Name: 단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 학습하세요 단일 분자 FRET을 이용한 DNA 루핑 동역학 측정 방법을. DNA 결합 단백질 없이 고유 곡률에 따른 루핑 확률을 정량화하여 유전자 조절 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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우리는 비판적으로 원고를 읽는 제임스 워터스, 이블 워즈워스와 보 브로드 감사합니다. 우리는 또한 우리의 유용한 의견을 제공하는 네 개의 익명의 검토를 부탁드립니다. 우리는 조지아 공업 대학교, 과학 인터페이스에서 버로우즈 웰컴 기금 경력 상 및 리빙 시스템의 NSF 물리학에서 학생 연구 네트워크 지원 사업 재정 지원을 인정합니다.

1. dsDNA 샘플 준비 <ol><li> 10 메르 순서를 반복하여 전 세계적으로 곡선의 DNA를 디자인합니다. 예를 들어, 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;는 186-BP 곡선 X는 임의의 추가 자료입니다 DNA와 반복 10 메르 순서를 측면에서는 순서가 어댑터 시퀀스입니다이다. 참고 :.이 예에서 카플란 등으로 대규모 뉴 클레오 점유율 조사 결과를 기반으로 뉴 클레오 솜 형성에 반대 환경과 2 개의 10-MERS 15이 선택되었다. dsDNA의 나선형 반복 10 BP 부근에 있기 때문에, 10 - 머의 나선 축의 순 편향은 원호 (그림 3A)와 같은 모양을 생산하기 위해 축적됩니다. 헬리컬 기간 10.5 BP에 접근하기 때문에, 여분의 염기는 가능한 한 평면으로 만곡 구조를 유지하기 위해 매 2 반복 후에 삽입된다. 200 BP보다 짧은이 시퀀스는 대기업에서 주문할 수 있습니다의 그 제안의 유전자 합성 서비스를 제공합니다. 그것은 다음 단계에 대한 일반적인 어댑터 시퀀스 이러한 시퀀스를 측면에 편리합니다. 절차는도 3b에 도식화한다. </li><li> 프라이머 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) 프라이머 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG)과 PCR을 수행합니다. 참고 : 프라이머 2는 5 &#39;말단의 FRET 기증자를 Cy3가 표시되어 있습니다. 전형적인 PCR 제조법 및 사이클링 프로토콜은 표 1 및 표 2에 나타낸다. </li><li> 프라이머 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) 프라이머 4 (CAACAACGAGCTCGAATG)과 PCR을 수행합니다. 참고 : 프라이머 3 5 &#39;말단의 백본과 비오틴 링커를 통해 FRET 수용체 Cy5에가 표시되어 있습니다. PCR 제조법 및 순환 프로토콜은 위와 같이되어 있습니다. </li><li> 정리 PCR 키트를 사용하여 PCR 제품을 정제. </li><li> 0.4 &amp;의 최종 농도로 가닥 교환을위한 버퍼 (100 ㎜의 NaCl, 10 MM 트리스 - 염산의 pH 7.0, 1 mM의 EDTA)의 Cy3로 표지 된 제품과 Cy5에 레테르를 붙인 제품을 혼합# 181; 각각 M과 0.1 μM,. NOTE : 과량를 Cy3-DNA 가닥은 과거의 결과를 Cy3 및 Cy5의 양을 운반하는 이중의 농도를 증가시킨다. </li><li> 2 분 동안 98.5 ° C에서 배양하여 Exchange 물가는 점차 5 냉각 ° C 0.1 ° C / 초 램프 속도로, 그리고 5에서 배양 &#160; 2 시간 동안 C를 °. </li></ol> 2. 젤 전기는 dsDNA 곡률을 감지하는 <ol><li> 29.2:0.8의 비율로 아크릴 아미드 및 비스 - 아크릴 아미드 솔루션을 혼합하여 폴리 아크릴 아마이드 젤 (16, 17)을 붓고, 5 % (W / V)의 pH 8.0에서 1X 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE) 버퍼. 주 : 겔 용액 10 ml를 포함 1.217 ml의 40 % 아크릴 아미드 0.667 ml의 2 % 비스 아크릴 아미드, 1 ㎖ TBE 10X를 100 L 황산 암모늄 (APS) 10 %, 10 L TEMED, 및 나머지 dH보다 2 O.이며 젤의 전체 응고 약 30 분 소요됩니다. </li><li> DNA 샘플 및 1X 로딩 버퍼의 DNA 사다리 (5 % 글리세롤, 0.03 % (w / v)의 브로 모 페놀의 BL로 폴리 아크릴 아마이드 젤을로드UE)과 5-8에서 젤을 실행하는 45 분 동안 4 ° C에서 또는 염료 앞까지 V / cm 겔의 끝을 접근한다. </li><li> 30 분 동안 0.5 g / ml의 에티 디움 브로마이드를 포함 1X TBE 버퍼를 사용하여 겔을 염색. UV 조명 아래의 DNA 밴드를 확인합니다. DNA 분자의 외관상의 크기를 계산하는 크기의 마커 (100 염기쌍의 DNA 사다리)와 밴드 위치를 비교. 참고 : 곡선의 DNA는 일반적으로 직선 DNA를보다 느리게 이동합니다. </li></ol> 3. 