligante Bmp7), homodimers (compostos por dois ligantes Bmp4 ou dois Bmp7), ou uma mistura de cada um quando são co-expressos em X. laevis. Os dados apresentados na Figura 2 são extraídos de um estudo publicado anteriormente10. Figura 2A é um esquema que mostra produtos de decote gerados pela maturação proteolítica de precursores homodimericos Bmp4 ou Bmp7 ou precursores heterodimericos Bmp4/7. O Bmp4 é cortado em dois locais dentro do prodomínio para gerar dois fragmentos de prodomínio (verde escuro e amarelo) e um fragmento de ligante dimeric (verde claro) que migra a ~26 kDa em géis SDS-PAGE. Bmp7 é cortado em um único local para gerar um fragmento de prodomínio (marrom) e um fragmento de ligante dimeric (rosa) que migra a ~35 kDa. Ligantes heterodimeric migram a ~30 kDa. A barra de prata nos dimers ligantes representa uma tag myc-epitope inserida neste domínio.

Os precursores de RNA codificação Bmp4myc ou Bmp7myc (200 pg), ou ambos OS (100 pg de cada) foram injetados em embriões X. laevis no estágio celular 2-4. Os embriões foram cultivados durante a noite a 16 °C até chegarem ao estágio gastrula inicial. Neste ponto, o fluido foi aspirado da blastocele de 20 embriões em cada grupo e a água estéril foi adicionada para levar o volume a um total de 30 μL. Após a deglycosylation, cada amostra foi dividida em dois tubos. A redução do buffer amostral foi adicionada a um tubo, e o buffer amostral não redutor foi adicionado ao outro. As amostras foram aquecidas a 100 °C por 5 min. As proteínas foram então separadas por SDS/PAGE e os imunoblots foram sondados com anticorpos que reconhecem a tag míc-epitope(Figura 2B). Em condições de redução, uma única banda correspondente aos monômeros Bmp4 cerrados e a uma banda migratória mais lenta correspondente aos monômeros BMP7 cerrados foram detectados em lises de embriões expressando apenas Bmp4 ou Bmp7,respectivamente (Figura 2C, D, painel inferior, faixas 1, 2). Ambas as bandas foram detectadas em embriões co-expressando Bmp4 e Bmp7(Figura 2C,D, painel inferior, faixa 3). Quantidades relativamente equivalentes de monômeros Bmp4 e Bmp7 estavam presentes em cada um dos três grupos (painel inferior, redução). Neste experimento, quando as proteínas foram separadas em condições não redutoras, foi detectada uma única faixa heterodômera Bmp4/7 madura de mobilidade intermediária, juntamente com uma quantidade de traço de homodimer Bmp4 em embriões co-expressando Bmp4 e Bmp7 (Figura 2C, painel superior). A partir desses resultados concluímos que se os níveis equivalentes de proteínas precursoras Bmp4 e Bmp7 são expressos em embriões xenopus, eles formam preferencialmente heterodimers, em vez de qualquer homodimer. No experimento mostrado na Figura 2D,significativamente mais proteína Bmp7 está presente em relação ao Bmp4 (painel inferior, reduzindo). Como resultado, em embriões que expressam proteínas precursoras Bmp7 e Bmp4, os homodimers Bmp4 não são detectados e, em vez disso, o Bmp4 disponível está presente como um heterodimer Bmp4/7, e o excesso de Bmp7 forma homodimers. Embora este experimento não seja o ideal, pois o objetivo era co-expressar a quantidade equivalente de Bmp4 e Bmp7 precursor, os resultados ainda são consistentes com a conclusão de que Bmp4 e Bmp7 formam preferencialmente heterodimers sobre qualquer homodimer quando co-expressos.

