Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

आरएनए अनुक्रमण परख जीन एक्सप्रेशन और जीनोमिक बदलाव विशेषताएँ करने का लक्ष्य

Published: August 4, 2016 doi: 10.3791/54090
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, The Ohio State University

Abstract

आरएनए अनुक्रमण (RNAseq) एक बहुमुखी तरीका है कि पता लगाने और जीन अभिव्यक्ति, म्यूटेशन, जीन fusions, और noncoding RNAs को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। 100 मिलियन अनुक्रमण पढ़ता है और इस तरह के mRNA और noncoding RNAs के रूप में कई आरएनए उत्पादों में शामिल कर सकते हैं - मानक RNAseq 30 की आवश्यकता है। हम कैसे लक्षित RNAseq (कब्जा) एक डेस्कटॉप sequencer का उपयोग कर चुना आरएनए उत्पादों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन परमिट प्रदर्शित करता है। RNAseq कब्जा, unannotated कम, या क्षणिक व्यक्त टेप है कि अन्यथा पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर RNAseq याद किया जा सकता चिह्नित कर सकते हैं। यहाँ हम सेल लाइनों, ribosomal शाही सेना कमी, सीडीएनए संश्लेषण, बारकोड वाले पुस्तकालयों, संकरण और लक्षित टेप का कब्जा है और एक डेस्कटॉप sequencer पर मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण की तैयारी से शाही सेना की निकासी का वर्णन है। हम यह भी कम्प्यूटेशनल विश्लेषण पाइप लाइन है, जो गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन, संरेखण, फ्यूजन का पता लगाने, जीन अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव और एकल NUC की पहचान शामिल है, की रूपरेखा तैयारleotide वेरिएंट। इस परख जीन अभिव्यक्ति, जीन fusions, और परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए लक्षित प्रतिलेख अनुक्रमण के लिए अनुमति देता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल एक साथ प्रसंस्करण और चार नमूनों के विश्लेषण का वर्णन है। इस विधि कोशिकाओं से अलग शाही सेना, ताजा जमे हुए ऊतक और formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक (FFPE) के साथ संगत है। प्रत्येक नमूना के लिए शाही सेना इनपुट शुरू करने की 1,000 एनजी (250 की सिफारिश की एनजी) - इस प्रोटोकॉल 50 के साथ शुरू होता है।

1. rRNA कमी और आरएनए प्रक्रिया के विखंडन

  1. rRNA कमी
    1. कमरे के तापमान पर Elute, प्रधानमंत्री, टुकड़ा मिश्रण, rRNA हटाने मिश्रण, rRNA बाध्यकारी बफर और मेजबान बफर -20 डिग्री सेल्सियस और पिघलना से निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस से क्षालन बफर, rRNA हटाने माला और आरएनए / सीडीएनए विशिष्ट समचुंबक मोती निकालें और कमरे के तापमान को लाने के लिए।
    2. शाही सेना के 0.25 माइक्रोग्राम पीसीआर ट्यूब में जोड़े। 10 μl की कुल मात्रा को अंतिम nuclease मुक्त अति शुद्ध पानी के साथ कुल शाही सेना पतला। प्रत्येक ट्यूब rRNA बाध्यकारी बफर के 5 μl जोड़ें तो धीरे pipett rRNA हटाने मिश्रण के 5 μl और जोड़नेई ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए। ढक्कन के साथ थर्मल cycler में रखें ट्यूबों के 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस के लिए 100 डिग्री सेल्सियस और कार्यक्रम थर्मल साइक्लर पूर्व गर्म किया आरएनए denature करने के लिए।
    3. आरएनए विकृतीकरण के बाद, थर्मल साइक्लर से ट्यूबों को हटाने और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। भंवर rRNA हटाने मनका ट्यूब सख्ती मोती resuspend। नई ट्यूबों के लिए rRNA हटाने मोतियों की 35 μl जोड़ें और rRNA हटाने मोती युक्त ट्यूबों के लिए आरएनए विकृतीकरण प्रतिक्रिया (20 μl) हस्तांतरण।
    4. 45 μl और पिपेट जल्दी करने के लिए पिपेट समायोजित करें और नीचे 20x मिश्रण करने के लिए। 1 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं। फिर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड में ट्यूबों की जगह। नव लेबल पीसीआर ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और इन ट्यूबों 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड में फिर से जगह है। यह सुनिश्चित करता है कि कोई मोती स्थानांतरित कर रहे हैं। नव लेबल पीसीआर ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    5. भंवर आरएनए / सीडीएनए विशिष्ट समचुंबक माला और प्रत्येक ट्यूब मोतियों की 99 μl जोड़ें। धीरे पिपेट पूरेमात्रा ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। अपमानित शाही सेना के साथ शुरू करते हैं, तो प्रत्येक ट्यूब अच्छी तरह से मिश्रित आरएनए / सीडीएनए विशिष्ट समचुंबक मोतियों की 193 μl जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। फिर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों जगह है। निकालें और supernatants त्यागें।
    6. हौसले से तैयार 70% इथेनॉल (EtOH) के 200 μl जोड़ें। चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों रखें और देखभाल मोती को परेशान नहीं करने के लिए। 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, तो हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 10 मिनट के सूखने के लिए - ट्यूब कमरे के तापमान पर खड़ा करने के लिए 5 के लिए अनुमति दें।
    7. अपकेंद्रित्र 5 सेकंड के लिए 600 × छ कमरे के तापमान क्षालन बफर thawed। प्रत्येक ट्यूब क्षालन बफर के 11 μl जोड़ें और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। 2 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों रखें। नव लेबल पीसीआर ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला के 8.5 μl स्थानांतरण।
  2. RRNA समाप्त शाही सेना के विखंडन
    1. 8.5 μl El जोड़ेसंस्थान, 8.5 μl प्रधानमंत्री, और प्रत्येक ट्यूब 8.5 μl टुकड़ा मिश्रण। धीरे विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। 100 डिग्री सेल्सियस, 94 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म ढक्कन 8 मिनट, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ के लिए: निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ थर्मल cycler में रखें ट्यूबों।
      नोट: यह कदम 155 बीपी के एक औसत आकार डालने उत्पन्न करने के लिए बनाया गया है। शाही सेना के नमूने की औसत टुकड़ा आकार की तुलना में कम 200 बीपी है, तो इस कदम को छोड़ और पहले Strand सीडीएनए संश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।