셀 준비 흐름 <ol><li> 드릴 프레스와 다이아몬드 드릴 비트를 사용하여 유리 슬라이드의 두 양 모서리 (3 &#39;&#39; × 1 &#39;&#39;)를 따라 구멍을 6 ~ 7 쌍을 뚫습니다. 훈련 후, 눈에 보이는 유리 분말을 제거하기 위해 흐르는 물에 슬라이드를 문질러. 참고 : 구멍은 관류 입구와 출구 역할을한다. 훈련하는 동안, 물 슬라이드를 냉각 균열을 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 유리 항아리에 수직 슬라이드를 놓고 물을 채운다. 15 분 동안 초음파 처리하고 다른 유리 항아리 데에 전송할아세톤 청소 dicated. 15 분 동안 아세톤 및 초음파 처리로 입력합니다. 다음 스프레이 용기와 물을 사용하여 에탄올로 슬라이드를 씻어. 폴리 프로필렌 용기에 배치, 5 M 수산화 칼륨으로 채우고, 초음파 처리 15 분. 마지막으로, 15 분 동안 물에 슬라이드를 초음파 처리. 동일한 프로토콜을 이용하여 커버 슬립 (1 번, 24 × 40 mm)를 청소한다. 참고 : 청소 슬라이드와 커버 슬립 장기 사용을 위해 dH보다 2 O에 저장 될 수 있습니다. </li><li> 0.1 M 중탄산 나트륨 용액 340 L로 실란 MPEG-80 MG (MW 2000)와 함께 비오틴-PEG-실란 한 MG (MW 3,400)를 혼합한다. 잘 섞어 거품을 제거하기 위해 잠시 동안 혼합물을 원심 분리기. 참고 : 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 표면의 작용은 표면에 DNA의 비특이적 결합을 줄일 수 있습니다. </li><li> 각 슬라이드에 PEG 용액 80 L를 넣고 부드럽게 그 위에 커버 슬립을 낮 춥니 다. 45 분 동안 기다립니다. 족집게로 슬라이드에서 커버 슬립을 분리 dH보다 2 O의 풍부한 양을 씻어 보자 t야외에서 단 건조. </li><li> 채널을 형성하기 위해 슬라이드를 통해 양면 테이프의 얇은 스트립을 놓습니다. 그 위에 커버 슬립을 맞추고 단단히 액체 꽉 채널을 형성하기 위해 슬라이드에 커버 슬립을 누릅니다. 채널의 가장자리를 밀봉하기 위해 5 분 에폭시를 사용합니다. </li></ol> 트롤 솔루션 4. 준비 <ol><li> 플라스크에 ~ 30 mg의 트롤과 10 ㎖ dH보다 2 O를 넣고 18 시간 동안 야외에서 솔루션을 저어 자석 교반 막대를 사용합니다. </li><li> 0.2 μm의 필터를 사용하여 솔루션을 필터링하고 1 M 트리스베이스 (산도 11)의 ~ 6 μl를 첨가하여 pH를 7로 조정합니다. 참고 : 트롤은 일반적으로 18 연구 단일 분자에 사용되는 항 깜박 시약입니다. 트롤의 antifading 조치는 부분적으로 저하 트롤 솔루션 19에 존재하는 산화 된 파생 상품에서 비롯됩니다. 신속 메탄올 또는 높은 pH 트리스 용액에 트롤 록스를 용해하기 때문에 비효율적 산화 피해야한다. </li></ol> 5. 싱글 몰ecule 이미징 <ol><li> 채널로 뉴트라 비딘 용액 (0.5 ㎎ / ㎖)의 15 μl를 주입 및 T50 버퍼 100 μL (10 MM 트리스 - 염산, 50 mM의 염화나트륨, 산도 7.0)로 세척하기 전에 2 분 동안 기다립니다. </li><li> 채널에 DNA 샘플 (50 ~ 100 PM)의 50 μl를 주입한다. 5 분 동안 기다린 T50 버퍼 100 L 멀리 언 바운드 DNA를 씻어. NOTE : DNA 분자는 구체적 뉴트라 비딘 - 비오틴 상호 작용을 통해 표면에 결합 할 것이다. </li><li> 산소 소거 시스템 (20) (100 ㎜ PCD, 5 mM의 PCA, 1 mM의 트롤 록스, 및 500 mM의 염화나트륨)을 포함 촬상 완충액으로 채널을 채운다. </li><li> 초당 25 프레임 컴퓨터에 2 × 2 비닝 이미지 (256 X 256)를 스트리밍 프레임 전송 모드 EMCCD를 설정합니다. </li><li> 현미경 대물에 침지 기름을 넣어 시험편 클립을 사용하는 현미경 스테이지 상에 플로우 셀을 고정한다. 벽에 레이저 반사 패턴을 보면 초점을 거친 조정합니다. 형광 메신저의 라이브 뷰를 사용하여 초점을 미세 조정모니터의 나이. </li><li> 에 532 nm의 레이저로 데이터 수집을 시작합니다. 라이브 뷰를 확인하고 필요한 경우 초점을 조정합니다. 대부분의 분자가 photobleached 때 데이터 수집을 중지합니다. 참고 :이 시설에서 현미경을 제어하고이 하드 디스크에 저장 될 때 모니터에 실시간 영상을 표시 할 수있는 연구소가 작성한 C 프로그램에 사용됩니다. </li></ol> 6. 이미지 처리 및 데이터 분석 NOTE : 256 X 256 화상의 시계열를 Cy3 및 Cy5의 강도의 단일 분자 시간 트레이스를 생성하는 MATLAB 코드에 의해 처리된다. 기증자 채널 및 분할보기 이미지의 수용체 채널 사이의 픽셀 쌍을하려면를 Cy3와 Cy5에 반점이 6 ~ 7 쌍, 균등하게 시야에 분산 동일한 분자에서 각 쌍은, 수동으로 아핀 변환에게 포착하고있다 앵커 지점으로이 지점의 좌표를 사용하여 계산됩니다. <ol><li> MATLAB 스크립트를 사용하여 모든 단일 분자의 시간을 통해 봐 t을 추적낮은 높은 FRET 신호 사이의 모자 쇼 다수 전환. 