Figure 1
Figura 1. Agulhas de injeção e aspiração. Fotografias de agulhas representativas que foram puxadas, mas não cortadas (A) puxadas e cortadas para uso como agulha de injeção (B) ou puxadas e cortadas para uso como agulha de aspiração(C) são mostradas. A seta e a ponta de flecha em(A) indicam o ponto em que o vidro foi cortado para gerar uma agulha para injeção e aspiração, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Análise de ligantes Bmp cortados extraídos do fluido X. laevis blastocele. (A) Os produtos de decote gerados a partir de proteínas precursoras homodimeric ou heterodimeric ou heterodimeric e posição da etiqueta de epítope míclico (barra de prata) são mostrados esquematicamente(B) Diagrama esquemático mostrando o tempo de injeção e extração de fluido blastocoele. (C-D) Os embriões de xenopus foram injetados com 200 pg de Bmp7 ou Bmp4 RNA, ou com Bmp4 e Bmp7 RNA misturados (100 pg cada). No estágio gastrula, o fluido foi extraído da blastocoele do mesmo número de embriões em cada grupo experimental. As proteínas presentes no fluido blastocoele foram deglycosiladas e separadas por SDS-PAGE. Anticorpos que reconhecem a etiqueta myc-epitope foram usados para sondar imunoblots. A posição relativa de monômeros e dimmers de ligantes imunoretivos é mostrada esquematicamente à direita de cada gel. Linha preta em(C) indica a remoção de uma pista intervenidora na mancha. Os dados apresentados são extraídos de um estudo publicado anteriormente10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução Composição
0,2% Tricaine 20 g de Tricaine dissolvido em água deionizada, ajuste o pH para 7,4 por adição de bicarbonato de sódio
10x MBS 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgSO4, 0,14 mM Ca(NO3)2, 0,41 mM CaCl2; Ajuste para pH 7.5 com NaOH. O estoque de 10x MBS pode ser armazenado a 4 °C e diluído conforme necessário.
Solução de cisteína de 2% 2 g de cisteína por 100 mL de água deionizada, ajuste o pH para 7,8-8,0 com hidróxido de sódio.  Faça fresco a cada dia.
20x Água da lagoa de DeBoer 100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Ajuste para pH 7.4 com NaHCO3. 20x estoque da água da lagoa de DeBoer pode ser armazenado a 4 °C e diluído conforme necessário.
4x tampão amostral não redutor 200 mM Tris pH 6.8, 8% SDS, 0,4% azul bromofenol, 40% glicerol.
4x reduzindo o buffer amostral 200 mM Tris pH 6.8, 8% SDS, 0,4% azul bromofenol, 40% glicerol, 14,4 M ß-mercaptoethanol
Solução Ficoll 5% 25 g de Ficoll em 500 mL 0,1x MBS, ajuste o pH para 7,5 com hidróxido de sódio.  Armazenar a 4 °C.
Tampão de lise de embrião 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 2,5 % NP-40.  Armazenar a 4 °C.
Gonadotropina coriônica humana Usando uma seringa de 3 mL presa a uma agulha de 19 G, injete 2,5 mL de água estéril através da rolha de borracha de um frasco de gonadotropina coriônica humana (10.000 UI ). Armazenar a 4 °C .
Tampão testis Soro bovino fetal de 10%, 1% caneta/estreptococo (penicilina 100U/mL, estreptomicina de 100 mg/mL em 1x MBS

Mesa 1.

