운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

기술은 운동하는 동안 포유류의 뉴런의 생체내 생리적 반응을 수량과의 연결 형태, neurochemical 표현형 및 시냅스 microcircuitry와 신경 세포의 생리 신원을 확인하도록 설명되어 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 운동 중 단일 뉴런의 생리학적 반응을 기록하고 이러한 뉴런의 형태 및 신경 화학을 추가로 특성화하는 것입니다. 이것은 먼저 동물을 마취하고 외과적으로 준비함으로써 이루어집니다. 다음 단계는 운동 중 단일 뉴런의 세포 내 반응을 전기생리학적으로 기록하는 것입니다.

동물을 관류하고 뇌를 처리한 후 마지막 단계는 생리학적 반응과 신경 형태를 시각화하고 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 세포 내 뉴런 기록, 면역화학 및 분석 기술이 결합되어 운동 중 단일 뉴런의 막 전위에서의 조절을 보여줍니다. 세포 배양과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 뉴런 연결과 시냅스 입력이 보존되고 뉴런이 자동화되거나 인공 매체에 배치되지 않는다는 것입니다.전날, 실험은 말무와 같은 뉴런 추적자, 퍼옥시다아제를 주변 표적 영역에 주입하여 라벨 운동 뉴런을 역행시킵니다.

다음날 쥐를 마취시켜 발열 패드에 놓고 피부를 면도하고 무균 기술을 사용하여 동물 가위로 뒤쪽 두개골 위에 놓습니다. 허벅지 안쪽을 따라 절개하고 대퇴 정맥에 캐뉼라를 삽입하여 추가 마취를 합니다. 혈압을 모니터링하기 위해 대퇴 동맥에 다른 캐뉼라를 삽입합니다.

마지막으로 캐뉼라를 기관에 삽입합니다. 다음으로, 쥐를 입체 안경테에 놓습니다. 소뇌를 노출시키기 위해 개두술을 시행하고, 두정골과 두정골 사이의 접합부 바로 아래에 위치한 큰 정맥동을 피하도록 주의합니다.

다음으로, 따뜻하게 데운 미네랄 오일로 뇌 표면을 덮습니다. 이제 전자기 진동기에 연결된 막대에 하악골을 붙입니다. 하악골의 움직임은 신호 발생기에서 바이브레이터에 보내는 명령 신호에 의해 제어됩니다.

다음으로, 개두술에 인접한 피부 아래에 접지 전극을 놓습니다. 세포 내 전극을 준비하기 위해 IDE 또는 테트라에틸 로드 Domine 염료 용액 테스트로 마이크로 전극을 풀렌 충전합니다. 이 전극 임피던스는 큰 직경의 축삭돌기의 경우 60-80메가옴이고 작은 구심성 축삭돌기와 뉴런간 신경세포의 경우 80-150메가옴입니다.

다음으로, 동물의 머리 뒤에 고정된 작은 망원경을 사용하여 마이크로 전극을 전위계의 헤드 스테이지에 놓습니다. 망원경의 20 x 밀폐된 빨간색을 통해 마이크로 전극을 시각화합니다. 대상 영역은 약 0.5mm 깊이로 하구(inferior colliculus)의 하경계(inferior colliculus)에서

이제 뇌 표면의 정확한 위치를 알 수 있도록 피아 마터에 작은 구멍을 만드십시오. 전극이 뇌에 닿을 때 피드백 신호가 생성되도록 커패시턴스 피드백을 과보상합니다. 전극이 뇌에 들어갈 때까지 전극을 전진시킵니다.

다음 단계는 하악골의 반복적인 변위를 활성화하는 것입니다. 그런 다음 스테핑 모터를 사용하여 전극을 뇌로 전진시킵니다. 신경 세포 찌르기가 dc 전위의 갑작스러운 감소와 지속적인 시냅스 활동으로 나타나면 전극의 전진을 중지하십시오.

관통이 안정적인 것으로 간주되면 램프를 시작하고 유지하고 사인파 턱을 움직입니다. 뉴런 반응을 기록하고 그 반응을 기반으로 뉴런의 특성을 파악합니다. 다음으로, 뉴런의 수용 영역을 매핑하려면 뭉툭한 프로브를 사용하여 머리와 구강 주위의 피부를 탐색합니다.

근육 수축 또는 유해 자극과 같은 다른 자극에 대한 뉴런의 반응을 탐색합니다. 녹음이 완료되면 1-4 나노 앰프, DC 전류를 주입하여 총 15-70 나노 앰프 분을 주입합니다. 전극 침투를 모니터링하고 전류 주입을 중단하십시오.

막 전위가 마이너스 30밀리볼트보다 더 양수가 되면 다음 단계는 뇌 조직을 절단하는 것입니다. 동물을 안락사시키고 관류시킨 후 뇌를 제거합니다. 그런 다음 정면, 시상 또는 수평면에서 50-100 미크론 단면을 자릅니다.

표지된 감각 뉴런과 다양한 운동 뉴런 사이의 관계를 시각화하기 위해 조직에 따라 H-R-P-D-A-B 또는 텍사스 레드에 대한 조직을 처리하고, 형광 또는 컨포칼 현미경 또는 정량적 공동 국소화 소프트웨어를 사용하여 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 원하는 경우 표지된 뉴런 내에서 시냅스를 정확하게 찾기 위해 시냅토피신에 대한 면역화학적 처리를 수행할 수 있습니다. 이 그림은 전기생리학적 특성 분석 후 IDE를 주입한 뇌간 뉴런을 보여줍니다.

운동 중 뉴런 반응을 기반으로 이 뉴런은 2차 근육 방추 구심성 뉴런으로 식별될 수 있습니다. 갈색 윤곽선은 삼차 운동 핵의 위치를 나타냅니다. 이 그림은 턱이 변위되는 동안 감각 뉴런의 생리학적 반응을 보여줍니다.

뉴런의 반응은 순간 발화 빈도로 표현됩니다. 이 반응은 하악 변위와 밀접하게 모방한다는 점에 주목하라, 이는 이 특정 뉴런이 하악 위치와 관련된 감각 피드백을 제공한다는 것을 나타낸다. 이 그림은 근육 프로빙 중에 반응한 감각 뉴런을 보여줍니다.

뉴런은 면역화학 처리 후 ide로 염색되었습니다. 붉은색 부종으로 나타나는 시냅스 배턴은 노란색 시냅토피신(synaptophysin)과 함께 국한된 것으로 보입니다. 녹색은 형광 미사일 얼룩입니다.

이 그림은 근육 방추 1차 구심성 뉴런에서 나온 축삭돌기의 애니메이션입니다. 라벨링된 뉴런의 여러 광학 섹션이 애니메이션을 생성하는 데 사용되었습니다. 이 절차에 따라 electromicroscopy, confocal microscopy, anterior grade 또는 retrograde neuronal labeling과 같은 다른 방법을 수행하여 시냅스 bns 및 neuronal 연결성을 가진 neurotransmitter의 neuron colocalization의 ultra structural characteristics에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.