루프와 unlooped 상태를 확인합니다. 참고 : FRET 신호가 Cy5에 강도로 정의된다 (나는)를 Cy3와 Cy5에 강도의 합 (내가 수비 I +)로 나눈. unlooped 상태가 낮은 FRET 값을 가지고있는 동안 루프 상태는 하이 FRET 값이 있습니다. 하나의 분자에서 FRET 신호의 히스토그램 bimodally 때문에 가역 루프와 unlooping으로 배포됩니다. </li><li> 두 개의 장착 가우스 곡선의 교차를 결정하여 두 배포판을 구분하는 임계 값을 찾을 수 있습니다. </li><li> FRET 효율 등을 계산 <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> 높은 FRET 값과 낮은 FRET 값으로 unlooped 상태와 루프 상태를 할당합니다. </li><li> MATLAB 스크립트를 사용하여 분자 (N (t))의 누적 수를 분석 그 루프 (또는데이터 수집이 시작된 이후 서로 다른 시간의 경과에 높은 FRET 상태)에 도달. NOTE : dsDNA 분자는 데이터 수집의 시작 unlooped 상태 중 어느 형태로 시작할 수 있기 때문에, 루프 인구의 증가 속도는 평균 반복 속도는 초기 배좌 평균화 반영한다. 지수 함수와 N (t)를 피팅하여 반복 속도 K 루프를 추출 <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> biphasically 증가하면 두 지수 함수로 적합 할 수있다 : <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> 이 경우, K의 루프로부터 획득된다 : <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTE : 이론적 중합체는 시간 t에서 반복하지 않았다고 생존 확률은 단일 또는 이중 지수 함수 12 아니다. 지수 FITTING는 평균 반복 시간을 추출하는 실용적인 수단으로서 사용된다. </li></ol> 7. J 인자를 결정 NOTE : J 팩터는 dsDNA의 일단은 타단 주위 얼마나 농축 나타낸다. 그것은 측정 반복 속도로 타단 세그먼트와 동일한 반응 속도를 생산할 DNA의 일단 세그먼트의 농도 보간에 의해 결정될 수있다. 실험적으로, 일단 세그먼트는 표면에 고정되고, 타 단부 ​​세그먼트는 특정 농도 C에 도입된다. 양단 간의 측정 어닐 레이트 K 어닐링이면 J 인자 21에 의해 주어진다 <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . 어닐링 속도 상수 (k = K 어닐링 어닐링 / C)는 프로브의 농도와 무관하다. <ol><li> 30 ~ 50 μM의 비오틴 - Cy5에 올리고 20 ㎕ (프라이머 3) 흐름 전뉴트라 비딘 코팅 채널 n을. 언 바운드 올리고 씻어 100 μL의 T50와 채널을 씻어. </li><li> 50 nM의 최종 농도를 Cy3 올리고 (프라이머 2)의 첨가 부 (5)에 설명 된대로 촬상 버퍼를 준비한다. 채널로이 촬상 버퍼를 흐른다. </li><li> 에 532 nm의 레이저를 유지하면서, 간단히 표면 바인딩 Cy5에 올리고 위치를 확인하기에 640 nm의 레이저를 켭니다. 640 nm의 레이저를 끄고 FRET 신호를 모니터링을 시작합니다. 참고 : 표면 바인딩 Cy5에 올리고에 Cy3에 올리고 하이브리드시, Cy5의 형광 FRET에서 발생합니다. </li><li> MATLAB 스크립트를 사용하여 결합되지 않은 상태 (낮은 Cy5의 강도)에서 시작하지만 나중에 Cy5의 강도 트레이스에서 시간의 함수로서 소둔 상태 (높은 Cy5의 강도)로 바꾸어 분자의 수를 분석한다. </li><li> 어닐링 분자 대 시간이 수를 그린다. 단일 지수 함수 (과이 곡선에 맞게 <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) 어닐 레이트 (k 어닐링)을 얻었다. </li><li> 어닐 레이트 및 반응물 농도의 선형성을 확인하기 위하여 다양한 Cy3에 올리고 농도 (60, 100 및 180 nm 정도)로 실험을 반복한다. 2 차 열처리 속도 상수 (K 어닐링의 압축을 풉니 다 ) 슬로프에서. </li><li> J 인자에서를 계산 <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , k 개의 루프가 동일한 완충액 조건에서 측정 반복 속도이다. </li></ol>

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<li>Waters, J. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+Statistics+of+a+Surface-Pinned+Semiflexible+Polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer.</a> Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).</li>
