Name: 운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 운동 중 포유류 뉴런의 생리적 반응을 기록하고 형태학 및 신경화학적 특성을 분석하는 방법을. 이 기술은 뉴런 연결과 시냅스 입력을 보존하여 생체 내 기능 연구에 활용됩니다.

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나는 생체내 세포 기록하고 세포내 얼룩 기술의 초기 개발에 도움을 브라운과 데이비드 맥스웰의 초기 교육 앤서니 테일러 감사합니다. 나는 collocalization 매크로에 대한 도움말 M. 실버 주셔서 감사합니다. 많은 학자 누구와 나는 R. 동아, M. 모리 타니, P. 루오, R. Ambalavanar를 포함하여이 기술의 개발에 대한 통찰력을 제공하는 협력 있습니다. 이 기술은 NIH 보조금 DE10132, DE15386 및 RR017971에서 상당한 지원 개발되었습니다.

1. 동물 준비 <ol><li> pentobarbital 나트륨 (50mg/kg IP) 및 난방 패드에 장소와 쥐 마취. 동물 가위로 사후 두개골을 overlying 피부를 면도. 발가락이 palpebral 반사의 부재로 모근뿐만 아니라 경우 마취 수준의 수술 수준이 탈퇴 반사와 발성의 부재에 대한 테스트에서 얻은되었음을 보증하기 위해 동물을 확인합니다. 마취 15 분 간격의 수준을 확인하고 나트륨 pentobarbital 15mg/kg의 주사 45 분마다에 의해 anesthetisa의 수술 수준을 유지합니다. </li><li> 무균 기술을 사용하고 복부와 허벅지 안쪽에 의해 형성 포복 절도에 사타구니 지역에서 절개 단지 말초하고 대퇴 정맥에 정맥 (1mm 직경, 클레이 아담스)과 대퇴 동맥에 삽입합니다. 턱밑 지역의 정중선 절개를 만들고, infrahyoid 근육을 반영합니다. 기관의 작은 절개를하고 환기를 허용하도록 정맥 (2mm 직경)를 삽입합니다. 동맥 정맥을 통해 place.Monitor 체계 diastolic 및 수축기 혈압에 확보 cannual trachael 주위에 치료를 타이. 철수와 palpebral 반응을 모니터링하는 것 외에도 지금 마취의 수준을 평가하기 위해 혈압을 모니터링합니다. 정맥 정맥을 통해 필요할 때 추가적인 마취를 관리할 수 있습니다. </li><li> stereotaxic 프레임에 쥐 장소와 소뇌를 폭로 craniotomy을 수행합니다. 쥐 때문에 환기에 tracheal 정맥을 연결합니다. humidified 공기와 100/min의 속도 2cm 3의 부피와 동물을 환기. 1cm H 2 O의 긍정적인 최종 날숨 압력이 폐 붕괴를 방지하기 위해 유지되어야합니다. 매 15 분 무기폐을 방지하기 위해 폐가 hyperinflate. 다음 예열 미네랄 오일 (30 ° C)와 함께 두뇌의 표면을 커버. 직접 두정 골과 interparietal 뼈 사이의 교차점 아래에있는 큰 정맥 구멍을 피하기 위해주의하십시오. </li><li> 전자기 진동에 결합 막대에 cyanoacrylate 접착제를 적용하고 턱뼈의 치극이라고에있는 막대를 부착합니다. 중 A / D 컴퓨터 출력 또는 신호 발생기의 진동에 mandible 사용하는 명령 신호를 이동합니다. </li><li> craniotomy에 인접한 피부 아래 siliver - 실버 염화물 접지 전극을 배치합니다. </li></ol> 2. 전극 준비 <ol><li> 수평 microelectrode의 풀러를 사용하여 석영 또는 aluminosilicate 유리의 microelectrodes를 조작. </li><li> 0.25M KCl과 0.5M 트리스 버퍼 HCL (산도 7.6) 또는 호수에서 2 % tetramethlyrhodamine (산도 6)에 녹아있는 5-10%의 biotinamide로 microelectrode를 입력합니다. 