2. सीडीएनए संश्लेषण

  1. Synthesize पहले Strand सीडीएनए
    1. -20 डिग्री सेल्सियस से पहले कतरा संश्लेषण मिश्रण निकालें और कमरे के तापमान पर पिघलना।
    2. पूर्व कार्यक्रम के बाद सेटिंग्स के साथ थर्मल साइक्लर: पूर्व गर्मी ढक्कन विकल्प और 15 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए और फिर 25 डिग्री सेल्सियस, 42 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए, 70 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । इस कार्यक्रम के रूप में सहेजें "Synthesize 1 सेंट किनारा।"
    3. 600 & # पर अपकेंद्रित्र thawed-पहली कतरा संश्लेषण मिश्रण ट्यूब215; 5 सेकंड के लिए जी। मिक्स 1 μl पहली कतरा संश्लेषण मिश्रण के 9 μl साथ ट्रांसक्रिप्टेज रिवर्स।
    4. पहली कतरा संश्लेषण के 8 μl जोड़ें और प्रत्येक ट्यूब ट्रांसक्रिप्टेज मिश्रण रिवर्स, धीरे विंदुक ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए 6x। 6.0 XG पर एक निश्चित गति मिनी टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 4 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए तरल लाने के लिए। थर्मल cycler में ट्यूबों प्लेस और चयन Synthesize 1 सेंट किनारा। थर्मल साइक्लर 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, ट्यूब को हटाने और तुरंत आगे बढ़ना दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण करने।
  2. Synthesize दूसरा कतरा सीडीएनए
    1. ढक्कन के साथ 16 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्मी थर्मल साइक्लर 30 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म। पिघलना दूसरा किनारा मास्टर मिश्रण और बर्फ पर फिर से निलंबन बफर। अग्रिम में, 4 डिग्री सेल्सियस से समचुंबक मोतियों की बोतल को दूर करने और कम से कम 30 मिनट के लिए खड़े उन्हें कमरे के तापमान पर लाने के लिए करते हैं।
    2. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के लिए मेजबान बफर के 5 μl जोड़ें। 600 पर अपकेंद्रित्र दूसरा किनारा मास्टर मिश्रण5 सेकंड के लिए × छ और प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के लिए 20 μl जोड़ें। 1 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म थर्मल cycler में रखें ट्यूबों। जब ऊष्मायन पूरा हो गया है, थर्मल साइक्लर से हटाने और ट्यूबों कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. भंवर समचुंबक मोती, जब तक वे अच्छी तरह बिखरे हैं। प्रत्येक ट्यूब अच्छी तरह से मिश्रित समचुंबक मोती के 90 μl जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों सेते हैं। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर जगह ट्यूब।
    4. निकालें और सतह पर तैरनेवाला के 135 μl त्यागें तो EtOH धोने प्रदर्शन करने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों छोड़ दें। मोती परेशान बिना हौसले प्रत्येक ट्यूब करने के लिए 80% EtOH तैयार 200 μl जोड़ें, तो 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। निकालें और प्रत्येक से सतह पर तैरनेवाला के सभी त्यागें। दो 80% EtOH washes के एक कुल के लिए दोहराएँ।
    5. 10 मिनट के चुंबकीय स्टैंड पर सुखाने के लिए - ट्यूब कमरे के तापमान पर खड़े 5 के लिए करते हैं। thawed कमरे temperatur अपकेंद्रित्रपर 5 सेकंड के लिए 600 × छ ई मेजबान बफर। चुंबकीय स्टैंड से पीसीआर ट्यूबों निकालें। प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के लिए 17.5 μl मेजबान बफर जोड़ें और धीरे पूरी मात्रा पिपेट और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूबों सेते हैं।
    6. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर जगह ट्यूब, तो 15 μl सतह पर तैरनेवाला (डबल असहाय सीडीएनए) 0.2 मिलीग्राम पीसीआर पट्टी ट्यूबों को हस्तांतरण।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु के रूप में सीडीएनए अप करने के लिए 7 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. पुस्तकालय तैयारी