<li>Mills, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+evidence+that+single-stranded+regions+of+1+or+more+nucleotides+dramatically+increase+the+flexibility+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA.</a> Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

FRET 기반으로 간단한 단일 분자 분석은 서로 다른 고유 한 모양의 DNA를 루프의 속도를 연구하는 데 사용되었다. 곡선 DNA를 10.5 BP의 헬리컬주기 위상이 10 - 머 서열을 반복함으로써 제조 할 수 있고, 그 곡률 PAGE를 이용하여 추정 될 수있다. 이 dsDNAs 과도 루프 안정화 할 수 있도록 스티커 끝으로 설계되어 있습니다. 우리는 시간이 지남에 따라 반복 분자의 수의 지수 상승에서 반복 속도를 추출. 끊어진 점착 말단 분절 사이 어닐링 속도 상수는 J 인자로 알려진 루핑 확률 밀도의 농도 당량을 결정하기 위해 사용된다. 리가 아제 기반 DNA 환화 검정법에서 DNA 마감 확률 측정 리가 제의 농도에 민감하고, 리가 아제는 9 과도한 경우 J 팩터는 과대 평가 될 수있다. DNA를 DNA 리가 아제의 비특이적 결합은 루프 (10)에 영향을 미칠 수있다. 또한, ligas전자 활동은 소금에 따라 시간이 지남에 붕괴. 그...

dsDNA의 기계적 특성을 이해하는 것은 기초 과학 및 공학 응용 프로그램에서 기본 중요하다. 연속적인 염기쌍 사이의 롤, 상하 이동 및 비틀림 각 시퀀스에 따라 달라질 수 있기 때문에 dsDNA의 구조는 직선 나선형 사다리보다 더 복잡합니다. 열 변동은 dsDNA는, 굽힘 비틀림과 스트레칭 등의 구조적 변동의 다양한 모드를 받아야하는 원인이 될 수 있습니다. 이러한 용융 및 꼬임으로 전환은 극단적 인 조건에서 발생할 수 있습니다. 이러한 움직임 가운데, dsDNA의 굴곡이 가장 눈에 띄는 생물에 미치는 영향 1 있습니다. dsDNA 구부리는 서로 가까운 두 먼 사이트를 가져와 유전자 억제 또는 활성화와 연결되어 있습니다. 또한 DNA를 세포 핵 내부의 포장 또는 바이러스 캡시드에 중요한 역할을한다. dsDNA의 굴곡 변형은 고해상도 현미경 (AFM 2 TEM 3), 및 thermodyn에 의해 실험적으로 시각화 할 수 있습니다amics과 반응 속도는 화학적으로 dsDNA의 병렬 사이트를 링크 반복 분석에 의해 연구 될 수있다. 하나의 분석은 리가에 의존하는 고리 화 4입니다. 이 분석에서 &#39;끈적 끈적한&#39;(응집력) 끝 dsDNA 분자 고리 화하거나 DNA 리가 아제에 의해 이량. 원형 및 이량 체의 비율을 비교하여, 하나는 J 인자로 알려져 타단 근방의 DNA의 일단의 효과적인 몰 농도를 얻을 수있다. 이 J 계수 타단으로부터 짧은 거리에서 DNA의 일단을 찾는 확률 밀도 치수와 동일하며, 따라서 DNA의 유연성을 반영한다. DNA 길이의 함수 J의 계수를 측정하는 것은 지속성 길이 4,5 포함한 DNA 기계에 대한 다양한 특성을 보여준다. 웜과 같은 체인 (WLC) 모델은 널리 expla에서의 성공을 기반으로 dsDNA 역학에 대한 정식 폴리머 모델로 여겨왔다DNA 실험 6 당기는 제대로 이상 200 bp의 7보다 dsDNAs의 J 요인을 예측에서 얻은 힘 - 신장 곡선 ining. 그러나, 100 bp의 짧게 dsDNA 분자의 고리 화 반응의 분석을 사용하여, Cloutier와 Widom는 WLC 모델 예측 8보다 몇 배의 크기로 J 요인을 측정했다. 년 후, 뒤 등. 리가 아제의 낮은 농도로 고리 화 분석법을 사용 WLC 모델과 일치 J 인자 생산 Widom 그룹에서 구를 사용한 높은 리가 아제 농도에 비정상적인 결과를 기인. 기존의 분석 9를 사용하는 경우이 논쟁은 고리 화 반응 속도에 DNA 리가 아제의 피할 수없는 영향을 예시한다. 또한, DNA 리가 아제는 비특이적 결합 10,11 통해 DNA 구조 및 강성에 영향을 미칠 수있다. 단백질에 의존하는 고리를 이루는 분석의 기술적 인 문제를 제거하기 위해, 우리는 최근 제자를 보여 주었다형광 공명 에너지 전달 (FRET) 12을 기준으로 EIN이없는 루프 분석. 이 방법에서, 루프 형 배좌는 DNA 분자의 끈끈한 단부 부근 부착 공여체와 수용체 사이의 FRET에 의해 감지된다. 대물 형 전반사 형광 현미경 (TIRFM)는 가역 루프와 오랜 기간 동안 표면에 고정화 한 DNA 분자로부터 unlooping 이벤트의 궤적을 기록하는 데 사용된다. 이 방법은 Vafabakhsh과 하 (13)에 의해 유사한 방법에 중요한 개선 불일치없는 DNA 분자를 생성하는 DNA 분자의 PCR 기반의 어셈블리를 제공합니다. 이 프로토콜의 단일 분자 측면은 FRET 측면이 하나라도 리가 활동에 악영향을 줄 수 조건에서, 같은 분자에서 반복 DNA 고리를 이루는 역학을 측정 할 수있는 동안뿐만 아니라 분포의 측정이 평균 앙상블 할 수 있습니다. TIRFM 설정은 그림 1에서 볼 수있다. 사용자 정의보기디자인 표본 단계는 올림푸스 IX61 현미경 몸에 배치됩니다. 532 nm 내지 640 nm의 레이저는 측면에서 도입 및 커버 슬립 - 물 계면에 입사 임계각을 달성하기 위해 높은 NA 대물 렌즈에 작은 타원형 미러 (14)에 의해 반사된다. 