Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: een methode met hoge doorvoer om larvaal gedrag te onderzoeken als reactie op aversieve visuele stimulus

- Plaats om te beginnen vijf larven in elke laan van een zesbaans agaroseplaat. Voeg extra eiwater toe, maar vul de banen niet te vol. Eiwater bevat methyleenblauw, wat schimmelgroei voorkomt. Laat de larven minstens 10 minuten acclimatiseren om hun stress te verminderen.

Plaats nu de putplaat in een beeldkamer boven een laptopscherm. Zet de camera op de putplaat. Vul de baan volledig met eierwater.

Noteer vervolgens het gedrag van de larven die op de lege achtergrond zijn geplaatst door time-lapse-afbeeldingen te maken. Geef een bewegende rode balk weer op het laptopscherm en maak timelapse-afbeeldingen van de larven als reactie op de bewegende rode balk.

De rode vorm wordt gezien als een bedreiging, een aversieve stimulus, en veroorzaakt de larven stress. Als reactie, ze vermijden de bar en tonen positieve thigmotaxis. Positieve thigmotaxis is de reactie van de vis op de stimulus op zoek naar contact met de muur en zwemmen aan de rand van de baan.

In het voorbeeldprotocol zullen we de vermijding en thigmotactische reacties analyseren van zebravislarven die worden behandeld met farmaceutische verbindingen of milieutoxines.

- Om te beginnen met het vastleggen van het beeld, verplaatst u de larven voorzichtig van de Petrischaal naar de agarosebaan om de stress van larven te verminderen. Er kunnen maximaal 20 larven in elke rijstrook worden geplaatst, maar vijf larven per baan worden meestal gebruikt om de meest nauwkeurige tracking van de zwemsnelheid te vergemakkelijken en om het aantal larven dat nodig is per experiment te verminderen.

Vul de banen met eierwater met of zonder geneesmiddelen of giftige stoffen, afhankelijk van het experiment. Vul de banen niet helemaal totdat ze in de beeldvormingskasten zijn geplaatst om overloop te voorkomen. Laat de larven 10 minuten acclimatiseren. Plaats na de acclimatisatieperiode vier platen met de hand direct bovenop het laptopscherm.

Op dit moment kunnen de rijstroken worden aangevuld met eiwater of chemische behandeling, zodat het vlak is met de bovenkant van de baan, om schaduwen aan de randen van de rijstroken in de afbeeldingen te elimineren.

Programmeer de computer voor timelapsefotografie en maak elke zes seconden foto's voor in totaal 300 beelden per experiment. Stel de camera in op een lagere resolutie voor beeldvorming op videosnelheid. Hoewel de lagere resolutie de opnamen beperkt tot één plaat met meerdere putten, zijn de video-opnamen geschikt voor het weergeven van snelle zwemgebeurtenissen.

Gebruik een PowerPoint-presentatie als een aversieve stimulus voor de larven. In deze demonstratie begint de PowerPoint met een lege witte achtergrond gedurende 15 minuten, gevolgd door 15 minuten van een bewegende rode balk op de bovenste helft van de plaat. Om verdamping van de vloeistof binnen de agarosebanen te voorkomen, moet u de maximale beeldtijd tot minder dan een uur houden.