전극 시험기와 전극 임피던스를 확인합니다. 대구경 axons에서 기록하려면 60 - 80M Ω의 임피던스와 전극을 작은 axons과 interneurons 80 - 150MΩ의 임피던스와 전극을하십시오. </li><li> 전위계의 머리 단계에 microelectrode를 놓습니다. 동물의 머리 뒤에 위치에 고정되는 작은 망원경 (동봉 십자선과 함께 20X)을 통해 전극을 시각화. 이 전극은 stereotaxically 큰 정밀도로 위치를 수 있기 때문에 망원경을 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 3. Electrophysiological 기록 및 세포 염색법 <ol><li> 피아 메이터의 작은 오프닝을 만들고 전극은 머리를 닿을 때 피드백 신호가 생산되도록 커패시턴스 피드백을 받으려는. 이것은 두뇌의 표면의 정확한 위치를 수 있습니다. </li><li> 반복 mandibular 변위를 생산 및 스테핑 모터의 두뇌에 전극 사전. </li><li> DC 가능성에 갑자기 방울로의 연​​결을 impalements을 인식하고 지속적인 시냅스 활동에 의해 intrasomatic의 연결 impalements를 확인합니다. 커패시턴스의 overcompensation으로 전극을 윙윙하거나 거의 성공적인 세포 침투를 생산하지 도청. 때문에 전극의 높은 임피던스의의 연결 반응이 거의 침투하기 전에 관찰되지 않습니다. </li><li> 당신이 신경을 찌르려고하고 침투가 안정 것으로 간주되면 램프 길게 및 사인 턱 운동을 사용하여의 연결 반응을 특징 5.지도 신경 세포의 수용 필드를 비 전도성 프로브로 머리 주위 피부와 내부 구강을 탐색하여 나무 막대기 등. 연구에 관련된 경우, 그러한 근육 수축 및 유해 자극과 같은 다른 기능 관련 자극에 신경 세포의 반응을 조사 6. 프라이 머리 도입 성의 nociceptive의 연결 수용체가 nociceptive 자극에 반응. 같은 pentobarbital 나트륨과 같은 일반적인 anesthesetics은 기본 수입 성의 뉴런에서 axonal 전도를 차단하는 것이 아니라 신경 전송을 우울하게하지 않습니다. 따라서 기본 수입 성의 축삭의 연결에 axonal 전도는 보존됩니다. </li><li> 15 70nA 분 총 주입 시간 (DC, 1 4nA) 전류 주입. 현재 분사하는 동안 전극 침투를 모니터링하고 막 잠재력이 - 30mV보다 긍정 될 경우에는 중단.</li></ol> 4. 조직 처리 <ol><li> (0.9 % NaCl 38 헹굼 혈관과 pentobarbital의 과다 복용 (140mg/kg IV)와 perfuse하여 동물을 안락사 ° C 헤파린 500 단위 및 1ml 2 % 포함하는 0.1M 인산 버퍼에 4 % paraformaldehyde (산도 7.4) 다음 xylocaine . </li><li> 중 전두엽, 화살이나 수평면에 vibratome를 사용하여 50 100μm의 두뇌와 섹션을 제거합니다. Secions 25 ° C PBS에 부유를 수집하고 있습니다. </li><li> 1-2% 정상 염소 혈청의 잠복기, 1 % 트리톤 0.01M PBS에 X - 100 아비딘 비오틴 단지에 부화 (1시 50분 엘리트 Vectastain) 다음으로 DAB를위한 두뇌를 처리합니다. H 2 O 2와 니켈 - DAB를 사용하여 섹션을 반응. 텍사스 레드, 4 박 PBS에 아비딘 - 비오틴 복합 (1시 50분)에 품어 섹션 ° C 후 4 ° C 하룻밤에 PBST에 4% 텍사스 레드 아비딘 DCS에서 품어.위한 처리 23 ° C.에 형광 Nissl 얼룩 (NeuroTrace) 20 분들과 섹션 Counterstain </li><li> 신경 세포는 rhodamine로 주입 있었다면, 형광 현미경 (예 545nm)로 직접 주입 신경 세포를 시각화. </li></ol> 5. 