운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

본 절차의 전반적인 목적은 움직임 중 단일 뉴런의 생리학적 반응을 기록하고, 해당 뉴런의 형태학적 및 신경화학적 특성을 추가로 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물에게 마취를 실시하고 수술적 준비를 진행합니다. 다음 단계로, 움직임이 일어나는 동안 단일 뉴런의 세포 내 반응을 전기생리학적으로 기록합니다.

동물을 관류하고 뇌를 처리한 후, 마지막 단계는 생리적 반응과 뉴런의 형태학적 구조를 시각화하고 분석하는 것입니다. 최종적으로, 세포 내 뉴런 기록, 면역 화학 및 분석 기술을 결합하여 움직임 동안 단일 뉴런의 막전위 변화를 보여줍니다. 세포 배양과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 뉴런의 연결성과 시냅스 입력이 보존되며, 뉴런이 체외로 분리되거나 인공 배지에 놓이지 않는다는 점입니다. 실험 전날, 운동 뉴런을 역행성으로 표지하기 위해 말 젖샘 과산화효소(horse radish peroxidase)와 같은 뉴런 추적자를 말초 표적 부위에 주입합니다.

다음 날 쥐를 마취하여 가열 패드 위에 놓고, 무균 기술을 사용하여 동물용 클리퍼로 후두부를 덮고 있는 피부를 제모합니다. 허벅지 안쪽을 따라 절개한 후, 추가 마취를 위해 대퇴정맥에 캐뉼라를 삽입합니다. 혈압을 모니터링하기 위해 대퇴동맥에 또 다른 캐뉼라를 삽입합니다.

마지막으로, 기관에 캐뉼라를 삽입합니다. 다음으로, 쥐를 정위 고정틀에 고정합니다. 두정골과 간두정골의 접합부 바로 아래에 위치한 대정맥동이 손상되지 않도록 주의하며 소뇌를 노출시키기 위해 개두술을 실시합니다.

다음으로, 뇌 표면을 따뜻하게 데운 미네랄 오일로 덮습니다. 이제 하악골을 전자기 진동기에 연결된 막대에 접착제로 고정합니다. 하악골의 움직임은 신호 발생기에서 진동기로 전달되는 제어 신호에 의해 조절됩니다.

다음으로 두개골 절개술 부위와 인접한 피부 아래에 접지 전극을 배치합니다. 세포 내 전극을 준비하기 위해, 마이크로 전극을 IDE 또는 tetraethyl rod Domine 염료 용액으로 채웁니다. 전극 임피던스는 직경이 큰 축삭의 경우 60 to 80 mega ohms이며, 작은 구심성 축삭 및 중간 뉴런의 경우 80 to 150 mega ohms입니다.

다음으로, 동물의 머리 뒤쪽에 고정된 소형 망원경을 이용하여 마이크로 전극을 전위계의 헤드 스테이지에 배치합니다. 망원경의 20 x 밀폐형 레티클을 통해 마이크로 전극을 시각화합니다. 표적 영역은 하구의 하단 경계에서 약 0.5 millimeters 측면(coddle)에 위치합니다.

이제 뇌 표면의 정확한 위치를 파악할 수 있도록 연질막에 작은 구멍을 냅니다. 전극이 뇌에 닿았을 때 피드백 신호가 생성되도록 정전용량 피드백 값을 충분히 높게 설정하십시오. 전극이 뇌 내부로 들어갈 때까지 전진시킵니다.

다음 단계는 하악의 반복적인 변위를 활성화하는 것입니다. 그런 다음 스테핑 모터를 사용하여 전극을 뇌 속으로 전진시킵니다. dc 전위의 갑작스러운 하락과 지속적인 시냅스 활동을 통해 뉴런 관통이 확인되면, 전극의 전진을 멈춥니다.

침투가 안정되었다고 판단되면, 램프 앤 홀드(ramp and hold) 및 사인파형(sinusoidal) 턱 움직임을 시작합니다. 신경세포의 반응을 기록하고 그 반응에 기초하여 신경세포의 특성을 규명합니다. 다음으로, 해당 신경세포의 수용 영역을 매핑하기 위해 둔한 프로브를 사용하여 머리 주변의 피부와 구강 내 공간을 탐색합니다.

근육 수축 또는 유해 자극과 같은 다른 자극에 대한 뉴런의 반응을 탐색하십시오. 기록이 완료되면, 1~4 nA의 DC 전류를 주입하여 총 주입량이 15~70 nA·min이 되도록 합니다. 전극 침투 상태를 모니터링하고 전류 주입을 중단하십시오.

막 전위가 -30 mV보다 더 양의 값으로 변하면, 다음 단계로 뇌 조직을 절편화합니다. 동물을 안락사시키고 관류한 후, 뇌를 적출합니다. 그런 다음 전두면, 시상면 또는 수평면으로 50~100 µm 두께의 절편을 제작합니다.

표지된 감각 신경세포와 다양한 운동 신경세포 간의 관계를 시각화하려면, 조직에 따라 H-R-P-D-A-B 또는 Texas red로 조직을 처리하십시오. 추가 분석은 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 정량적 공국소화 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 필요에 따라 시냅토피신(synaptophysin)에 대한 면역화학적 처리를 수행하여 표지된 신경세포 내의 시냅스 위치를 정확하게 파악할 수 있습니다. 이 그림은 전기생리학적 특성 분석 후 IDE를 주입한 뇌줄기 신경세포를 보여줍니다.

운동 중의 신경 반응을 바탕으로, 이 뉴런은 이차 근방추 구심성 뉴런으로 식별될 수 있습니다. 갈색 외곽선은 삼차신경 운동핵의 위치를 나타냅니다. 이 그림은 턱 변위 동안 감각 뉴런의 생리학적 반응을 보여줍니다.

뉴런의 반응은 즉각적인 발화 빈도로 나타냅니다. 반응이 하악의 변위와 밀접하게 일치한다는 점에 주목하십시오. 이는 해당 뉴런이 하악의 위치와 관련된 감각 피드백을 제공함을 나타냅니다. 이 그림은 근육 탐색 중에 반응한 감각 뉴런을 보여줍니다.

면역화학적 처리 후 뉴런을 ide로 염색하였습니다. 빨간색 팽대부로 나타나는 시냅스 바톤(synaptic batons)이 노란색 synaptophysin과 함께 국소화되어 관찰됩니다. 초록색은 형광 미사일 염색(fluorescent missile stain)입니다.

이 그림은 근방추 일차 구심성 뉴런의 축삭을 애니메이션으로 나타낸 것입니다. 라벨링된 뉴런의 여러 광학 절편을 사용하여 이 애니메이션을 제작하였습니다. 이 절차 이후에 전자현미경, 공초점 현미경, 그리고 전방향 또는 역방향 뉴런 라벨링과 같은 다른 방법들을 수행하여 뉴런의 초미세 구조적 특성, 시냅스 소포와 신경전달물질의 공국소화, 그리고 뉴런의 연결성에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다.