우리는 더 널리 이색 거울이나 프리즘 기반 TIR의 설정을 사용하여 관통 목적 TIR도이 FRET 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 현미경에 의해 형성되는 형광 이미지는 다이크로 익 미러에 의해 기증자와 수용체의 이미지로 분할됩니다. 그런 다음 EMCCD의 두 반쪽에 이미지를 다시됩니다. 추가의 롱 패스 배출 필터는 배경 신호를 감소시키기 위해 사용된다. 온도 조절은 재현 운동 데이터를 획득하기위한 필수적입니다. 온도 제어를 위해, 대물가 온도 조절 칠러 / 히터에서 열 전달 및 물을 최소화 현미경 본체의 노즈 피스로부터 분리되어 단단히 끼워 황동 고리를 통해 순환된다목적 재킷 아래의 내부 금속의 주위에. 이 설정은 15 ~ 50 ° C 사이의 커버 슬립 표면 (그림 2)에서 강력한 온도 제어를 달성 할 수있다. 본 연구에서는 샘플 온도는 24 ° C를 유지 하였다 다음 프로토콜은 DNA의 구조, DNA 모양의 추정, 단일 분자 실험 및 J 인자 결정을위한 단계별 절차를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Small DNA FRAG 추출물 키트-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드 40% 용액 500ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>비스-아크릴아미드 2%(w/v) 용액 500ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100bp DNA 사다리, 100-1,000bp</td><td>발효</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>미니 수직 PAGE 시스템</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.2 &mu; m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>삼중 항 상태 소광제</td></tr><tr><td>Protocatechuic acid (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>산소 소거</td></tr> 시스템 <tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>산소 소기 시스템</td></tr><tr><td>mPEG-silane, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-PEG-실란, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>비오틴-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin 비오틴 결합 단백질</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA Fragments 추출 키트</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 일반 유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>Scientific 12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR 마이크로 커버 유리, 직사각형, no. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S 순환 냉각기/히터</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>온도 제어</td></tr><tr><td>Objective Cooling Collar</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>온도 제어</td></tr><tr><td>KMI53 Biological 마이크로미터 측정 단계</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>고성능 DPSS 레이저 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 excitation</td></tr><tr><td>CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector</td><td>Coherent</td><td>1139604</td><td>Cy5 excitation</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>splitting dichroic</td></tr><tr><td>LaserMUX 빔 결합기, 514.5, 532 및 반사 543.5 nm 레이저, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>결합 이색성</td></tr><tr><td>Brightline 형광 필터 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3 