단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

이 연구 결과는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 이중 가닥 DNA의 반복 역학을 측정하는 상세한 실험 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 J 인자라는 반복 확률 밀도를 추출하는 방법에 대해 설명합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 이중 가닥 DNA의 루프 역학이 DNA 결합 단백질을 사용하지 않고 DNA의 고유한 모양에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하는 것입니다. 이는 염료 분자를 서로 다른 곡률의 이중 가닥 DNA 단편에 통합하여 형광 공명, 에너지 전달 또는 프렛에 의해 DNA 루핑을 모니터링할 수 있도록 함으로써 달성됩니다. 그런 다음 단일 DNA 분자에서 가역적인 루핑 및 언 루핑 이벤트를 전반사 현미경으로 관찰할 수 있습니다.

그런 다음 DNA의 루핑 속도는 각 단일 분자 형광의 시간 궤적에서 외삽할 수 있습니다. 궁극적으로, 단편의 고유한 모양과 관련된 DNA의 루핑 확률을 측정할 수 있습니다. 이 DNA 루핑 분석의 주요 장점은 A DNA의 루핑 역학에 영향을 미칠 수 있는 A DNA 결합 단백질에 의존하지 않는다는 것입니다.

간단한 프로토콜은 형광, 공명, 에너지 전달 및 PCR 기반 DNA 합성이라는 기술을 사용하는 것입니다. DNA의 룩킹 확률을 측정하려면 먼저 10MER 염기서열을 반복하여 전역적으로 구부러진 DNA를 설계합니다. 예를 들어, 이 대표적인 서열은 186 염기쌍 곡선 DNA이며, 여기서 X는 무작위 여분의 염기이고 반복되는 10 mers 서열 옆에 있는 서열은 어댑터 서열입니다.

다음으로, 5개의 프라임 말단에서 프라이머 2의 프렛 공여체 SI 3 라벨링으로 프라이머 1 및 2로 PCR을 수행합니다. 그런 다음 백본을 통해 fret acceptor SCI 5 라벨링을 사용하여 primer 3 및 four를 사용한 PCR을 수행하고 primer three의 5 prime end에서 비오틴 링커를 수행합니다. PCR cleanup kit를 사용하여 PCR 산물을 정제한 후, SCI 3 라벨링 산물과 SCI 5 labeled 제품을 각각 0.4 마이크로몰 및 0.1 마이크로몰의 최종 농도에서 가닥 교환을 위한 완충액에 혼합합니다.

그런 다음 가닥을 섭씨 98.5도에서 2분 동안 배양하고 초당 섭씨 0.1도의 램프 속도로 섭씨 5도까지 서서히 냉각한 다음 섭씨 5도에서 2시간 동안 배양합니다. 플로우 셀을 준비하기 위해 가닥을 교환하려면 드릴 프레스와 다이아몬드 드릴 비트를 사용하여 3인치 x 1인치 유리 슬라이드의 반대쪽 두 가장자리를 따라 6-7쌍의 구멍을 만듭니다. 구멍이 모두 뚫렸으면 흐르는 물에 슬라이드를 문질러 눈에 보이는 유리 가루를 제거합니다.

유리병에 슬라이드를 똑바로 세우고 증류수로 채웁니다. 병을 15분 동안 초음파 처리한 다음 슬라이드를 아세톤 세척 전용 유리병에 옮깁니다. 병에 아세톤을 채우고 슬라이드를 아세톤으로 15분 더 초음파 처리합니다.

다음으로, 슬라이드에 에탄올을 뿌린 다음 물을 뿌려 헹군 다음 슬라이드를 폴리프로필렌 용기에 옮깁니다. 폴리프로필렌 용기에 5몰 수산화칼륨을 채운 다음 마지막 세척 후 15분 더 슬라이드를 초음파 처리하고 슬라이드를 증류수로 헹구고 15분 더 가열합니다. 초음파 처리 후 덮개가 미끄러집니다.

같은 방법으로 갓 준비한 PEG 용액 80마이크로리터를 각 슬라이드에 분배한 다음 페그 위로 커버 슬립을 부드럽게 내립니다. 45분 후 핀셋을 사용하여 슬라이드에서 커버 슬립을 제거하고 슬라이드와 커버 슬립을 다량의 증류수로 헹굽니다. 그런 다음 커버가 미끄러지고 슬라이드가 건조되면 건조제로 건조시키고 슬라이드를 가로질러 얇은 양면 스틱 테이프 스트립을 배치하여 채널을 형성하고 스트립을 위로 선을 긋고 커버 슬립을 단단히 눌러 액체 밀폐 채널을 형성합니다.

그런 다음 5분 에폭시를 사용하여 채널의 가장자리를 밀봉하여 현미경 검사를 위해 분자를 고정합니다. 먼저 15마이크로리터의 뉴 트라딘 용액을 한 채널에 주입합니다. 2분 후 100마이크로리터의 T 50 버퍼로 채널을 헹구고 50마이크로리터의 DNA 샘플을 채널에 주입합니다.