역행 라벨, immunocytochemistry, 공촛점 이미징, 정량 colocalization 분석 방법을 결합 다른 방법이 기술을 결합의 성공은 좋은 상표 세포에 따라 크게 달라집니다. <ol><li> 방법은 쉽게 역행의 연결 라벨과 함께 조합하여 사용할 수 있습니다 여기에 시각. 이렇게하려면 70-10, 동물을 마취 및 무균 기술을 사용하여 이러한 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (20 % 양고추냉이 퍼옥시데이즈. 시그마 VI, 시그마)으로의 연결을 추적기 삽입, 1 % 밀가루 - 세균은 턱 근육과 같은 말초 대상 지역으로 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (시그마)를 aggultinated. 이것의 연결을 추적은 주변 axons로 최대 촬영 및 motoneuron의 somata에 axonal 수송을 통해 운반됩니다. 턱 근육 들어, 추적의 15μl는 살균 10 microliter의 microsyringe를 사용하여 근육에 주입합니다. 마취에서 회복 후 복구를 위해 자신의 새장에 배치까지 동물은 다음 가열 패드에 위치하고 모니터할 수 있습니다. 24 시간 후, 동물 마취 및 생리학 신경을 특징 및 intracellularly 그들을 얼룩. 다음 코발트와 안정기 및 심화로 chromagen 나트륨 tungstate로 tetramethylbenzidine (TMB)를 사용 HRP의 존재에 대한 이상 및 프로세스 조직 섹션에서 설명하는 것처럼 동물을 perfuse. 1 %의 나트륨에 넣어 섹션은 0.1M PBS (산도 6.5)와 15 절대 에탄올과 아세톤에 용해 0.0007 %의 TMB에 녹아있는 tungstate ° C 20 분. 그렇다면 0.3 % 60 분 부화 솔루션 100ml 당 H 2 O 2 1.0 ML를 추가하여 조직 섹션을 반응. 0.05 %의 diaminobenzidine (산도 7.4), 0.02 %의 코발트와 0.01 % H 2 10 분 0.1M PBS (산도 7.4)에서 O 2 0.1M PBS (산도 6.5)에 조직과 장소를 씻어. 37 ° C. 설명한대로 biotinamide로 주입 신경 세포의 시각화를위한 조직을 처리하고 표시된 감각 뉴런과 motoneurons 다양한 사이의 관계를 시각화. </li><li> 여기에 표시된 기술도 쉽게 immnocytochemistry와 함께하실 수 있습니다. 6 예를 들어, immunocytochemically 정확하게 표시 뉴런 사이 시냅스 (그림 3) 찾을 수 synaptophysin에 대한 두뇌를 처리합니다. 이렇게하려면 4 이일 ° C 그리고 23 1H에 대한 안티 마우스 FITC (1:400)에서 품어 ° C.에 대한 마우스 방지 synaptophysin 항체 (1:10,000)에서 뇌 부분을 품어 </li><li> 형광 마커로 표시하거나 형광 이미징을위한 처리 뉴런은 공촛점 이미징에 이상적입니다. 그림 3은 축삭의 부통 통해 공촛점 현미경과 취득 광학 섹션의 예입니다. (그림 3). 라벨 신경 세포 (그림 4)를 통해 여러 광학 부분을 인수하여 분류 뉴런의 애니메이션을 생성할 수 있습니다. </li><li> 이 방법으로 표시 뉴런은 양적 colocalization 분석에 사용할 수 있습니다. 이렇게하려면 (http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm에서 확인) NIH 이미지와 함께 공개 소프트웨어 매크로를 사용합니다. synaptophysin의 immunocytochemistry와 세포내 상표를 결합하여 단일 축삭 터미널 내에서 synaptophysin을 집중하다 6. </li></ol> 6. 대표 결과 : 이 방법을 사용하여 얻을 수있는 대표적인 결과의 개요는 그림 1에서 그림입니다. 