방출 필터</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP 장역 통과 필터, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 방출 필터</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 도립 현미경 프레임</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 직경 45&deg; 로드 렌즈 알루미늄 코팅&nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>미니어처 미러</td></tr><tr><td>1/4" 여행용 단축 번역 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>미니어처 미러</td></tr>&<tr><td>Oslash 번역; 1" 무채색 이중, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>초점 렌즈</td></tr><tr><td>조절 가능한 기계식 슬릿</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>유전체 미러</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 1" 무채색 더블릿, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>릴레이 렌즈</td></tr><tr><td>렌즈 마운트 &Oslash용; 1" 광학</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>다이크로익 필터 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>고정 케이지 큐브 플랫폼</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mount for &Oslash; 1" 광학</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 플라노-볼록 렌즈, &Oslash; 1", f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>콜리메이팅 렌즈</td></tr><tr><td>N-BK7 플라노-볼록 렌즈, &Oslash; 6.0 mm, f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>망원경 렌즈</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &Oslash; 6.0mm, f = 150mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>망원경 렌즈</td></tr></tbody></table>

단일 분자 fret에 의해 dna 루핑을 공부

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

이중 가닥 DNA (dsDNA)의 굽힘은 DNA와 단백질의 인식과 뉴 클레오에 DNA 포장과 같은 많은 중요한 생물 학적 과정과 연관되어 있습니다. dsDNA 굽힘의 열역학은 공유 dsDNA의 짧은 끈적 끝을 가입 DNA 리가 아제에 의존하는 방법이라는 고리 화 반응에 의해 연구되고있다. 그러나, 결찰 효율 등의 DNA 결합 끈적 단부를 둘러싸는 구조, 및 연결 효소로 반복 dsDNA 관련되지 않은 많은 요인에 의해 영향을받을 수있다 또한 비특이적 결합과 같은 메커니즘을 통해 명백 반복 레이트에 영향을 미칠 수있다. 여기, 우리는 FRET (형광 공명 에너지 이동)에 의하여 과도 DNA 루프 형성을 감지하여 리가없는 dsDNA의 반복 반응 속도를 측정하는 방법을 보여줍니다. dsDNA 분자 FRET 쌍과 비오틴 링커 간단한 PCR 기반 프로토콜을 사용하여 구성됩니다. J 인자로 알려진 루핑 확률 밀도 두 disconnec 사이 반복 속도와 어닐 레이트로부터 추출테드 스티커 끝. 다른 고유 곡률 두 dsDNAs을 테스트함으로써, 우리는 J 계수가 dsDNA의 고유 형상에 민감하다는 것을 보여줍니다.

반복 연구에 사용되는 DNA 분자는 변수 순서와 길이와 서로 보완적인 단일 가닥 오버행의 이중 지역으로 구성되어 있습니다. 7 -베이스 긴 오버행은, 루프 형의 상태를 캡처하기 위해 서로에 어닐링 할 수있다. 각 오버행 아미 다이 화학을 통해 DNA 백본에 연결되어를 Cy3 또는 Cy5에 하나가 포함되어 있습니다. Cy5에 오버행은 표면 고정화 (그림 4A 참조) 비오틴 - TEG (15 원자 테트라 에틸렌 글리콜 스페이서)와 연결되어있다. 이러한 모든 수정은 PCR-기반 프로토콜 (프로토콜 1 및도 3b) 다음 dsDNA에 혼입 될 수있다. 오버행의 선택의 길이와 순서는 일반 실험 조건에서 검출 뒤집을 FRET 이벤트를 생산하기 위해 잘 작동합니다. 루핑 및 DNA 루프 unlooping 속도론은 주위 온도에 민감하기 때문에, 온도 제어기는 재현성이 필수적이다. 이러한 관제사뮬러 용이 현미경 (도 2)에 혼입 될 수있다. <p ...