5분 후, 100마이크로리터의 T 50 버퍼로 결합되지 않은 DNA를 헹구고 산소 제거 시스템이 포함된 이미징 버퍼로 채널을 채웁니다. 이제 이멀젼 오일을 현미경 대물렌즈에 놓고 표본 클립을 사용하여 플로우 셀을 현미경 스테이지에 부착합니다. 532나노미터 레이저를 켭니다.

라이브 사용 view 모니터에서 형광 이미지를 미세하게 만듭니다. 초점을 조정합니다. 532나노미터 레이저를 켠 상태에서 데이터 수집을 시작합니다.

대부분의 분자가 이미지를 처리 및 분석하기 위해 광표백된 경우 데이터 수집을 중지하고 MATLAB 스크립트를 사용하여 고프렛 신호와 저프렛 신호 사이의 다중 전이를 보여주는 모든 단일 분자 시간 추적을 살펴봅니다. 루프된 상태와 루프가 없는 상태를 식별한 다음, 피팅된 두 가우스 곡선 간의 교차점을 결정하여 두 분포를 구분하는 임계값을 구합니다. 다음으로, SF 강도를 SCI 3과 SF 강도의 합으로 나누어 F 전면 효율을 계산합니다.

루프 상태는 프렛 값이 높고, 루프 해제 상태는 프렛 값이 낮은 상태로 할당합니다. 그런 다음 MATLAB 스크립트를 사용하여 서로 다른 시간 경과에서 높은 프렛 상태에 도달한 루프된 분자 또는 NFT의 누적 수를 분석합니다. 데이터 수집이 시작된 이래로 NFT에 지수 함수를 피팅하여 루핑 속도 K 하위 루프를 추출할 수 있습니다.

NFT가 bi를 증가시키면 기본적으로 방정식에 설명된 대로 이중 지수 함수를 맞출 수 있습니다. 이 경우, J 계수 흐름을 결정하기 위해 이 방정식에서 K 하위 루프를 얻습니다. 30-50 피카의 20 마이크로 리터몰, 비오틴, sci, 5 올리고 또는 프라이머 3을 너트 travain 코팅 채널 중 하나에 방금 설명했습니다.

다음으로, 100마이크로리터의 T 50으로 채널을 헹구어 결합되지 않은 올리고를 씻어낸 다음 PS 3 올리고가 보충된 새로 준비된 이미징 버퍼를 챔버 내부로 흘려보냅니다. 532 나노미터 레이저를 켜둔 상태로 유지한 다음 640 나노미터 레이저를 잠시 켜서 표면에 결합된 공상 과학 올리고의 위치를 식별합니다. 그런 다음 640나노미터 레이저를 끄고 프렛 신호 모니터링을 시작합니다.

MATLAB 스크립트를 사용하여 언바운드 상태에서 시작하는 분자의 개수를 분석합니다. 그것은 낮은 sci five intensity이지만 나중에 IL 상태로 바뀝니다. 즉, scifi intensity traces의 시간 함수로 높은 scifi intensity를 사용하며, 이 ane의 분자 수와 시간을 비교하여 단일 지수 함수로 곡선을 피팅하여 ealing rate를 얻습니다.

K sub anil, 서로 다른 SI 3 올리고 농도에서 실험을 반복하여 니링 속도와 반응물 농도 사이의 선형성을 확인합니다. 기울기에서 2차, 무릎 꿇는 속도, 일정한 K, 프라임, 서브 ail을 추출합니다. 마지막으로, K sub loop는 동일한 완충액 조건에서 측정된 루핑 속도인 J 인자를 계산하여 이중 가닥 DNA의 고유 곡률이 루핑에 미치는 영향을 테스트합니다.

이 실험에서는 하나의 직선 쌍과 하나의 곡선 186 염기쌍이 있습니다. 이중 가닥 DNA는 직선 DNA와 비교하여 각각 구성되었습니다. 곡선 DNA는 같은 기간 동안 더 많은 고초조(high fret) 이벤트를 생성하는 것으로 확인되었습니다.

또한 곡선형 DNA는 동일한 획득 시간 동안 직선 DNA보다 4배 더 자주 반복되었는데, 이는 DNA의 고유 곡률이 반복 역학에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 이 최종 분석 단계에서 J 인자는 루핑 속도를 첫 번째 차수, 무릎 꿇기 속도 상수로 나누어 계산되었으며, 이전 발견과 일치하여 직선 DNA에 대해 61 플러스 또는 마이너스 3 아노 몰, 곡선 DNA에 대해 265 플러스 또는 마이너스 48 나노몰로 결정되었습니다. 이 절차에 따라 온도, 변형되지 않은 상태 및 점도와 같은 루프 이동성에 대한 사고 요인의 영향을 연구할 수 있습니다.

이 프로토콜은 DNA의 고분자 물리학을 연구하는 데만 유용할 뿐만 아니라 초보 연구생이나 일반 청중에게 단일 분자 형광의 힘을 입증하는 데에도 유용할 것입니다.