Zebrafisk Undgåelse og Thigmotaxis Assay: En high-throughput metode til at undersøge larve adfærd som reaktion på aversive Visual Stimulus

- Til at begynde med skal du placere fem larver i hver vognbane på en sekssporet agaroseplade. Tilsæt ekstra ægvand, men overfyld ikke banerne. Ægvand indeholder methylenblåt, hvilket forhindrer skimmelvækst. Lad larverne akklimatisere i mindst 10 minutter for at reducere deres stress.

Placer nu brøndpladen i et billedrum over en bærbar computerskærm. Fokuser kameraet på brøndpladen.

Derefter skal du registrere larvernes opførsel placeret på den tomme baggrund ved at tage time-lapse-billeder. Vis en bevægende rød bjælke på den bærbare skærm, og tag tid bortfalder billeder af larverne som reaktion på den bevægelige røde bjælke.

Den røde form opfattes som en trussel, en afvisende stimulus og forårsager larvernes stress. Som reaktion undgår de baren og demonstrerer positiv thigmotaxis. Positiv thigmotaxis er fiskens reaktion på stimulus, der søger kontakt med væggen og svømmer i kanten af banen.

I eksempelprotokollen vil vi analysere undgåelse og thigmotactic reaktioner af zebrafisk larver behandlet med farmaceutiske forbindelser eller miljømæssige toksiner.

- For at begynde billedoptagelse skal du forsigtigt flytte larverne fra petriskålen til agarosebanen for at hjælpe med at reducere larvernes stress. Op til 20 larver kan placeres i hver vognbane, men fem larver pr. Vognbane bruges typisk til at lette den mest nøjagtige sporing af svømmehastighed og til at reducere antallet af larver, der er nødvendige pr. Eksperiment.

Fyld banerne med ægvand med eller uden lægemidler eller toksiksmidler afhængigt af eksperimentet. Fyld ikke banerne hele vejen, før de er placeret i billedskabene for at forhindre overløb. Tillad 10 minutter for larverne at akklimatisere. Efter akklimatiseringsperioden skal du placere fire plader i hånden direkte oven på den bærbare skærm.

På dette tidspunkt kan banerne toppes med ægvand eller kemisk behandling, så det er niveau med toppen af banen for at eliminere skygger på kanterne af banerne på billederne.

Programmere computeren til time lapse fotografering, tage billeder hvert sjette sekund for i alt 300 billeder pr eksperiment.

Brug en PowerPoint-præsentation som en afvisende stimulus for larverne. I denne demonstration starter PowerPoint med en tom hvid baggrund i 15 minutter efterfulgt af 15 minutter af en bevægelig rød bjælke på den øverste halvdel af pladen. For at undgå fordampning af væsken inden for agarosebanerne skal du holde den maksimale billedtid under en time.