이 연구 결과는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 이중 가닥 DNA의 반복 역학을 측정하는 상세한 실험 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 J 인자라는 반복 확률 밀도를 추출하는 방법에 대해 설명합니다.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

다음 실험의 전반적인 목표는 이중 가닥 DNA의 루프 역학이 DNA 결합 단백질을 사용하지 않고 DNA의 고유한 모양에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하는 것입니다. 이는 염료 분자를 서로 다른 곡률의 이중 가닥 DNA 단편에 통합하여 형광 공명, 에너지 전달 또는 프렛에 의해 DNA 루핑을 모니터링할 수 있도록 함으로써 달성됩니다. 그런 다음 단일 DNA 분자에서 가역적인 루핑 및 언 루핑 이벤트를 전반사 현미경으로 관찰할 수 있습니다.그런 다음 DNA의 루핑 속도는 각 단일 분자 형광의 시간 궤적에서 외삽할 수 있습니다. 궁극적으로, 단편의 고유한 모양과 관련된 DNA의 루핑 확률을 측정할 수 있습니다. 이 DNA 루핑 분석의 주요 장점은 A DNA의 루핑 역학에 영향을 미칠 수 있는 A DNA 결합 단백질에 의존하지 않는다는 것입니다.간단한 프로토콜은 형광, 공명, 에너지 전달 및 PCR 기반 DNA 합성이라는 기술을 사용하는 것입니다. DNA의 룩킹 확률을 측정하려면 먼저 10MER 염기서열을 반복하여 전역적으로 구부러진 DNA를 설계합니다. 예를 들어, 이 대표적인 서열은 186 염기쌍 곡선 DNA이며, 여기서 X는 무작위 여분의 염기이고 반복되는 10 mers 서열 옆에 있는 서열은 어댑터 서열입니다.다음으로, 5개의 프라임 말단에서 프라이머 2의 프렛 공여체 SI 3 라벨링으로 프라이머 1 및 2로 PCR을 수행합니다. 그런 다음 백본을 통해 fret acceptor SCI 5 라벨링을 사용하여 primer 3 및 four를 사용한 PCR을 수행하고 primer three의 5 prime end에서 비오틴 링커를 수행합니다. PCR cleanup kit를 사용하여 PCR 산물을 정제한 후, SCI 3 라벨링 산물과 SCI 5 labeled 제품을 각각 0.4 마이크로몰 및 0.1 마이크로몰의 최종 농도에서 가닥 교환을 위한 완충액에 혼합합니다.그런 다음 가닥을 섭씨 98.5도에서 2분 동안 배양하고 초당 섭씨 0.1도의 램프 속도로 섭씨 5도까지 서서히 냉각한 다음 섭씨 5도에서 2시간 동안 배양합니다. 플로우 셀을 준비하기 위해 가닥을 교환하려면 드릴 프레스와 다이아몬드 드릴 비트를 사용하여 3인치 x 1인치 유리 슬라이드의 반대쪽 두 가장자리를 따라 6-7쌍의 구멍을 만듭니다. 구멍이 모두 뚫렸으면 흐르는 물에 슬라이드를 문질러 눈에 보이는 유리 가루를 제거합니다.유리병에 슬라이드를 똑바로 세우고 증류수로 채웁니다. 병을 15분 동안 초음파 처리한 다음 슬라이드를 아세톤 세척 전용 유리병에 옮깁니다. 병에 아세톤을 채우고 슬라이드를 아세톤으로 15분 더 초음파 처리합니다.다음으로, 슬라이드에 에탄올을 뿌린 다음 물을 뿌려 헹군 다음 슬라이드를 폴리프로필렌 용기에 옮깁니다. 폴리프로필렌 용기에 5몰 수산화칼륨을 채운 다음 마지막 세척 후 15분 더 슬라이드를 초음파 처리하고 슬라이드를 증류수로 헹구고 15분 더 가열합니다. 초음파 처리 후 덮개가 미끄러집니다.같은 방법으로 갓 준비한 PEG 용액 80마이크로리터를 각 슬라이드에 분배한 다음 페그 위로 커버 슬립을 부드럽게 내립니다. 45분 후 핀셋을 사용하여 슬라이드에서 커버 슬립을 제거하고 슬라이드와 커버 슬립을 다량의 증류수로 헹굽니다. 그런 다음 커버가 미끄러지고 슬라이드가 건조되면 건조제로 건조시키고 슬라이드를 가로질러 얇은 양면 스틱 테이프 스트립을 배치하여 채널을 형성하고 스트립을 위로 선을 긋고 커버 슬립을 단단히 눌러 액체 밀폐 채널을 형성합니다.그런 다음 5분 에폭시를 사용하여 채널의 가장자리를 밀봉하여 현미경 검사를 위해 분자를 고정합니다. 먼저 15마이크로리터의 뉴 트라딘 용액을 한 채널에 주입합니다. 2분 후 100마이크로리터의 T 50 버퍼로 채널을 헹구고 50마이크로리터의 DNA 샘플을 채널에 주입합니다.5분 후, 100마이크로리터의 T 50 버퍼로 결합되지 않은 DNA를 헹구고 산소 제거 시스템이 포함된 이미징 버퍼로 채널을 채웁니다. 이제 이멀젼 오일을 현미경 대물렌즈에 놓고 표본 클립을 사용하여 플로우 셀을 현미경 스테이지에 부착합니다. 532나노미터 레이저를 켭니다.라이브 사용 view 모니터에서 형광 이미지를 미세하게 만듭니다. 초점을 조정합니다. 532나노미터 레이저를 켠 상태에서 데이터 수집을 시작합니다.