  1. Adenylate 3 'समाप्त होता है
    1. कमरे के तापमान पर -20 डिग्री सेल्सियस और पिघलना से एक-पीछा मिश्रण निकालें। पूर्व कार्यक्रम के बाद सेटिंग्स के साथ थर्मल साइक्लर: पूर्व गर्मी ढक्कन विकल्प चुनते हैं और 100 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट है, तो 37 डिग्री 5 मिनट के लिए 30 मिनट के लिए सी, 70 डिग्री सेल्सियस पर सेट और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। के रूप में इस कार्यक्रम सहेजें "ATAIL70।"
    2. मेजबान के 2.5 μl जोड़ेप्रत्येक ट्यूब बफर। फिर thawed ए-पीछा मिश्रण का 12.5 μl जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए। थर्मल cycler में ट्यूबों की जगह और ATAIL70 का चयन करें। थर्मल साइक्लर तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर है जब, थर्मल साइक्लर से पीसीआर ट्यूबों निकालें और तुरंत आगे बढ़ना एडेप्टर ligate करने के लिए।
  2. Ligate एडेप्टर
    1. उचित आरएनए एडाप्टर ट्यूबों निकालें, -20 डिग्री सेल्सियस से बंधाव बफर और मेजबान बफर रोकने के लिए और कमरे के तापमान पर पिघलना। -20 डिग्री सेल्सियस से बंधाव मिश्रण ट्यूब को हटाने के प्रोटोकॉल में ऐसा करने का निर्देश दिया है जब तक मत करो। 4 डिग्री सेल्सियस से समचुंबक मोतियों की बोतल निकालें और कम से कम 30 मिनट के कमरे के तापमान को लाने के लिए खड़े हो जाओ।
    2. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए थर्मल साइक्लर पूर्व गर्मी और पूर्व गर्मी ढक्कन विकल्प है और 100 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट का चयन करें। अपकेंद्रित्र में 5 सेकंड के लिए 600 × छ thawed आरएनए एडाप्टर ट्यूबों। तुरंत उपयोग करने से पहले, -20 डिग्री सेल्सियस से बंधाव मिश्रण ट्यूब हटा देंभंडारण।
    3. प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए मेजबान बफर के 2.5 μl जोड़ें। बंधाव मिश्रण के 2.5 μl जोड़ें। बंधाव मिश्रण ट्यूब -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण तुरंत उपयोग के बाद पर लौटें। प्रत्येक नमूना ट्यूब thawed आरएनए एडाप्टर सूचकांक 2.5 μl जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
    4. 4 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के 6.0 x जी पर एक निश्चित गति मिनी टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर। पूर्व गर्म थर्मल cycler में रखें ट्यूबों। ढक्कन बंद करें और 10 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. थर्मल साइक्लर से ट्यूबों निकालें और बंधाव निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक ट्यूब रोक बंधाव बफर के 5 μl जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
    6. दोहराएँ धोने 2.2.3 में वर्णित के रूप में - 2.2.4, मिश्रित समचुंबक मोतियों की 42 μl का उपयोग कर, और 79.5 μl सतह पर तैरनेवाला discarding। 10 मिनट - चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों के साथ, 5 के लिए कमरे के तापमान पर नमूने हवा शुष्क करते हैं।
    7. से पीसीआर पट्टी ट्यूबों निकालेंचुंबकीय स्टैंड और प्रत्येक ट्यूब 52.5 μl मेजबान बफर जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए। 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों सेते हैं। आरटी पर चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों 5 मिनट के लिए या जब तक तरल स्पष्ट है रखें। स्थानांतरण नई 0.2 मिलीग्राम पीसीआर पट्टी ट्यूबों के लिए प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला के 50 μl। देखभाल मोती परेशान करने के लिए नहीं ले लो।
    8. दोहराएँ धोने 2.2.3 में वर्णित के रूप में - 2.2.4, मिश्रित समचुंबक मोती के 50 μl का उपयोग कर, और 95 μl सतह पर तैरनेवाला discarding। 10 मिनट - चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों के साथ, 5 के लिए आरटी पर नमूने हवा शुष्क करते हैं।
    9. चुंबकीय स्टैंड से पीसीआर पट्टी ट्यूबों निकालें और प्रत्येक ट्यूब 22.5 μl मेजबान बफर जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
    10. 2 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं। 5 मिनट के लिए या जब तक तरल स्पष्ट है कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों रखें। प्रत्येक ट्यूब से स्थानांतरण 20 एक सतह पर तैरनेवाला μlनई 0.2 मिलीग्राम पीसीआर पट्टी ट्यूब। देखभाल मोती परेशान करने के लिए नहीं ले लो। यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है और सीडीएनए अप करने के लिए 7 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

4. पुस्तकालय प्रवर्धन

  1. समृद्ध डीएनए टुकड़े
    1. कमरे के तापमान पर पीसीआर मास्टर मिश्रण, पीसीआर प्राइमर कॉकटेल और -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण और पिघलना से मेजबान बफर निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से समचुंबक मोतियों की बोतल निकालें और कम से कम 30 मिनट के कमरे के तापमान को लाने के लिए खड़े हो जाओ।
    2. पूर्व कार्यक्रम के बाद सेटिंग्स के साथ थर्मल साइक्लर: पूर्व गर्मी ढक्कन विकल्प चुनते हैं और 100 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट है, तो प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए, 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड, annealing के लिए सेट विकृतीकरण के 15 चक्रों 60 डिग्री 30 सेकंड, 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार चक्र और 30 सेकंड के लिए, और 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार के लिए सी में 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। इस कार्यक्रम के रूप में सहेजें "पीसीआर।"
    3. thawed पीसीआर मास्टर अपकेंद्रित्रपर 600 × छ मिश्रण और पीसीआर प्राइमरों नलियों 5 सेकंड के लिए। प्रत्येक नमूना ट्यूब thawed पीसीआर प्राइमरों के 5 μl जोड़ें। प्रत्येक नमूना ट्यूब thawed पीसीआर मास्टर मिश्रण के 25 μl जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
    4. पूर्व क्रमादेशित थर्मल cycler में छाया हुआ पीसीआर पट्टी ट्यूबों रखें। ढक्कन बंद और पीसीआर कार्यक्रम चलाते हैं। जब पीसीआर पूरा हो गया है, थर्मल साइक्लर से ट्यूबों निकालें और बर्फ पर रहते हैं।
    5. दोहराएँ धोने 2.2.3 में वर्णित के रूप में - 2.2.4, मिश्रित समचुंबक मोती के 50 μl का उपयोग कर, और 95 μl सतह पर तैरनेवाला discarding। 10 मिनट - चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों के साथ, 5 के लिए कमरे के तापमान पर नमूने हवा शुष्क करते हैं।
    6. चुंबकीय स्टैंड से ट्यूबों निकालें और प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए 32.5 μl मेजबान बफर जोड़ें। धीरे पूरी मात्रा विंदुक ऊपर और नीचे 10x मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए। 2 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 5 मिनट के लिए या जब तक तरल स्पष्ट है कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर पीसीआर ट्यूबों रखें। फिर 30 μl सु हस्तांतरणताजा 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों के लिए pernatant।
    7. एक fluorometer 7 का उपयोग सीडीएनए की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन और एक केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करते हुए 8 सीडीएनए गुणवत्ता का निर्धारण।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है और सीडीएनए अप करने के लिए 7 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। नोट: यह पुस्तकालय एक RNAseq पुस्तकालय माना जाता है।
      बाद के चरणों का एक कैद पुस्तकालय के लिए सीसा।