이것은 하나의 brainstem 신경이 electrophysiologically 분명히 볼 수 있듯이, mandible 운동 기간 동안 기록되었다,이 신경 세포의 반응 (그림 1 왼쪽, 하늘색 하단)은 운동 중에 변조되었습니다. 이 신경 세포는 electrophysiological 특성 후 biotinamide와 함께 주입하고 이후 시각화에 대한 처리되었습니다. 재건축 신경 세포 (그림 1 중간, 녹색)가 실제 수해부 획기적인 테드,이 경우에는 삼차 모터 핵은 (빨간색 테두리) 지정. 움직임과 재건축 기간 동안의 연결에 따라 응답이 신경 세포는 보조 근육 스핀들 수입 성의 신경 세포로 확인할 수 있습니다. 그림 2 조 변위 동안 신경 세포의 생리적 반응의 대표적인 예를 보여줍니다. 신경 세포의 반응은 즉각적인 발사 주파수로 표현된다. 의 연결 응답이 밀접하게이 특정 신경 세포가 mandibular 위치에 관한 감각 피드백을 제공 나타내는 mandibular 변위를 모방 것을. 그림 3 참고 synaptophysin에 대한 얼룩과 Nissl은 얼룩과 함께 intracellularly 스테인드 축삭의 높은 배율 이미지입니다. 축삭 부통 이내 synaptophysin (노란색)의 colocalization을 확인합니다. 그림 4는 단일 생리학 특징 및 intracellularly 레이블 신경 세포의 애니메이션입니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 방법의 개요. 왼쪽 상단 : mandibular 변위. 하나의 신경 (노란색)에서 중간 세포 녹화 (녹색). 이 신경 세포의 형태는 세포 기록하고 주사 후 복원되었다. 레드 개요 삼차 모터 핵의 위치를​​ 나타냅니다. 왼쪽 하단 : 턱 운동 중에이 신경 세포의 생리 반응합니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. mandible 운동하는 동안 생체내에 기록된 하나의 근육 감각 신경 세포의 생리 반응 대표. 턱 변위로의 연결 응답의 유사성을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 탐색 근육 동안 응답 intracellularly 묻은 감각 신경 세포의 시냅스 부튼스 (적색 swellings)와 터미널 axonal arborization. synaptophysin에 대한 후속 immunocytochemical 처리 axonal 부통 (노란색) 이내 synaptophysin의 지방화를 보여줍니다. 녹색 형광 Nissl가 얼룩이다. 그림 4. 생리 반응 mandibular 운동 중에 생체내에 기록된 근육 스핀들 주 수입 성의 신경 세포의 축삭의 애니메이션은 축삭은 다음 intracellularly 스테인드 및 가시화를위한 처리되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">여기에 그림 4의 고해상도 비디오를 다운로드</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">여기에 그림 4의 중간 해상도 비디오를 다운로드</a>

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<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li>
<li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li>
<li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li>
</ol>

동물 실험 (1985 개정 NIH 출판 번호 86-23) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 설명서에 명시된 guidlines 및 규정에 따라와 메릴랜드 애니멀 케어 대학에서 수행하고위원회를 사용했다.