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Discussion

As principais vantagens do protocolo descrito aqui são que ele pode ser concluído relativamente rapidamente, não requer reagentes caros e fornece uma fonte de produtos concentrados de decote Tgfß em condições fisiológicas. Outra vantagem é que permite analisar proteínas marcadas por epítope e, assim, contornar a escassez de anticorpos disponíveis comercialmente que reconhecem a maioria dos prodomínios da família Tgfß. Embora também seja possível analisar o decote das proteínas precursoras tgfß marcadas por epitope em células de mamíferos cultivadas transfectadas, existem várias vantagens em usar X. laevis. Os embriões X. laevis expressam todos os quatro membros da família PC que são candidatos a convertidos endógenos Tgfß (Furin, Pcsk5, Pcsk6 e Pcsk7)13,14,16. Algumas linhas de células de mamíferos não expressam um ou mais PC, exigindo a expressão ectópica tanto da proteína precursora quanto de sua convertase para examinar o decote17. Uma consideração mais importante é que níveis muito altos de proteínas precursoras geradas por transfeto transitório de células transformadas podem levar a artefatos, como a secreção de produtos de decote desdobrados, que podem ocorrer se os níveis precursores excederem a capacidade de controle de qualidade no ER18. Isso pode mascarar o efeito de mutações deletérios na dimerização precursora e no decote, uma vez que os produtos de decote desdobrados aparecem na mídia e o descompactamento não seria detectado a menos que a atividade seja avaliada. Em contrapartida, experimentos utilizando embriões X. laevis detectam prontamente defeitos na dobra, levando à perda de precursor devido à resposta proteica mal dobrada no ER ou à migração aberrante de produtos de decote em condições não redutoras10,18.

Durante o procedimento de aspiração blastocoele, é essencial tentar extrair uma quantidade aproximadamente equivalente de fluido blastocoele de cada embrião, particularmente se, por exemplo, o objetivo era comparar produtos de decote gerados a partir de tipos selvagens e precursores mutantes. Esta é uma ciência inexata, mas aspirar por uma quantidade aproximadamente igual de tempo de cada embrião ajuda a normalizar o volume. Além disso, aspirar fluido de um maior número de embriões em cada grupo ajuda a normalizar quaisquer diferenças de volume entre embriões individuais.

Reações in vitro de decote são um procedimento alternativo que pode ser usado para determinar se um determinado motivo de PC presente em uma proteína precursora de Tgfß é cortado e para identificar e/ou descartar potenciais PCs como conversões endógenas para um determinado substrato. Os protocolos existentes descrevem um simples ensaio no qual proteínas precursoras radiolabeled são geradas in vitro, usando regulócitos de coelho, por exemplo, ou in vivo, usando oócitos X. laevis. Os substratos são então incubados in vitro com PCs recombinantes candidatos e produtos de decote analisados por eletroforese e autoradiografia19. Embora este protocolo forneça uma maneira rápida e fácil de determinar se uma proteína é um substrato de PC e identificar quais potenciais locais de decote são utilizados in vivo,é improvável que as proteínas precursoras sejam adequadamente dobradas ou dimerizadas e, portanto, as informações de decote obtidas a partir desses experimentos podem não refletir a situação in vivo.

Uma deficiência do protocolo que descrevemos aqui é que é impossível visualizar proteína precursora dobrada e dimerizada em embriões X. laevis. O mesmo acontece em outros sistemas de expressão ectópica, como células de mamíferos transitoriamente transfectadas, uma vez que a proteína precursora monomérica se acumula dentro do PS em níveis muito mais altos do que os precursores dimerizados e dobrados pós-ER. O precursor dimerizado é rapidamente cortado e secretado uma vez que deixa o ER. Se é essencial analisar a dimerização e a dobra de proteínas precursoras, um procedimento alternativo útil é examinar o tráfico e o decote de precursores radiolabeled em X. laevis oocitos20. A alta sensibilidade da autoradiografia, juntamente com o fato de que as proteínas se movem através do sistema secreto mais lentamente em oócitos do que em células ou embriões mamíferos cultivados permite detectar proteínas precursoras dimerizadas dentro dos oócitos e testar se as proteínas são devidamente dobradas e deixaram o ER examinando seu status de glicoseção18, 21.

Em resumo, este protocolo fornece um método rápido e simples para analisar produtos de decote gerados pela maturação das proteínas precursoras da família Tgfß.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Mary Sanchez pelo excelente cuidado com os animais. A pesquisa dos autores é apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH/NICHD) que concede R01HD067473-08 e R21 HD102668-01 e pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK/NIH) doação R01DK128068-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

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References

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Biologia do Desenvolvimento Edição 173
Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de <em>Embriões Xenopus laevis</em>
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Kim, H. S., Christian, J. L.… More

Kim, H. S., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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