5. संकरण, कब्जा और अनुक्रमण

  1. मल्टिप्लेक्स संकरण
    1. -20 डिग्री सेल्सियस से कस्टम हाइड्रेटेड जांच, खटिया -1 डीएनए, सार्वभौमिक अवरुद्ध ओलिगोस, और एडाप्टर विशिष्ट अवरुद्ध ओलिगोस निकालें और बर्फ पर पिघलना।
    2. एक कम बाँध 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, 500 एनजी डीएनए गठबंधन (नमूना प्रति 125 एनजी जब बहुसंकेतन 4 नमूने), 5 μl खटिया -1 डीएनए (1 माइक्रोग्राम / μl), 1UL सार्वभौमिक अवरुद्ध ओलिगोस, 0.5 μl P7 (6 न्यूक्लियोटाइड) एडाप्टर विशिष्ट ओलिगोस अवरुद्ध (इस राशि मल्टीप्लेक्स conditi के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती हैons) और 0.5 μl P7 (8 न्यूक्लियोटाइड) एडाप्टर विशिष्ट अवरुद्ध ओलिगोस (इस राशि मल्टीप्लेक्स की स्थिति पर निर्भर करता है) समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    3. टोपी खोलने के रोटेशन की विपरीत दिशा का सामना करना पड़ के साथ एक शून्य concentrator में नमूना ट्यूब रखें। 20 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर या तरल का पूरा वाष्पीकरण जब तक सूखी सामग्री।
    4. 8.5 μl 2x संकरण बफर, 3.4 μl संकरण घटक एक और 1.1 μl nuclease मुफ्त पानी के साथ सूखे सामग्री Resuspend। मेजबान और भंवर हर 2.5 मिनट के लिए 10 मिनट की अनुमति दें। एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब पर स्थानांतरण resuspended-सामग्री और एक थर्मल साइक्लर पर 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. थर्मल साइक्लर से संकरण नमूना ट्यूब निकालें और 1.5 pmol / μl की एकाग्रता में resuspended कस्टम जांच के 2 μl जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, 0.75 pmol / μl की एकाग्रता में resuspended कस्टम जांच के 4 μl जोड़ें। 65 डिग्री सेल्सियस पर - (24 घंटा 16) संकरण प्रतिक्रिया रातोंरात सेते हैं।
      नोट: जांचविभिन्न विक्रेताओं से खरीदा रों इस्तेमाल किया जा सकता है और निर्माता के निर्देशों का पालन किया जाना चाहिए। संकरण कदम की अवधि भी भिन्न हो सकते हैं।
  2. मनका तैयारी और कब्जा
    1. 4 डिग्री सेल्सियस से streptavidin युग्मित समचुंबक मोतियों की बोतल निकालें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करना। 1x काम कर समाधान बनाने के लिए 10x धो बफ़र (मैं, द्वितीय, तृतीय, और कड़े) और 2.5x मनका धो बफर पतला।
    2. विभाज्य एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मैं 1x धो बफर के 140 μl। 1x कड़े बफर की गर्मी पूरी राशि कम से कम 2 घंटे के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 65 डिग्री सेल्सियस पर 1x धो बफर मैं के विभाज्य।
    3. विभाज्य एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कब्जा प्रति streptavidin युग्मित समचुंबक मोतियों की 100 μl। चुंबक पर रखें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 10 सेकंड के लिए प्रति 100 μl मोती 200 μl मनका धो बफर और भंवर जोड़ें। 5 मिनट या जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है - चुंबक पर 2 के लिए रखें। एक बार सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है, यह त्यागने और फिर सेएक बार दो washes के एक कुल के लिए और अधिक पीट।
    4. मनका धो बफर को हटाने के बाद, प्रारंभिक प्रारंभिक मात्रा के रूप में बराबर मात्रा मनका धो बफर जोड़ने (यानी, एक को पकड़ने के लिए 100 μl)। Resuspend और एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब को हस्तांतरण। 5 मिनट या जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है - 2 के लिए चुंबकीय रैक में ट्यूब रखें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. दोनों संकरण नमूना और 65 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल cycler में मोतियों के साथ, मनका ट्यूब और पिपेट अप करने के लिए संकरण मिश्रण हस्तांतरण और नीचे 10x मिश्रण करने के लिए। 45 मिनट, भंवर के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और एक निश्चित गति (6.0 XG) टेबल टॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 4 सेकंड के लिए नमूना नीचे स्पिन।
  3. मनका धो
    1. थर्मल साइक्लर से कब्जा ट्यूब निकालें और 100 μl पूर्व गर्म 1x धो बफर मैं मिश्रण करने के लिए 10 सेकंड के लिए ट्यूब और भंवर में जोड़ें। एक ताजा कम बाँध 1.5 मिलीलीटर ट्यूब मिश्रण स्थानांतरण। एक चुंबकीय जुदाई रैक में ट्यूब प्लेस और 2 अनुमति - अलग होने के लिए या जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है 5 मिनट। डीiscard सतह पर तैरनेवाला।
    2. 200 μl छोड़ देते 1x कड़े धो बफर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए 10 बार नीचे विंदुक ऊपर और। 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। चुंबकीय जुदाई रैक में ट्यूब प्लेस और 2 अनुमति - अलग होने के लिए या जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है 3 मिनट। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। कड़े धोने एक बार दो washes के एक कुल के लिए और अधिक दोहराएँ।
    3. जोड़े 200 μl कमरे के तापमान 1x मैं और भंवर 2 मिनट के मिश्रण करने के लिए बफर धो लें। चुंबकीय जुदाई रैक में ट्यूब प्लेस और अनुमति देने के लिए 2 - अलग होने के लिए या जब तक सतह पर तैरनेवाला 5 मिनट स्पष्ट है। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. जोड़े 200 μl कमरे के तापमान 1x 1 मिनट मिश्रण करने के लिए बफर द्वितीय और भंवर धो लें। चुंबकीय जुदाई रैक में ट्यूब प्लेस और अनुमति देने के लिए 2 - अलग होने के लिए या जब तक सतह पर तैरनेवाला 5 मिनट स्पष्ट है। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. 200 जोड़े μl कमरे के तापमान 1x मिश्रण करने के लिए 30 सेकंड के लिए बफर तृतीय और भंवर धो लें। अलग होने के लिए या जब तक सतह पर तैरनेवाला 5 मिनट - चुंबकीय जुदाई रैक की अनुमति के 2 में ट्यूब रखेंसाफ है। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. चुंबकीय जुदाई रैक से ट्यूब निकालें और मोती resuspend 20 μl nuclease मुक्त पानी जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा और 10 बार नीचे अच्छी तरह मिक्स।