여기에 그림이 메서드는 단일 뉴런의 기능에 중요한 통찰력을 제공하는 방법과 각각의 뉴런의 반응의 연결 회로에 기여하는 강력한 기법입니다. 아홉이 지식은 sensorimotor 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 이 기법의 가장 큰 장점은 생리학, 형태학 및 신경 형태학 및 배포를 포함한 신경 세포에 대한 매개 변수의 다수의 결정을 허용된다는 점입니다. 이 방법의 예 등의 연결 회로로 후퇴의 연결 레이블 추가 정보와 같은 다른 기술과 결합되면 것은 특색 수 있습니다. 7,8 또 다른 장점은이 단계에서 배운 수있다는 것입니다. 예를 들어, 세포 녹음 immunocytochemistry 또는 초기 방법의 숙달 후 추가 역행의 연결 라벨과 세포내 얼룩 다음, 처음 실시 수 있습니다. 아마도 기술의 가장 큰 한계는 뉴런의 단지 소수가 한 실험에 표시 될 수있다는 것입니다. 일반적으로 특정 생리적 유형의 2-3 뉴런들은 처음에 표시됩니다. 생리와 형태 사이의 잠재적인 관계가 공식화되면, 추가 실험은 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 전자기 진동 </td><td> 링 동적 시스템 </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> 신호 발생기 </td><td> 피드백 시스템 </td><td> PFG605 </td><td> 사다리꼴 출력 신호를 생산 할 수 </td></tr><tr><td> 전극 유리 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> AF100 - 68-10 </td><td> 필라멘트와 함께 </td></tr><tr><td> 전극 풀러 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 P - 2000 P - 80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SP - 1120 </td><td> 4 저장 ° C </td></tr><tr><td> 텍사스 레드 아비딘 DCS </td><td> 벡터 연구소 </td><td> A - 2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> 분자 프로브 </td><td> D - 3308 </td><td> 3,000 분자량, 라이신 고칠수 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 synaptophysin 항체 </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 Nissl 얼룩 </td><td> Neurotrace, 분자 프로브 </td><td> N - 21480 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 시험기 </td><td> 윈스턴 전자 </td><td> BL - 1000 - B </td><td> 전극 임피던스를 측정하는 </td></tr><tr><td> 전위계 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 neurochemical 특성화

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

개별 뉴런과의 연결 회로에서 함수의 역할은 감각과 운동 기능의의 연결 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 동물은 운동하는 동안 정적 1,2 또는 레코드 세포의 연결 활동을하는 동안 sensorimotor 메커니즘 대부분의 조사는 뉴런 중 하나가 검사에 의존하고 있습니다. 3,4를 이러한 연구는 sensorimotor 기능을 위해 근본적인 배경을 제공하는 동안, 그들 중 기능적 정보를 평가하지 이것은 운동 중에 발생하거나 완전히 신경의 해부, 생리 및 neurochemical 표현형을 특징하는 능력에 제한됩니다. 기술은 생체내 운동의 기간 동안 개별 뉴런의 광범위한 특성을 허용하는 여기에 표시됩니다. 이 기술은 기본 수입 성의 뉴런을 공부뿐만 아니라 motoneurons 및 sensorimotor의 interneurons을 특성화하기 위해뿐만 아니라 사용하실 수 있습니다. 처음에는 하나의 신경 세포의 반응은 신경 세포에 대한 수용 분야의 결정 다음 mandible의 다양한 움직임 동안 electrophysiological 방법을 사용하여 기록됩니다. 의 연결을 추적은 다음 intracellularly 신경 세포에 주입되고 두뇌는 신경 세포가 빛을, 전자 또는 공촛점 현미경 (그림 1)과 시각 수 있도록 처리됩니다. 의 연결 형태가 신경 세포 (Figs. 2,3)의 생리적 반응과 상관 수 있도록 특성화 신경 세포의 자세한 형태는 다음 복원됩니다. 의사 소통이이 기술의 성공적인 구현을위한 중요한 핵심 세부 사항 및 도움말이 제공됩니다. 유용한 추가 정보는 다른 방법과이 방법을 결합하여 연구에서 신경 세포에 대한 결정하실 수 있습니다. 역행의 연결 레이블이 뉴런을 결정하는 데 사용할 수있는 레이블이 붙은 신경 세포의 시냅스와;의 연결 회로의 수 있으므로 자세한 결의. Immunocytochemistry은 표시 신경 세포 내의 신경 전달 물질을 검토하고있는 레이블 신경 세포의 시냅스가 뉴런의 화학 phenotypes을 결정하기 위해이 방법과 함께하실 수 있습니다. 분류 뉴런은 또한 레이블 신경 세포의 ultrastructural 기능과 microcircuitry을 결정하기 위해 전자 현미경을 위해 처리될 수 있습니다. 전체이 기술은 철저하게되므로 sensorimotor 기능에 신경 세포의 역할에 상당한 통찰력을 수 있단 운동의 동안 신경을 특성화하기위한 강력한 방법입니다.

기술은 운동하는 동안 포유류의 뉴런의 생체내 생리적 반응을 수량과의 연결 형태, neurochemical 표현형 및 시냅스 microcircuitry와 신경 세포의 생리 신원을 확인하도록 설명되어 있습니다.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

개별 뉴런의 역할과 뉴런 회로 내에서의 기능은 감각 및 운동의 신경학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다...

본 절차의 전반적인 목적은 움직임 중 단일 뉴런의 생리학적 반응을 기록하고, 해당 뉴런의 형태학적 및 신경화학적 특성을 추가로 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물에게 마취를 실시하고 수술적 준비를 진행합니다. 다음 단계로, 움직임이 일어나는 동안 단일 뉴런의 세포 내 반응을 전기생리학적으로 기록합니다.동물을 관류하고 뇌를 처리한 후, 마지막 단계는 생리적 반응과 뉴런의 형태학적 구조를 시각화하고 분석하는 것입니다. 최종적으로, 세포 내 뉴런 기록, 면역 화학 및 분석 기술을 결합하여 움직임 동안 단일 뉴런의 막전위 변화를 보여줍니다. 세포 배양과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 뉴런의 연결성과 시냅스 입력이 보존되며, 뉴런이 체외로 분리되거나 인공 배지에 놓이지 않는다는 점입니다. 실험 전날, 운동 뉴런을 역행성으로 표지하기 위해 말 젖샘 과산화효소(horse radish peroxidase)와 같은 뉴런 추적자를 말초 표적 부위에 주입합니다.다음 날 쥐를 마취하여 가열 패드 위에 놓고, 무균 기술을 사용하여 동물용 클리퍼로 후두부를 덮고 있는 피부를 제모합니다. 허벅지 안쪽을 따라 절개한 후, 추가 마취를 위해 대퇴정맥에 캐뉼라를 삽입합니다. 혈압을 모니터링하기 위해 대퇴동맥에 또 다른 캐뉼라를 삽입합니다.마지막으로, 기관에 캐뉼라를 삽입합니다. 다음으로, 쥐를 정위 고정틀에 고정합니다. 두정골과 간두정골의 접합부 바로 아래에 위치한 대정맥동이 손상되지 않도록 주의하며 소뇌를 노출시키기 위해 개두술을 실시합니다.다음으로, 뇌 표면을 따뜻하게 데운 미네랄 오일로 덮습니다. 이제 하악골을 전자기 진동기에 연결된 막대에 접착제로 고정합니다. 하악골의 움직임은 신호 발생기에서 진동기로 전달되는 제어 신호에 의해 조절됩니다.다음으로 두개골 절개술 부위와 인접한 피부 아래에 접지 전극을 배치합니다. 세포 내 전극을 준비하기 위해, 마이크로 전극을 IDE 또는 tetraethyl rod Domine 염료 용액으로 채웁니다. 전극 임피던스는 직경이 큰 축삭의 경우 60 to 80 mega ohms이며, 작은 구심성 축삭 및 중간 뉴런의 경우 80 to 150 mega ohms입니다.다음으로, 동물의 머리 뒤쪽에 고정된 소형 망원경을 이용하여 마이크로 전극을 전위계의 헤드 스테이지에 배치합니다. 망원경의 20 x 밀폐형 레티클을 통해 마이크로 전극을 시각화합니다. 표적 영역은 하구의 하단 경계에서 약 0.5 millimeters 측면(coddle)에 위치합니다.이제 뇌 표면의 정확한 위치를 파악할 수 있도록 연질막에 작은 구멍을 냅니다. 전극이 뇌에 닿았을 때 피드백 신호가 생성되도록 정전용량 피드백 값을 충분히 높게 설정하십시오. 전극이 뇌 내부로 들어갈 때까지 전진시킵니다.다음 단계는 하악의 반복적인 변위를 활성화하는 것입니다. 그런 다음 스테핑 모터를 사용하여 전극을 뇌 속으로 전진시킵니다. dc 전위의 갑작스러운 하락과 지속적인 시냅스 활동을 통해 뉴런 관통이 확인되면, 전극의 전진을 멈춥니다.침투가 안정되었다고 판단되면, 램프 앤 홀드(ramp and hold) 및 사인파형(sinusoidal) 턱 움직임을 시작합니다. 신경세포의 반응을 기록하고 그 반응에 기초하여 신경세포의 특성을 규명합니다. 다음으로, 해당 신경세포의 수용 영역을 매핑하기 위해 둔한 프로브를 사용하여 머리 주변의 피부와 구강 내 공간을 탐색합니다.근육 수축 또는 유해 자극과 같은 다른 자극에 대한 뉴런의 반응을 탐색하십시오. 기록이 완료되면, 1~4 nA의 DC 전류를 주입하여 총 주입량이 15~70 nA·min이 되도록 합니다. 전극 침투 상태를 모니터링하고 전류 주입을 중단하십시오.막 전위가 -30 mV보다 더 양의 값으로 변하면, 다음 단계로 뇌 조직을 절편화합니다. 동물을 안락사시키고 관류한 후, 뇌를 적출합니다. 그런 다음 전두면, 시상면 또는 수평면으로 50~100 µm 두께의 절편을 제작합니다.표지된 감각 신경세포와 다양한 운동 신경세포 간의 관계를 시각화하려면, 조직에 따라 H-R-P-D-A-B 또는 Texas red로 조직을 처리하십시오. 추가 분석은 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 정량적 공국소화 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 필요에 따라 시냅토피신(synaptophysin)에 대한 면역화학적 처리를 수행하여 표지된 신경세포 내의 시냅스 위치를 정확하게 파악할 수 있습니다. 이 그림은 전기생리학적 특성 분석 후 IDE를 주입한 뇌줄기 신경세포를 보여줍니다.운동 중의 신경 반응을 바탕으로, 이 뉴런은 이차 근방추 구심성 뉴런으로 식별될 수 있습니다. 갈색 외곽선은 삼차신경 운동핵의 위치를 나타냅니다. 이 그림은 턱 변위 동안 감각 뉴런의 생리학적 반응을 보여줍니다.뉴런의 반응은 즉각적인 발화 빈도로 나타냅니다. 반응이 하악의 변위와 밀접하게 일치한다는 점에 주목하십시오. 이는 해당 뉴런이 하악의 위치와 관련된 감각 피드백을 제공함을 나타냅니다. 이 그림은 근육 탐색 중에 반응한 감각 뉴런을 보여줍니다.면역화학적 처리 후 뉴런을 ide로 염색하였습니다. 빨간색 팽대부로 나타나는 시냅스 바톤(synaptic batons)이 노란색 synaptophysin과 함께 국소화되어 관찰됩니다. 초록색은 형광 미사일 염색(fluorescent missile stain)입니다.이 그림은 근방추 일차 구심성 뉴런의 축삭을 애니메이션으로 나타낸 것입니다. 라벨링된 뉴런의 여러 광학 절편을 사용하여 이 애니메이션을 제작하였습니다. 이 절차 이후에 전자현미경, 공초점 현미경, 그리고 전방향 또는 역방향 뉴런 라벨링과 같은 다른 방법들을 수행하여 뉴런의 초미세 구조적 특성, 시냅스 소포와 신경전달물질의 공국소화, 그리고 뉴런의 연결성에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

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