대부분의 분자가 이미지를 처리 및 분석하기 위해 광표백된 경우 데이터 수집을 중지하고 MATLAB 스크립트를 사용하여 고프렛 신호와 저프렛 신호 사이의 다중 전이를 보여주는 모든 단일 분자 시간 추적을 살펴봅니다. 루프된 상태와 루프가 없는 상태를 식별한 다음, 피팅된 두 가우스 곡선 간의 교차점을 결정하여 두 분포를 구분하는 임계값을 구합니다. 다음으로, SF 강도를 SCI 3과 SF 강도의 합으로 나누어 F 전면 효율을 계산합니다.루프 상태는 프렛 값이 높고, 루프 해제 상태는 프렛 값이 낮은 상태로 할당합니다. 그런 다음 MATLAB 스크립트를 사용하여 서로 다른 시간 경과에서 높은 프렛 상태에 도달한 루프된 분자 또는 NFT의 누적 수를 분석합니다. 데이터 수집이 시작된 이래로 NFT에 지수 함수를 피팅하여 루핑 속도 K 하위 루프를 추출할 수 있습니다.NFT가 bi를 증가시키면 기본적으로 방정식에 설명된 대로 이중 지수 함수를 맞출 수 있습니다. 이 경우, J 계수 흐름을 결정하기 위해 이 방정식에서 K 하위 루프를 얻습니다. 30-50 피카의 20 마이크로 리터몰, 비오틴, sci, 5 올리고 또는 프라이머 3을 너트 travain 코팅 채널 중 하나에 방금 설명했습니다.다음으로, 100마이크로리터의 T 50으로 채널을 헹구어 결합되지 않은 올리고를 씻어낸 다음 PS 3 올리고가 보충된 새로 준비된 이미징 버퍼를 챔버 내부로 흘려보냅니다. 532 나노미터 레이저를 켜둔 상태로 유지한 다음 640 나노미터 레이저를 잠시 켜서 표면에 결합된 공상 과학 올리고의 위치를 식별합니다. 그런 다음 640나노미터 레이저를 끄고 프렛 신호 모니터링을 시작합니다.MATLAB 스크립트를 사용하여 언바운드 상태에서 시작하는 분자의 개수를 분석합니다. 그것은 낮은 sci five intensity이지만 나중에 IL 상태로 바뀝니다. 즉, scifi intensity traces의 시간 함수로 높은 scifi intensity를 사용하며, 이 ane의 분자 수와 시간을 비교하여 단일 지수 함수로 곡선을 피팅하여 ealing rate를 얻습니다.K sub anil, 서로 다른 SI 3 올리고 농도에서 실험을 반복하여 니링 속도와 반응물 농도 사이의 선형성을 확인합니다. 기울기에서 2차, 무릎 꿇는 속도, 일정한 K, 프라임, 서브 ail을 추출합니다. 마지막으로, K sub loop는 동일한 완충액 조건에서 측정된 루핑 속도인 J 인자를 계산하여 이중 가닥 DNA의 고유 곡률이 루핑에 미치는 영향을 테스트합니다.이 실험에서는 하나의 직선 쌍과 하나의 곡선 186 염기쌍이 있습니다. 이중 가닥 DNA는 직선 DNA와 비교하여 각각 구성되었습니다. 곡선 DNA는 같은 기간 동안 더 많은 고초조(high fret) 이벤트를 생성하는 것으로 확인되었습니다.또한 곡선형 DNA는 동일한 획득 시간 동안 직선 DNA보다 4배 더 자주 반복되었는데, 이는 DNA의 고유 곡률이 반복 역학에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 이 최종 분석 단계에서 J 인자는 루핑 속도를 첫 번째 차수, 무릎 꿇기 속도 상수로 나누어 계산되었으며, 이전 발견과 일치하여 직선 DNA에 대해 61 플러스 또는 마이너스 3 아노 몰, 곡선 DNA에 대해 265 플러스 또는 마이너스 48 나노몰로 결정되었습니다. 이 절차에 따라 온도, 변형되지 않은 상태 및 점도와 같은 루프 이동성에 대한 사고 요인의 영향을 연구할 수 있습니다.이 프로토콜은 DNA의 고분자 물리학을 연구하는 데만 유용할 뿐만 아니라 초보 연구생이나 일반 청중에게 단일 분자 형광의 힘을 입증하는 데에도 유용할 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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이 프로토콜은 형광 현미경 기반 단일 분자 DNA 복제 분석의 개요를 설명하여 DNA 중합효소와 G-4중 구조와 같은 장애물 간의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

막 단백질 기능은 세포막의 지질 성분에 의해 규제됩니다. 이 비디오 - 문서 변경 막 속성의 기자로 이중층 패치 전극뿐만 아니라 사용하는 방법으로 그램이시딘 채널을 사용하여 패치를 형성하는 방법 세부 사항.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

학습하세요 단일 분자 FRET을 이용한 DNA 루핑 동역학 측정 방법을. DNA 결합 단백질 없이 고유 곡률에 따른 루핑 확률을 정량화하여 유전자 조절 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

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