  4. पोस्ट कैद पीसीआर प्रवर्धन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस से समचुंबक मोती निकालें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करना।
    2. आरटी पर -20 डिग्री सेल्सियस और पिघलना से गर्म शुरू पीसीआर तैयार मिक्स (2x) और पीसीआर प्राइमर मिश्रण निकालें और फिर बर्फ पर जगह है। (इन संस्करणों 1 संकरण पुस्तकालय प्लस 10% अतिरिक्त के लिए कर रहे हैं) पीसीआर प्राइमर 1 से 2.75 μl और पीसीआर प्राइमर 2 की 2.75 μl के साथ 2x गर्म शुरू पीसीआर तैयार मिक्स के 27.5 μl के संयोजन से पुस्तकालय प्रवर्धन मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    3. सेटअप मोतियों की 20 μl प्लस 50 μl की कुल मात्रा के लिए पुस्तकालय प्रवर्धन मास्टर मिश्रण के 30 μl के साथ कब्जा कर लिया डीएनए जोड़कर पीसीआर ट्यूब में प्रतिक्रिया। टोपी ट्यूब ठीक से और भंवर मिश्रण करने के लिए। 4 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब एक निश्चित गति मिनी टैब का उपयोगपर 6.0 x जी le-शीर्ष सेंट्रीफ्यूज।
      1. निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम निर्धारित करें: - 12 विकृतीकरण के चक्र 98 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, annealing के लिए 65 में पूर्व गर्मी ढक्कन विकल्प चुनते हैं और 100 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट है, तो प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड, 10 के लिए निर्धारित डिग्री सेल्सियस 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड और विस्तार, 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार चक्र और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ के लिए।
    4. thermocycler से नमूना निकालें और 75 μl समचुंबक मोती जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    5. 2 के लिए कमरे के तापमान पर चुंबक पर ट्यूबों की जगह - 3 मिनट के लिए और फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 200 μl 80% इथेनॉल उनका कहना है, के लिए 30 सेकंड फिर सतह पर तैरनेवाला हटाने incubating द्वारा चुंबक पर मोती धो लें। दो 80% washes के एक कुल के लिए दोहराएँ।
    6. आरटी पर सेते 5 के लिए - 10 मिनट मोती सूखे के लिए अनुमति देते हैं। खत्म नहीं हुआ खुर के लिए सूखी करो। Tris-EDTA पीएच 8.0 (1x ते समाधान) के 22 μl में और क्षालन के लिए 3 मिनट के लिए अनुमति देते हैं Resuspend मोती। 5 मिनट वें - 3 के लिए चुंबक पर नमूना प्लेसएन हस्तांतरण एक ताजा कम बाँध 1.5 मिलीलीटर ट्यूब eluted उत्पाद के 20 μl, कोई मोती सुनिश्चित करने पर किया जाता है।
    7. Fluorometer 7 का उपयोग कर कब्जा कर लिया सीडीएनए की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन और कब्जा कर लिया सीडीएनए गुणवत्ता का निर्धारण एक केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करते हुए 8।
  5. डेस्कटॉप Sequencer लोडिंग प्रक्रिया 9
    1. 10 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.5 का उपयोग कर 0.1% बीच 20 पिघलना 10 एन NaOH और बर्फ पर संकरण बफर के साथ 4 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए कब्जा कर लिया सीडीएनए पुस्तकालय पतला। उपयोग करने से पहले लगभग 30 मिनट, आरटी पानी में डेस्कटॉप sequencer v2 अभिकर्मक किट बॉक्स 1 पिघलना। मैक्स भरण लाइन 10 से ऊपर भरने मत करो। कृपया ध्यान दें कि यह एक अनुक्रमण मंच विशिष्ट प्रक्रिया है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
    2. एक microcentrifuge ट्यूब (हमेशा ताजा तैयार) में 980 μl nuclease मुफ्त पानी के साथ 20 μl 10 एन NaOH के संयोजन से 0.2 एन NaOH के 1ml तैयार करें। द्वारा 4 एनएम को PhiX पुस्तकालय (पुस्तकालय नियंत्रण) पतला3 μl 10mM Tris-सीएल पीएच 8.5 के साथ 10 एनएम पुस्तकालय नियंत्रण के 2 μl के संयोजन 0.1% बीच 20 के साथ।
    3. संक्षेप में 0.2 एन NaOH के 5 μl और भंवर के साथ 4nM पुस्तकालय के 5 μl के संयोजन मिश्रण करने से अंतिम पुस्तकालय और पुस्तकालय नियंत्रण denature। 4 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के 6.0 x जी पर एक निश्चित गति मिनी टेबल टॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग। आरटी पर सेते 5 मिनट के पुस्तकालयों denature करने के लिए।
    4. विकृत पुस्तकालयों के 10 μl युक्त ट्यूबों के लिए पूर्व ठंडा संकरण बफर के 990 μl जोड़ें। यह एक 20 बजे पुस्तकालय में यह परिणाम है। मार्क की तारीख के साथ विकृत 20 बजे पुस्तकालय और -20 डिग्री सेल्सियस पर ऊपर से 3 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है।
    5. 12.5 बजे पुस्तकालय नियंत्रण में परिणाम की पूर्व ठंडा संकरण बफर और पतला पुस्तकालय नियंत्रण के 225 μl के साथ 20 बजे पुस्तकालय नियंत्रण के 375 μl मिक्स। समाधान मिश्रण करने के लिए कई बार पलटना।
    6. 12.5 pM विकृत पुस्तकालय नियंत्रण और मिश्रण करने के भंवर के 6 μl के साथ विकृत अंतिम पुस्तकालय के 594 μl जुडा है। संयुक्त samp सेटLe पुस्तकालय और पुस्तकालय बर्फ पर एक तरफ नियंत्रण जब तक नमूने डेस्कटॉप sequencer अभिकर्मक कारतूस में लोड करने के लिए तैयार हैं।

6. डेटा विश्लेषण

  1. अनुक्रम गुणवत्ता मूल्यांकन
    1. कच्चे अनुक्रम डेटा (fastq फ़ाइलें) अनुक्रम गुणवत्ता के आकलन का उपयोग कर 11 की गुणवत्ता की गणना।
      नोट: इस कदम से पहले इसे आगे बहाव के विश्लेषण के अधीन है डेटा का आकलन करने में मदद करता है। सॉफ्टवेयर में निर्मित मानकों के साथ चलाता है और प्रत्येक fastq फ़ाइल के लिए मेट्रिक्स का एक सेट पैदा करता है।
  2. संरेखण
    1. संरेखित अनुक्रम संदर्भ मानव जीनोम hg19 और transcriptome Tophat2 12 उपयोग करने के लिए (fastq फ़ाइलें) (संस्करण 2.0.10) पढ़ता एक GTF फ़ाइल के रूप में जाना जाता टेप प्रदान करते हुए। उत्पादन बेम फ़ाइल नामक एक द्विआधारी संरेखण प्रारूप के रूप में है।
    2. छंटाई और अनुक्रमण Samtools 13 (संस्करण 0.1.19 का उपयोग सहित पोस्ट प्रोसेसिंग चरणों का प्रदर्शन) बेम फ़ाइल पर। अंकन डुप्लिकेट प्रदर्शन करना, सैम पुनर्व्यवस्था, आकार गणना और जोड़ने या की जगह पढ़ें समूहों पिकार्ड उपकरण 14 (संस्करण 1.84) का उपयोग कर डालें।
  3. RNAseq गुणवत्ता मूल्यांकन
    1. RNAseq गुणवत्ता के आकलन का उपयोग कर RNAseq डेटा के लिए गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स की एक श्रृंखला की गणना करें। इस सॉफ्टवेयर के लिए इनपुट Tophat2 संरेखण से एक बेम फ़ाइल 15 है। उत्पादन एक HTML फ़ाइल है कि कुल पढ़ें गिनती, डुप्लिकेट सूचीबद्ध दूसरों के बीच में, प्रतिशत और rRNA प्रतिशत, आदि पढ़ने के लिए मैप किया गया है।
  4. संस्करण कॉलिंग
    1. संरेखण के लिए स्टार (संस्करण 2.4.0) 16 उपयोग और उसके बाद एकल nucleotide फोन GATK के (संस्करण 3.3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK बेम बाद के प्रसंस्करण कदम और छानने के मानदंड का उपयोग करने के लिए झंडा और उत्पादन से झूठी सकारात्मक हटाने वेरिएंट।
  5. जीन अभिव्यक्ति
    1. गणना जीन अभिव्यक्ति यूएसआईएनजी कफ़लिंक सॉफ्टवेयर (संस्करण 2.1.1) टक्सेडो सूट 18 से।
      नोट: इनपुट Tophat2 संरेखण उपकरण से एक बेम फ़ाइल है। उत्पादन isoform, जीन और प्रतिलेख स्तर, अभिव्यक्ति (मिलियन मैप पढ़ता प्रति kilobase प्रति टुकड़े) FPKM के रूप में गणना की जाती है जहां पर उत्पादन किया जाता है।
  6. फ्यूजन कॉलिंग
    1. ChimeraScan 19 (संस्करण 0.4.5), Tophat फ्यूजन 20 कस्टम और Trup 21 का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने से fusions बुलाओ। Oncofuse 22 (संस्करण 1.0.9b2) का उपयोग डोमेन के लिए fusions व्याख्या।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNAseq कैद में एक योजनाबद्ध पर प्रकाश डाला महत्वपूर्ण कदम चित्र 1 में दिखाया गया है। ज्ञात परिवर्तन के साथ चार कैंसर कोशिका लाइनों RNAseq कब्जा तकनीक के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया (ABL1 संलयन, रेत संलयन के साथ LC2 साथ, PDGFRalpha फ्यूजन और RT- साथ K562 EOL1 FGFR3 संलयन के साथ 4)। चार नमूने एक साथ जमा और अनुक्रम 100 बीपी 2x के साथ एक डेस्कटॉप sequencer है, जो FASTQ फाइल उत्पन्न पर पढ़ता थे। 1) गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन, 2) मानव transcriptome करने के लिए संरेखण, 3) जीन अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव, 4) संलयन फोन, और 5) संस्करण कॉलिंग: FASTQ फ़ाइलें एक RNAseq विश्लेषण पाइप लाइन है, जो पांच मुख्य घटक शामिल हैं के माध्यम से चलाए जा रहे थे। संरेखण फ़ाइल (बेम) एकल nucleotide वेरिएंट फोन और जीन अभिव्यक्ति की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Fusions ऐसे Tophat फ्यूजन के रूप में फ्यूजन कॉल करने, (अपने स्वयं के संरेखण प्रदर्शन) का उपयोग कर कहा जाता है और उत्पादन usin एनोटेट हैजी फ्यूजन का पता लगाने सॉफ्टवेयर।

RNAseq से जीन अभिव्यक्ति और कब्जा की तुलना करने के लिए 10 से लक्षित टेप के संवर्धन दर्शाता कब्जा विधि (2A चित्रा) का उपयोग कर 1,000 गुना। RNAseq की तुलना में कब्जा का उपयोग कर निशाना बनाया प्रतिलेख क्षेत्रों के लिए मानचित्रण पढ़ता है की इसके अतिरिक्त, चित्रा 2 बी प्रतिशत में वृद्धि का पता चलता है। गुणवत्ता नियंत्रण उपायों का आकलन चित्रा 3 में प्रतिनिधित्व किया है। कब्जा है और RNAseq transcriptome (3 ए, 94% बनाम 93%) के लिए संरेखण के मामले में समान रूप से प्रदर्शन करते हैं और डालने आकार (3 बी, 174 बी पी बनाम 162 बीपी) से मतलब है। कब्जा विधि का प्रयोग, exonic क्षेत्रों में से एक उच्च प्रतिशत अनुक्रम कर रहे हैं (-3 सी, 77% बनाम 60%), और इसके विपरीत intronic क्षेत्रों में से एक प्रतिशत कम अनुक्रम कर रहे हैं (3 डी, 4% बनाम 20%)। नमूना प्रति कुल पढ़ें मायने रखता है 3E में चित्रित कर रहे हैं (3F, 4% बनाम 15%) की तुलना में।

तालिका 1 में दिखाया फ्यूजन का पता लगाने के उत्पादन सामान्यीकृत संलयन समर्थन पढ़ता के साथ उत्पन्न होता है। कब्जा RNAseq सभी चार सेल लाइनों के लिए fusions का पता लगाने में सफल रहा था। एकल nucleotide वेरिएंट को पकड़ने और RNAseq के क्षेत्रों ओवरलैपिंग में कहा जाता है की तुलना में चित्रा 4 में प्रदर्शित किया जाता है। इस पर कब्जा और RNAseq लक्ष्य क्षेत्र के भीतर के बीच वेरिएंट की एक उच्च क़बूल को दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1. RNAseq कैद कदम के योजनाबद्ध। इस प्रयोगात्मक प्रदर्शन में, आरएनए पहले deple हैribosomal शाही सेना के टेड, रासायनिक विखंडन और पूरक डीएनए (सीडीएनए) के संश्लेषण रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके किया। अगले, सीडीएनए polyadenylated और मंच विशेष एडाप्टर के लिए दोनों सिरों पर ligated एक पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। उचित एडाप्टर के साथ केवल सीडीएनए पुस्तकालयों तो पीसीआर से परिलक्षित कर रहे हैं। पुस्तकालय तो कस्टम oligonucleotide जांच के लिए संकरित और चुंबकीय मोती का उपयोग कर कब्जा कर रहे हैं। पर कब्जा कर लिया पुस्तकालय की यह छोटी राशि के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पर्याप्त है करने के लिए एक दूसरी बार परिलक्षित होना चाहिए। कई पुस्तकालयों तो समानांतर में अनुक्रम किया जा सकता है। अनुक्रमण डेटा ऐसे जीन fusions, अभिव्यक्ति या म्यूटेशन के रूप में ब्याज की शाही सेना की घटनाओं के लिए विश्लेषण किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 सीलाख मैप किया पढ़ता (FPKM) (लॉग पैमाने) प्रति kilobase प्रति कब्जा बनाम RNAseq। ए, कैद और चार कैंसर कोशिका लाइनों K562, LC2, EOL1 और आर टी -4 से मापा में RNAseq के बीच जीन अभिव्यक्ति तुलना में लक्षित जीन की omparison पढ़ता है। ब्याज की लक्षित जीन (नीला) समृद्ध कर रहे हैं गैर लक्षित जीन (ग्रे)। बी, के पढ़ता लक्षित क्षेत्र के लिए मानचित्रण चार कैंसर कोशिका लाइनों में बनाम RNAseq पुस्तकालयों कैद में वृद्धि हुई है प्रतिशत की तुलना में। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3. अनुक्रमण मेट्रिक्स चार प्रतिनिधि कैंसर कोशिका लाइनों में कैद RNAseq बनाम की। ए, प्रतिशत की मैपिंग transcriptome को पढ़ता है, सी, का प्रतिशत exonic क्षेत्रों में पढ़ता है। डी, का प्रतिशत intronic क्षेत्रों में पढ़ता है। ई, कुल अनुक्रमण पढ़ता है। एफ, ribosomal शाही सेना को मानचित्रण पढ़ता का प्रतिशत। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

कोशिका की परत विलय पुस्तकालय प्रकार कुल पढ़ता है लक्ष्य पढ़ता है पर सामान्यीकृत फ्यूजन सहायक पुस्तकें (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan टी.आर.उत्तर प्रदेश
K562 बीसीआर-एबीएल RNAseq 150300482 279,438 0 438 0
कब्जा 9341148 7566087 598 343 0
LC2 CCDC6-आरईटी RNAseq 128861790 307,566 0 97 0
कब्जा 12320692 10314284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNAseq 135321406 225,222 0 0 170
कब्जा 9317418 7680818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNAseq 161350024 208,741 0 131 469
कब्जा 8305950 6563574 358 88 34

तालिका 1 कैद K562, LC2, EOL1 और आर टी -4 के RNAseq बनाम लिए फ्यूजन डिटेक्शन। इस तालिका में चार कैंसर कोशिका लाइनों और तीन अलग अलग फ्यूजन का पता लगाने एल्गोरिदम, TopHat2, ChimeraScan, और Trup इस प्रदर्शन में उपयोग प्रदर्शित करता है। इस तालिका को अधिक से अधिक से अधिक 60 लाख RNAseq के लिए उपयोग पढ़ता तुलना में पढ़ता है, कम से कम 10 लाख कुल का उपयोग कर कब्जा के साथ fusions पता लगाने की क्षमता को दर्शाता है। फ्यूजन पढ़ता समर्थन फ्यूजन का समर्थन विभाजित करके गणना की गई पढ़ता काइनेज पढ़ता द्वारा, एक लाख से गुणा किया।

</ HTML"चित्रा 4" src = "/ files / ftp_upload / 54090 / 54090fig4.jpg" />
चित्रा 4. SNV कैद RNAseq बनाम के लिए बुला रही है। ये वेन आरेख एकल nucleotide वेरिएंट (SNVs) की संख्या चार है कि सेल लाइनों में से प्रत्येक के लिए कैद और RNAseq द्वारा पता लगाया गया था (K562, LC2, EOL1 और आर टी -4)। यह लक्षित क्षेत्र के भीतर कैद और RNAseq के बीच SNVs के उच्च क़बूल दिखाता है:। K562 (81.3%), LC2 (78.3%), EOL1 (89.5%) और आर टी -4 (73.9%) का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAseq कैद RNAseq और माइक्रोएरे के बीच मध्यस्थ की रणनीति transcriptome की एक चयनित भाग के मूल्यांकन के लिए दृष्टिकोण है। कैद के फायदे के लिए एक डेस्कटॉप sequencer, उच्च throughput, और जीनोमिक परिवर्तन का पता लगाने पर कम लागत, तेजी से बदलाव समय शामिल है। विधि, गैर-कोडिंग RNAs 23 की विशेषताएँ एकल nucleotide पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता वेरिएंट 4-6, शाही सेना splicing की जांच, और जीन fusions या संरचनात्मक rearrangements 24 की पहचान करने के लिए। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण नैदानिक ​​या प्रसंस्कृत नमूने है कि formalin के साथ नियतन से गुजरा और आयल ब्लॉकों 24,25 में एम्बेडेड है के लिए लागू किया जा सकता है।

वहाँ माइक्रोएरे की तुलना में RNAseq कब्जा के कई महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर, सेंगर अनुक्रमण और डीएनए अनुक्रमण। माइक्रोएरे पार संकरण और गैर विशिष्ट जांच के बंधन के कारण उच्च पृष्ठभूमि द्वारा सीमित है। एल के साथ जीन की मात्राओउ अभिव्यक्ति, पृष्ठभूमि शोर की वजह से प्रतिबंधित है, जबकि अत्यधिक व्यक्त जीन माप संकेत संतृप्ति 1 से प्रभावित हैं। RNAseq कब्जा की तुलना में, वास्तविक समय पीसीआर को पुन: पेश करने के लिए मुश्किल साबित होता है। इसके अतिरिक्त, RNAseq उपन्यास टेप का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, कम शुरुआती इनपुट सामग्री की आवश्यकता है और सेंगर अनुक्रमण के लिए वैकल्पिक splicing 26 .इसके विपरीत पता लगा सकते हैं, RNAseq उच्च throughput और कम व्यक्त miRNA के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। सेंगर अनुक्रमण ज्ञात एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों और दैहिक डीएनए उत्परिवर्तन, हालांकि उपन्यास fusions की पहचान एक प्राथमिकताओं उम्मीदवार ब्रेकप्वाइंट की आवश्यकताओं द्वारा रुकावट है साथ fusions के सत्यापन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हुई है। डीएनए अनुक्रमण लागत प्रभावी नहीं है, डेटा के लिए बड़े भंडारण स्थान की आवश्यकता है, और बाद ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों का पता लगाने के काबिल नहीं है।

वहाँ कई महत्वपूर्ण RNAseq कैद में शामिल कदम उठाए हैं। सबसे पहले, पुस्तकालय से उत्पादों की उपज में सुधार करने के लिएआरएनए / सीडीएनए विशिष्ट समचुंबक माला और washes के दौरान समचुंबक मोती, सतर्क भर में मोती, जो उपज के नुकसान को बढ़ावा मिलेगा सुखाने के लिए नहीं हो। इसके अलावा, ऐसा नहीं तहत सूखी, मोती सुनिश्चित सभी इथेनॉल नमूना ट्यूब से हटा दिया जाता है, इथेनॉल के रूप में सीडीएनए उपज को कम कर सकते हैं। दूसरा, पूरक जांच के साथ सीडीएनए पुस्तकालयों के संकरण लगातार तापमान पर निर्भर है, हम अग्रिम में कम से कम दो घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए वार्मिंग धो बफर मैं और कड़े बफर सलाह देते हैं। इसके अलावा, संकरण के बाद यह बाध्यकारी और धोने के चरणों के दौरान 65 डिग्री सेल्सियस को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। यहां इस्तेमाल जांच kinases, इस तरह के प्रतिलेखन कारक है, और घर में रखते हुए जीन के रूप में आम rearrangements में शामिल जीन सहित दवा के विकास के लिए ब्याज की जीन की एक्सॉनों के लिए डिजाइन किए गए थे। इसके अलावा, जीन सामग्री अनुकूलन है और कब्जा पैनल आकार भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, के रूप में जीनोमिक क्षेत्रों पर नई जानकारी उठता है, अतिरिक्त जांच के लिए बनाया गया है और टी करने के लिए जोड़ा जा सकता हैवह कब्जा पैनल मौजूदा।

संरेखण मेट्रिक्स का मूल्यांकन, विशेष पर लक्ष्य दर, कितनी अच्छी तरह लक्षित क्षेत्र के समृद्ध किया गया था के बारे में जानकारी प्रदान करता है। एक कम पर लक्ष्य दर एक असफल संकरण और कब्जा, जिससे वांछित लक्ष्य क्षेत्र पर कब्जा कर लिया और समृद्ध नहीं था की वजह से हो सकता है। इस मामले में, एक फिर से संकरण और पुस्तकालय सेट का कब्जा किया जाना चाहिए। एक कम पर लक्ष्य की दर भी rRNA व्यय करना विफलता है, जो नमूने में rRNA के प्रतिशत की गणना से इसकी पुष्टि की जा सकती है के कारण हो सकता है। नमूना भीतर उच्च rRNA प्रतिशत नमूना rRNA कमी के साथ शुरुआत की फिर से तैयार करने की जरूरत होगी। इसके अलावा, यदि पुस्तकालय एकाग्रता संकरण और कब्जा करने के लिए आवश्यकताओं को नीचे गिरता है, यह सलाह दी जाती नमूना प्रकार और गुणवत्ता (: 50-1,000 एनजी रेंज) के लिए शुरू इनपुट की राशि का अनुकूलन करने के लिए किया जाएगा।

जबकि वहाँ लक्षित RNAseq अनुप्रयोगों के लिए कई फायदे हैं, वहाँ भी सीमाएं हैंविचार करें। गरीब शाही सेना गुणवत्ता RIN के आधार पर या विखंडन की डिग्री के साथ नमूने अनुक्रमण के लिए गुणवत्ता पुस्तकालयों उपज नहीं हो सकती है। कई समूहों formalin तय आयल एम्बेडेड नमूनों के साथ सफलता का प्रदर्शन किया है, लेकिन वहाँ के नमूने है कि अनुक्रमण 24,25,27 के लिए पारित नहीं होगा रहे हैं। इसके अलावा, के बाद से RNAseq कैद में जाना जाता टेप पर केंद्रित है, यह उपन्यास या unannotated टेप के लिए निष्पक्ष RNAseq के लाभों को खो देता है। इसके अलावा, एसएनपी का पता लगाने के लिए, RNAseq तरीकों ही व्यक्त टेप में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं।

RNAseq कैद की भविष्य के अवसरों अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में शामिल हैं। लंबे समय से गैर-कोडिंग शाही सेना के हजारों और जीव विज्ञान में उनकी भूमिका की हाल की खोज ध्यान केंद्रित लक्षण वर्णन की आवश्यकता होगी। क्लिनिक में, RNAseq कैद अनुसंधान परीक्षण से परे का विस्तार और इस तरह के कैंसर, संक्रामक रोग, और गैर इनवेसिव परीक्षण के रूप में मानव रोग को चिह्नित करने के लिए चिकित्सीय संसाधनों में अनुवाद कर सकते। जीनोमिक अनुक्रमण approa के साथ संयोजन के रूप मेंटांके, RNAseq कैद का अध्ययन करने और व्यक्त जीनोम को चिह्नित करने के लिए एकीकृत किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
  7. Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
  8. Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
  9. Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
  10. Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
  11. Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  14. Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
  15. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  18. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  19. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  20. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
  21. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
  22. Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  23. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  24. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
  25. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  26. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  27. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 114 शाही सेना अनुक्रमण संकरण कब्जा जीन fusions अभिव्यक्ति लक्षित RNAseq
आरएनए अनुक्रमण परख जीन एक्सप्रेशन और जीनोमिक बदलाव विशेषताएँ करने का लक्ष्य
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J.… More

Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter