Abstract
RNA-sekventering (RNAseq) er en alsidig metode, der kan anvendes til at påvise og karakterisere genekspression, mutationer, genfusioner, og ikke-kodende RNA'er. Standard RNAseq kræver 30-100.000.000 sekventering læser og kan omfatte flere RNA produkter såsom mRNA og ikke-kodende RNA. Vi viser, hvordan målrettet RNAseq (capture) tillader en fokuseret undersøgelse af udvalgte RNA produkter ved hjælp af en desktop sequencer. RNAseq capture kan karakterisere fremavlet, lave, eller forbigående udtrykte udskrifter, der ellers blive savnet ved hjælp af traditionelle RNAseq metoder. Her beskriver vi udvinding af RNA fra cellelinier, ribosomalt RNA udtømning, cDNA-syntese, forberedelse af stregkodede biblioteker, hybridisering og opsamling af målrettede transkripter og multiplex-sekventering på en stationær sequencer. Vi skitserer også den beregningsmæssige analyse pipeline, som omfatter kvalitetskontrol vurdering, tilpasning, fusion afsløring, genekspression kvantificering og identifikation af enkelt nucleotide varianter. Dette assay muliggør målrettet transkript sekventering til karakterisering af genekspression, genfusioner, og mutationer.
Protocol
Bemærk: Denne protokol beskriver den samtidige behandling og analyse af fire prøver. Denne metode er kompatibel med RNA isoleret fra celler, frisk frossen væv og formalinfikseret paraffinindlejret væv (FFPE). Denne protokol begynder med 50 - 1000 ng (250 ng anbefales) for at starte RNA input for hver prøve.
1. rRNA Udtømmelse og Opsplitning af RNA Procedure
- rRNA Nedbrydning
- Fjern elueres; prime, fragment mix, rRNA fjernelse mix, rRNA bindingspuffer og resuspensionsbuffer fra -20 ° C og optøning ved stuetemperatur. Fjern elueringsbuffer, rRNA fjernelse perler og RNA / cDNA specifik paramagnetiske perler fra 4 ° C og bringe til stuetemperatur.
- Tilføj 0,25 ug af RNA til PCR-rør. Fortynd det totale RNA med nuclease-frit ultra-rent vand til en samlet slutvolumen på 10 pi. Tilsæt 5 pi rRNA bindende buffer til hvert rør derefter tilføje 5 ul rRNA fjernelse mix og blidt pipette op og ned for at blande. Rørene anbringes i termisk cyklusapparat med låg forvarmet til 100 ° C og program termisk cyklusapparat til 68 ° C i 5 minutter for at denaturere RNA'et.
- Efter RNA denaturering, fjerne rør fra termiske cykler og inkuberes ved stuetemperatur i 1 min. Vortex rRNA fjernelse perle rør kraftigt for at resuspendere perlerne. Tilsættes 35 pi rRNA fjernelse perler til nye rør og overføre RNA denaturering reaktion (20 pi) til rør indeholdende rRNA fjernelse perler.
- Juster pipette til 45 pi og pipette hurtigt op og ned 20x at blande. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 1 min. Placer derefter rør i magnetiske stå ved stuetemperatur i 1 min. Overfør supernatanten til nyligt mærkede PCR-rør og placere disse rør igen i magnetisk stå ved stuetemperatur i 1 min. Dette sikrer, at ingen perler overføres. Overfør supernatanten til nyligt mærkede PCR-rør.
- Vortex RNA / cDNA specifik paramagnetiske perler og tilsæt 99 pi perler til hvert rør. Forsigtigt pipette helelydstyrke op og ned 10x at blande. Hvis man starter med nedbrudt-RNA, tilsættes 193 pi velblandet RNA / cDNA specifikke paramagnetiske perler til hvert rør. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Sæt herefter rør på den magnetiske stå ved stuetemperatur i 5 min. Fjern og kassér supernatanten.
- Tilsæt 200 pi frisk fremstillet 70% ethanol (EtOH). Hold rør på magnetisk stativ og sørge for at ikke forstyrre perlerne. Der inkuberes ved stuetemperatur i 30 sek, derefter fjerne og kassere supernatanten. Tillad rør til at henstå ved stuetemperatur i 5 - 10 min for at tørre.
- Centrifuger optøet stuetemperatur elueringspuffer ved 600 x g i 5 sek. Tilføj 11 pi elueringspuffer til hvert rør og forsigtigt pipetteres op og ned 10x at blande. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 2 min. Rørene anbringes på magnetisk stå ved stuetemperatur i 5 min. Overfør 8,5 ul af supernatanten til nyligt mærkede PCR-rør.
- Opsplitning af rRNA Depleted RNA
- Tilføj 8,5 pi elute, 8,5 pi prime, og 8,5 pi fragment mix til hvert rør. Forsigtigt pipette op og ned 10x at blande. Rørene anbringes i termisk cyklusapparat med følgende program: forvarmet låg til 100 ° C, 94 ° C i 8 minutter, derefter 4 ° C hold.
BEMÆRK: Dette trin er udformet til at generere en gennemsnitlig insert-størrelse på 155 bp. Hvis den gennemsnitlige fragment størrelse af RNA prøve er lavere end 200 bp, springe dette trin og gå videre til First Strand cDNA Synthesis.
- Tilføj 8,5 pi elute, 8,5 pi prime, og 8,5 pi fragment mix til hvert rør. Forsigtigt pipette op og ned 10x at blande. Rørene anbringes i termisk cyklusapparat med følgende program: forvarmet låg til 100 ° C, 94 ° C i 8 minutter, derefter 4 ° C hold.
2. cDNA-syntese
- Syntetisere første streng cDNA
- Fjern første streng syntese mix fra -20 ° C og optøs ved stuetemperatur.
- Forprogrammere termiske cykler med følgende indstillinger: pre-heat låg option og indstillet til 100 ° C, derefter 25 ° C i 10 minutter, 42 ° C i 15 min, 70 ° C i 15 minutter og hold ved 4 ° C . Gem programmet som "Syntetisere 1. Strand."
- Centrifuge optøet-første streng syntese mix rør ved 600 & #215; g i 5 sek. Bland 1 pi revers transkriptase med 9 pi første streng syntese mix.
- Tilsæt 8 pi første streng syntese og revers transkriptase mix til hvert rør, pipettér forsigtigt op og ned 6x at blande. Centrifugerør for 4 sek under anvendelse af en fast hastighed mini bordcentrifuge ved 6,0 xg at bringe væske til bund. Placer rør i den termiske cycler og vælg Syntetisere 1. Strand. Når det termiske cyklusapparat når 4 ° C, fjerne rør og omgående at syntetisere anden streng cDNA.
- Syntetisere anden streng cDNA
- Pre-varme termiske cykler til 16 ° C med låg forvarmet til 30 ° C. Tø anden streng mester mix og resuspension buffer på is. På forhånd fjerne flaske paramagnetiske perler fra 4 ° C og lad stå i mindst 30 minutter for at bringe dem til stuetemperatur.
- Tilsæt 5 pi resuspension buffer, til hvert PCR-rør. Centrifuge anden streng mester mix på 600× g i 5 sek, og der tilsættes 20 ul til hvert PCR-rør. Rørene anbringes i forvarmet termisk cyklusapparat ved 16 ° C i 1 time. Når inkubationen er færdig, fjernes fra termisk cyklusapparat og tillade rør at komme til stuetemperatur.
- Vortex paramagnetiske kugler, indtil de er godt dispergeret. Tilføj 90 pi well-mixed paramagnetiske perler til hvert rør. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x at blande. Inkuber rør ved stuetemperatur i 15 minutter. Rørene anbringes på magnetomrører stå ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Fjern og kassér 135 pi supernatant derefter forlade rør på den magnetiske stativ til at udføre EtOH vask. Tilsæt 200 pi frisk fremstillede 80% EtOH til hvert rør uden at forstyrre perlerne, derefter inkuberes ved stuetemperatur i 30 sek. Fjern og kassér alle af supernatanten fra hver. Gentag for i alt to 80% EtOH vaske.
- Lad rør henstå ved stuetemperatur i 5 - 10 min til tørre på det magnetiske stativ. Centrifugeres optøet rumtemperature resuspensionsbuffer ved 600 x g i 5 sek. Fjern PCR-rør fra magnetisk stativ. Tilføj 17,5 pi resuspension buffer, til hvert PCR-rør og forsigtigt pipetteres hele lydstyrke op og ned 10x for at blande grundigt. Inkuber rørene i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Rørene anbringes på magnetomrører stå ved stuetemperatur i 5 minutter, derefter overføre 15 pi supernatant (dobbeltstrenget cDNA) til 0,2 ml PCR bånd rør.
BEMÆRK: Dette er en sikker standsning punkt som cDNA kan opbevares ved -20 ° C i op til 7 dage.
3. Bibliotek Forberedelse
- Adenylat 3 'enderne
- Fjern A-hale mix fra -20 ° C og optøning ved stuetemperatur. Pre-program den termiske variator med følgende indstillinger: vælg den præ-varme låg option og sat til 100 ° C, derefter indstille ved 37 ° C i 30 min, 70 ° C i 5 min og hold ved 4 ° C. Gem programmet som "ATAIL70."
- Tilføj 2,5 pi resuspensionbuffer til hvert rør. Derefter tilsættes 12,5 pi optøet A-hale mix. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x for at blande grundigt. Anbring glassene i termiske cykler og vælg ATAIL70. Når det termiske cyklus temperatur er ved 4 ° C, fjerne PCR-rørene fra den termiske cykler og omgående at ligere adaptere.
- afsnøre adaptere
- Fjern passende RNA adapter rør, stop ligeringsbuffer og resuspensionsbuffer fra -20 ° C og optøs ved stuetemperatur. Fjern ikke ligation blandingsglasset fra -20 ° C indtil bedt om det i protokollen. Fjern flaske paramagnetiske perler fra 4 ° C og lad stå i mindst 30 minutter for at bringe til stuetemperatur.
- Forvarm den termiske variator til 30 ° C, og vælg den præ-varme låg option og sat til 100 ° C. Centrifuger de optøede RNA adapter rør ved 600 x g i 5 sek. Umiddelbart før brug fjernes ligeringsblandingen røret fra -20 ° Copbevaring.
- Tilføj 2,5 pi resuspension buffer til hvert prøverør. Tilføj 2,5 pi ligeringsblanding. Retur ligeringsblanding rør det til -20 ° C opbevaring umiddelbart efter brug. Tilføj 2,5 pi af den optøede RNA adapter indeks til hvert prøverør. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x for at blande grundigt.
- Centrifugerør for 4 sek ved hjælp af en fast hastighed mini bordplade centrifuge ved 6,0 x g. Rørene anbringes i den forvarmede thermocycler. Luk låget og inkuber ved 30 ° C i 10 minutter.
- Fjern rør fra termiske cykler og tilsættes 5 pi stop-ligering buffer til hvert rør for at inaktivere ligering. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x for at blande grundigt.
- Gentag vask som beskrevet i 2.2.3 - 2.2.4, ved hjælp af 42 pi blandede paramagnetiske perler, og kassere 79,5 pi supernatant. Med de rør på magnetomrører stativ, lad prøver lufttørre ved stuetemperatur i 5 - 10 min.
- Fjern PCR strimler rør framagnetisk stativ og tilsæt 52,5 pi resuspension buffer til hvert rør. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x for at blande grundigt. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 2 minutter. Anbring glassene på magnetomrører standen ved stuetemperatur i 5 minutter, eller indtil væsken er klar. Transfer 50 pi supernatant fra hvert rør til nye 0,2 ml PCR bånd rør. Pas på ikke at forstyrre perlerne.
- Gentag vask som beskrevet i 2.2.3 - 2.2.4, under anvendelse af 50 pi blandede paramagnetiske kugler, og kassere 95 pi supernatant. Med de rør på magnetomrører stativ, lad prøver lufttørre ved stuetemperatur i 5 - 10 min.
- Fjern PCR strimler rør fra den magnetiske stativ og tilsæt 22,5 pi resuspension buffer til hvert rør. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x for at blande grundigt.
- Inkuber rørene ved stuetemperatur i 2 min. Anbring glassene på magnetomrører stå ved stuetemperatur i 5 minutter, eller indtil væsken er klar. Transfer 20 pi supernatant fra hvert rør til ennye 0,2 ml PCR strimmel rør. Pas på ikke at forstyrre perlerne. Dette er en sikker standsning punkt og cDNA kan opbevares ved -20 ° C i op til 7 dage.
4. Bibliotek Amplification
- Berig DNA fragmenter
- Fjern PCR Master Mix, PCR primer cocktail og resuspensionsbuffer fra -20 ° C opbevaring og optøning ved stuetemperatur. Fjern flaske paramagnetiske perler fra 4 ° C opbevaring og lad stå i mindst 30 minutter for at bringe til stuetemperatur.
- Pre-program den termiske variator med følgende indstillinger: vælg den præ-varme låg option og sat til 100 ° C, derefter indstille indledende denaturering ved 98 ° C i 30 sek, 15 cykler af denaturering ved 98 ° C i 10 sek, annealing ved 60 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek, en sidste forlængelsescyklus ved 72 ° C i 5 minutter og hold ved 4 ° C. Gem programmet som "PCR."
- Centrifuger den optøede PCR mestermix og PCR-primere rør ved 600 x g i 5 sek. Tilsæt 5 pi optøede PCR-primere til hvert prøverør. Tilsæt 25 pi optøet PCR Master mix til hvert prøverør. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x for at blande grundigt.
- Placer udjævnede PCR striben rør i den forprogrammerede termiske cykler. Luk låget og køre PCR program. Når PCR er afsluttet, fjernes rørene fra termiske cykler og holde på is.
- Gentag vask som beskrevet i 2.2.3 - 2.2.4, under anvendelse af 50 pi blandede paramagnetiske kugler, og kassere 95 pi supernatant. Med de rør på magnetomrører stativ, lad prøver lufttørre ved stuetemperatur i 5 - 10 min.
- Fjern rør fra den magnetiske stativ og tilsæt 32,5 pi resuspension buffer til hvert prøverør. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 10x for at blande grundigt. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min. Placer PCR-rørene på magnetomrører stå ved stuetemperatur i 5 minutter, eller indtil væsken er klar. Derefter overføre 30 pi supernatant til friske 0,2 ml PCR-rør.
- Udfør kvantificering af cDNA under anvendelse af et fluorometer 7 og bestemme cDNA kvalitet ved anvendelse af et kapillarelektroforesesystem 8.
BEMÆRK: Dette er en sikker standsning punkt og cDNA kan opbevares ved -20 ° C i op til 7 dage. Bemærk: Dette bibliotek betragtes som en RNAseq bibliotek.
Efterfølgende trin fører til en Capture bibliotek.
5. Hybridisering, Capture og sekventering
- multipleksede Hybridisering
- Fjern brugerdefinerede hydratiseret prober, Cot-1-DNA, universelle blokerende oligoer og adaptorspecifikke blokerende oligoer fra -20 ° C og optøs på is.
- I en lav binder 1,5 ml rør, kombinere 500 ng DNA (125 ng per prøve når multiplexing 4 prøver), 5 pi Cot-1 DNA (1 pg / pl), 1UL universelle blokerende oligoer, 0,5 pi p7 (6 nukleotid) adaptorspecifik blokerende oligoer (kan være nødvendigt at justere afhængigt af multiplex conditi dette beløbons) og 0,5 pi p7 (8 nukleotid) adapter specifikke blokerende oligoer (muligvis justeres afhængig multiplex betingelser) dette beløb.
- Prøven anbringes røret i en vakuumkoncentrator med hætte åben overfor den modsatte rotationsretning. Tørstofindhold ved 45 ° C i 20 minutter eller indtil fuldstændig fordampning af væsken.
- Resuspender tørret indhold med 8,5 pi 2x hybridiseringspuffer, 3,4 pi hybridisering komponent A og 1,1 pi nuclease frit vand. Tillad 10 min til resuspension og vortex hver 2,5 min. Overfør resuspenderet-materiale til et 0,2 ml PCR-rør og inkuberes ved 95 ° C i 10 minutter på en thermocycler.
- Fjern hybridisering prøveglas fra termiske cykler, og der tilsættes 2 pi af brugerdefinerede prober resuspenderet ved en koncentration på 1,5 pmol / pl. Alternativt tilsættes 4 pi af brugerdefinerede prober resuspenderet ved en koncentration på 0,75 pmol / pl. Inkuber hybridiseringsreaktion natten over (16 - 24 timer) ved 65 ° C.
BEMÆRK: Probes købt fra forskellige leverandører kan anvendes, og producentens anvisninger skal følges. Varigheden af hybridiseringstrinnet kan også variere.
- Bead Forberedelse og Capture
- Fjern flaske streptavidin-koblede paramagnetiske perler fra 4 ° C og tempereres ved stuetemperatur i 30 min. Fortynd 10x Vask Buffere (I, II, III, og Strenge) og 2.5x Bead Wash Buffer til at skabe 1x arbejdsforhold løsninger.
- Aliquot 140 ul 1X vaskebuffer I ind til et frisk 1,5 ml rør. Heat hele mængden af 1x stringent puffer og alikvot 1X vaskebuffer I ved 65 ° C i en varmeblok i mindst 2 timer.
- Portion 100 pi streptavidin-koblede paramagnetiske perler pr indfangning i et 1,5 ml rør. Sted på magneten og kassér supernatanten. Tilsæt 200 pi bead vaskebuffer pr 100 pi perler og vortex i 10 sek. Sted på magnet til 2 - 5 min, eller indtil supernatanten er klar. Når supernatant er klar, kassere det og retørv gang mere for i alt to vaske.
- Efter fjernelse af perle vaskebuffer, tilsæt lige volumen bead vaskebuffer som indledende startvolumen (dvs. 100 pi for én capture). Resuspender og overføres til en 0,2 ml PCR-rør. Placer røret i den magnetiske stativ til 2 - 5 min, eller indtil supernatanten er klar. Supernatanten kasseres.
- Med både hybridisering prøve og perler i det termiske cyklusapparat ved 65 ° C, overføre hybridiseringsblandingen til perlen røret og pipette op og ned 10x at blande. Inkuberes ved 65 ° C i 45 minutter, vortex og spin ned prøve i 4 sekunder ved anvendelse af en fast hastighed (6,0 x g) bordplade mini-centrifuge.
- Bead Wash
- Fjern capture røret fra termiske cykler, og der tilsættes 100 pi forvarmet 1X vaskebuffer I til glasset og vortex i 10 sek for at blande. Overfør blandingen til en frisk lav binder 1,5 ml rør. Glasset anbringes i et magnetisk separation rack og lad 2 - 5, min for separation eller indtil supernatanten er klar. Discard supernatant.
- Tilsæt 200 pi forvarmet 1x stringent vaskebuffer og pipette op og ned 10 gange for at blande. Inkuberes ved 65 ° C i 5 minutter. Glasset anbringes i den magnetiske separation rack og tillade 2 - 3 i min for separation eller indtil supernatanten er klar. Supernatanten kasseres. Gentag stringent vask en gang mere for i alt to vaske.
- Tilsæt 200 pi stuetemperatur 1X vaskebuffer I og vortex i 2 minutter for at blande. Glasset anbringes i den magnetiske separation rack og tillade 2. - 5. min for separation eller indtil supernatanten er klar. Supernatanten kasseres.
- Tilsæt 200 pi stuetemperatur 1X vaskebuffer II og vortex i 1 min for at blande. Glasset anbringes i den magnetiske separation rack og tillade 2. - 5. min for separation eller indtil supernatanten er klar. Supernatanten kasseres.
- Tilsæt 200 pi stuetemperatur 1X vaskebuffer III og vortex i 30 sekunder for at blande. Glasset anbringes i den magnetiske separation rack tillader 2 - 5, min for separation eller indtil supernatantener klar. Supernatanten kasseres.
- Fjern røret fra den magnetiske separation rack og tilsættes 20 pi nuclease-frit vand for at resuspendere perlerne. Bland grundigt ved pipettering op og ned 10 gange.
- Indlæg Capture PCR-amplifikation
- Fjern paramagnetiske kugler fra 4 ° C og tempereres ved stuetemperatur i 30 min.
- Fjern varm start PCR Ready Mix (2x) og PCR Primer Mix fra -20 ° C og tø ved stuetemperatur, og derefter placere på is. Forbered bibliotek forstærkning Master Mix ved at kombinere 27,5 pi 2x hot start PCR Ready Mix med 2,75 pi PCR Primer 1 og 2,75 pi PCR-primer 2 (disse mængder er for en hybridisering bibliotek plus 10% overskud).
- Opsætning reaktionen i PCR-rør ved tilsætning af 20 pi perler plus fanget DNA med 30 pi bibliotek amplifikation mastermix for et samlet volumen på 50 pi. Cap rør ordentligt og vortex at blande. Centrifugerør for 4 sek ved hjælp af en fast hastighed mini fanele-top centrifuge ved 6,0 x g.
- Opsæt følgende PCR program: vælge den pre-varme låg option og sat til 100 ° C, derefter indstille indledende denaturering ved 98 ° C i 45 sek, 10 - 12 cykler af denaturering ved 98 ° C i 15 sek, annealing ved 65 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 60 sek, en sidste forlængelsescyklus ved 72 ° C i 60 sek og hold ved 4 ° C.
- Fjern prøven fra thermocycler og tilsæt 75 pi paramagnetiske perler. Bland godt og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Rørene anbringes på magnet ved stuetemperatur til 2 - 3 min og derefter fjerne supernatanten. Vask perler på magnet ved tilsætning af 200 pi 80% ethanol, inkubation i 30 sek derefter fjerne supernatant. Gentag for i alt to 80% vaske.
- Inkuber ved stuetemperatur i 5 - 10 minutter for at tillade perlerne tørre. Må ikke over tør for revner. Resuspender perler i 22 pi Tris-EDTA pH 8,0 (1x TE Solution), og tillader 3 min til eluering. Anbring prøven på magnet for 3 - 5 min then overførsel 20 pi elueret produkt til en frisk lav bind 1,5 ml rør, som sikrer ingen perler fremføres.
- Udfør kvantificering af tilfangetagne cDNA hjælp fluorometer 7 og bestemme fanget cDNA kvalitet ved hjælp af en kapillær elektroforese-system 8.
- Desktop Sequencer Loading Procedure 9
- Fortynd fanget cDNA-bibliotek til en endelig koncentration på 4 nM under anvendelse af 10 mM Tris-CI pH 8,5 med 0,1% Tween 20. Optø 10 N NaOH og hybridiseringspuffer på is. Cirka 30 minutter før brug, tø desktop sequencer v2 reagens kit box 1 i RT vand. Fyld ikke over MAX FILL LINE 10. Bemærk venligst at dette er en sekventering platform specifik procedure og kan variere i henhold til producentens anvisninger.
- Forbered 1 ml 0,2 N NaOH ved at kombinere 20 pi 10 N NaOH med 980 pi nuclease frit vand i et mikrocentrifugerør (altid forberede friske). Fortyndes PhiX biblioteket (bibliotek kontrol) til 4 nM vedkombinere 2 pi 10 nM bibliotek kontrol med 3 pi 10 mM Tris-CI pH 8,5 med 0,1% Tween 20.
- Denaturere endelige bibliotek og bibliotek kontrol ved at kombinere 5 pi 4 nM bibliotek med 5 pi af 0,2 N NaOH og vortex kortvarigt at blande. Centrifugerør for 4 sek ved hjælp af en fast hastighed mini table-top centrifuge ved 6,0 x g. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min for at denaturere biblioteker.
- Tilføj 990 pi præ-kølet hybridiseringspuffer til rørene indeholdende 10 pi denaturerede biblioteker. Dette resulterer i en 20 pM bibliotek. Mark det denaturerede 20 pM bibliotek med dato og kan opbevares i op til 3 uger ved -20 ° C.
- Bland 375 pi 20 pM bibliotek kontrol med 225 pi præ-kølet hybridiseringspuffer og fortyndet bibliotek kontrol at resultere i en 12,5 pM bibliotek kontrol. Invert flere gange for at blande opløsningen.
- Kombiner 594 ul denatureret endelige bibliotek med 6 pi 12:05 denatureret bibliotek kontrol og vortex at blande. Indstil den kombinerede Sample bibliotek og bibliotek kontrol til side på is, indtil prøver er klar til at lægge ind i desktop sequencer reagenskassetten.
6. Data Analysis
- Vurdering sekvens Kvalitet
- Beregn kvaliteten af de rå sekvensdata (fastq filer) ved hjælp af sekvens kvalitetsvurdering 11.
BEMÆRK: Dette trin er med til at vurdere data, før de underkastes yderligere nedstrøms analyse. Softwaren kører med indbygget parametre og producerer et sæt af målinger for hver fastq fil.
- Beregn kvaliteten af de rå sekvensdata (fastq filer) ved hjælp af sekvens kvalitetsvurdering 11.
- Justering
- Juster sekvens læser (fastq filer) til henvisningen humane genom hg19 og transkriptom hjælp Tophat2 12 (version 2.0.10) samtidig give kendte udskrifter som GTF-fil. Udgangen er i form af et binært alignment format kaldet BAM filen.
- Udfør procestrin indlæg herunder sortering og indeksering hjælp Samtools 13 (version 0.1.19) På BAM filen. Udfør to eksemplarer mærkning, genbestilling SAM, indsætte beregning størrelse og tilføje eller erstatte læste grupper med Picard værktøjer 14 (version 1,84).
- RNAseq Quality Assessment
- Beregne en serie af kvalitetskontrol målinger for RNAseq data ved hjælp RNAseq kvalitetsvurdering. Input til denne software er en BAM-fil 15 fra Tophat2 tilpasning. Udgangen er en HTML-fil, der viser total læse count, dubletter, kortlagt læst procentdel og rRNA procentdel, etc., blandt andre.
- Variant Calling
- Brug STAR (version 2.4.0) 16 for justering og derefter kalde enkelt nukleotid varianter bruger GATK s (Version 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Følg GATK BAM efterbehandling trin og filtreringskriterier til flag og fjerne falske positiver fra udgangen.
- Gene Expression
- Beregn genekspression USING Manchetknapper software (version 2.1.1) fra Tuxedo suite 18.
BEMÆRK: Indgangen er en BAM-fil fra Tophat2 justering værktøj. Udgangen produceres på isoformen, genet og transcript niveau, hvor ekspression er beregnet som FPKM (Fragmenter pr kilobase pr Million kortlagt Læser).
- Beregn genekspression USING Manchetknapper software (version 2.1.1) fra Tuxedo suite 18.
- Fusion Calling
- Ring til fusioner fra hver prøve ved hjælp ChimeraScan 19 (version 0.4.5), Tophat Fusion 20 skik og trup 21. Anmærke de fusioner for domæner ved hjælp Oncofuse 22 (version 1.0.9b2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk fremhæver vigtige trin i RNAseq Capture er vist i figur 1. Fire kræft cellelinjer med kendte mutationer blev brugt til at demonstrere effektiviteten af RNAseq Capture teknik (K562 med ABL1 fusion, LC2 med RET fusion, EOL1 med PDGFRalpha fusion og RT 4 med FGFR3 fusion). De fire prøver blev samlet sammen og sekventeret med 2x 100 bp læser på en desktop sequencer, som genererer FASTQ filer. FASTQ filer blev kørt gennem en RNAseq analyse pipeline, som omfatter fem hovedkomponenter: 1) kvalitetskontrol vurdering, 2) tilpasning til menneskelig transkriptom, 3) genekspression kvantificering, 4) fusion calling, og 5) variant telekort. Tilpasningen fil (BAM) anvendes til at kalde enkeltnukleotid-varianter og beregne genekspression. Fusioner kaldes hjælp fusion opkaldere, såsom TopHat Fusion (udfører deres egen justering) og output er kommenteret using fusion afsløring software.
Sammenligning af genekspression fra RNAseq og indfangning viser berigelse af målrettede transkripter med 10 til 1.000 gange ved anvendelse af capture-metoden (figur 2A). Derudover Figur 2B viser en stigning i procentdelen af læser mapping til de målrettede transkript regioner ved hjælp capture sammenlignet med RNAseq. Vurdering af kontrolforanstaltninger kvalitet er repræsenteret i figur 3. Optag og RNAseq udføre lige med hensyn til tilpasningen til transkriptomet (3A, 94% vs. 93%) og betyder insert størrelse (3B, 174 bp vs. 162 bp). Brug af capture-metoden, er en højere procentdel af exon regioner sekventeret (3C, 77% vs. 60%), og omvendt en lavere procentdel af intron regioner sekventeret (3D, 4% vs. 20%). Total læste tællinger per prøve er afbildet i 3E (3F, 4% vs. 15%).
Fusion detektionsudgangssignal vist i tabel 1 er genereret med normaliseret fusion understøttende læser. Capture RNAseq lykkedes at opdage fusioner for alle fire cellelinjer. Sammenligning af enkelt nukleotid varianter kaldes i overlappende områder af opsamling og RNAseq vises i figur 4. Dette viser en høj konkordans varianter mellem Capture og RNAseq i målområdet.
Figur 1. Skematisk af RNAseq Capture Steps. I denne eksperimentelle demonstration, RNA er første depleted af ribosomalt RNA, efterfulgt af kemisk fragmentering og syntese af komplementær DNA (cDNA) under anvendelse af revers transkriptase. Dernæst cDNA polyadenyleret og ligeret i begge ender til platform-specifikke adaptere til generering af et bibliotek. Kun cDNA-biblioteker med korrekte adaptere er derefter amplificeret ved PCR. Biblioteker hybridiseres derefter til tilpassede oligonukleotidprober og indfanget under anvendelse af magnetiske perler. Denne lille mængde af indfanget bibliotek skal amplificeres en anden gang for at have nok til næste generation sekventering. Flere biblioteker kan derefter sekventeres parallelt. Sequencing data analyseres for RNA begivenheder af interesse såsom genfusioner, udtryk eller mutationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. CAMMENLIGNING af målrettede gener i Capture versus RNAseq. A, Gen-ekspression sammenligning mellem Capture og RNAseq i fire kræftceller K562, LC2, EOL1 og RT-4 målt ved læser pr kilobase per million kortlagt læser (FPKM) (Log skala). Målrettede gener af interesse er beriget (blå) sammenlignet med ikke-målrettede gener (grå). B, Procentdel af læser kortlægning til målrettet region øges i Capture versus RNAseq biblioteker i fire kræftceller. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Sekventering Metrics af Capture versus RNAseq Four repræsentant kræftceller. A, Procentdel af læser kortlægning til transkriptomet,
| cellelinie | Fusion | Bibliotek type | Total Læser | On Target Læser | Normaliseret Fusion Støtte Læser (NFSR) | ||
| TophatFusion | ChimeraScan | TROP | |||||
| K562 | BCR-ABL | RNAseq | 150.300.482 | 279.438 | 0 | 438 | 0 |
| Fange | 9.341.148 | 7.566.087 | 598 | 343 | 0 | ||
| LC2 | CCDC6-RET | RNAseq | 128.861.790 | 307.566 | 0 | 97 | 0 |
| Fange | 12.320.692 | 10.314.284 | 71 | 44 | 6 | ||
| EOL1 | FIP1L1-PDGFRA | RNAseq | 135.321.406 | 225.222 | 0 | 0 | 170 |
| Fange | 9.317.418 | 7.680.818 | 143 | 0 | 7 | ||
| RT4 | FGFR3 -TACC3 | RNAseq | 161.350.024 | 208.741 | 0 | 131 | 469 |
| Fange | 8.305.950 | 6.563.574 | 358 | 88 | 34 | ||
Tabel 1. Fusion Detection for Capture versus RNAseq af K562, LC2, EOL1 og RT-4. Denne tabel viser fire kræft cellelinjer og tre forskellige fusion afsløring algoritmer, TopHat2, ChimeraScan og trup udnyttes i denne demonstration. Denne tabel viser evnen til at opdage fusioner med Capture bruger mindre end 10 millioner i alt læser i forhold til mere end 60 mio læser udnyttes til RNAseq. Fusion understøttende læser blev beregnet ved at dividere fusion støtte læser ved kinase læser, ganget med en million.
"Figur 4" src = "/ files / ftp_upload / 54.090 / 54090fig4.jpg" />
Figur 4. SNV opfordrer til Capture versus RNAseq. Disse Venn diagrammer viser antallet af Single nukleotid varianter (SNVs), der blev opdaget ved opsamling og RNAseq for hver af de fire cellelinier (K562, LC2, EOL1 og RT-4). Dette illustrerer høj overensstemmelse mellem SNVs mellem Capture og RNAseq inden målrettet-regionen:. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) og RT-4 (73,9%) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNAseq Capture er et mellemprodukt strategi mellem RNAseq og microarray tilgange til evaluering en udvalgt del af transkriptomet. Fordelene ved Capture omfatter reduceret omkostninger, hurtig ekspeditionstid på en desktop sequencer, high throughput, og afsløring af genomiske forandringer. Metoden kan tilpasses til at karakterisere ikke-kodende RNA 23, opdage enkelt nukleotid varianter 4-6, undersøge RNA splejsning, og identificere genfusioner eller strukturelle rearrangementer 24. Endvidere kan denne fremgangsmåde anvendes på kliniske eller forarbejdede prøver, der har gennemgået fiksering med formalin og indlejret i paraffinblokke 24,25.
Der er flere betydelige fordele ved RNAseq capture sammenlignet med microarray, real-time kvantitativ PCR, Sanger-sekventering og DNA-sekventering. Microarray er begrænset af høj baggrund på grund af krydshybridisering og ikke-specifik binding af prober. Kvantificering af gener med low ekspression er begrænset på grund af baggrundsstøj, mens stærkt udtrykt gen målinger har signalmætning 1. Sammenlignet med RNAseq capture, real-time PCR viser sig vanskeligt at reproducere. Derudover RNAseq det muligt at afsløre nye udskrifter, kræver mindre start input materiale og kan detektere alternativ splejsning 26 .I modsætning til Sanger sekventering, RNAseq giver mulighed for højere gennemløb og analyse af lav udtrykte miRNA. Sanger sekventering har vist sig at være et værdifuldt redskab til kontrol af fusioner med kendte exon-exon kryds og somatiske DNA-mutationer, men identifikation af nye fusioner hindres af krav til a priori kandidat breakpoint. DNA-sekventering er ikke omkostningseffektiv, kræver større lagerplads til data, og er ude af stand til påvisning af post-transkriptionelle modifikationer.
Der er flere kritiske trin involveret i RNAseq Capture. For det første at forbedre udbyttet af bibliotekets produkter fraRNA / cDNA specifik paramagnetiske perler og paramagnetiske perler under vask, være forsigtig ikke at over tørre perlerne, hvilket vil føre til tab af udbytte. Også, ikke under-tørre perlerne, sikre al ethanol er fjernet fra prøverør, som ethanol kan reducere cDNA udbytte. For det andet, hybridiseringen af cDNA-biblioteker med komplementære prober er afhængig af konsistent temperatur, vi anbefaler opvarmning vaskebuffer I og Stringent Buffer til 65 ° C i mindst to timer i forvejen. Endvidere efter hybridisering er det vigtigt at opretholde 65 ° C under bindings- og vasketrin. De anvendte prober her blev designet til de exons af gener af interesse for lægemiddeludvikling, herunder kinaser, gener involveret i fælles rearrangementer såsom transkriptionsfaktorer, og Parlamentet holde gener. Desuden gen indhold kan tilpasses og fange panelstørrelser kan variere. Endvidere, som opstår nye oplysninger om genomiske regioner, yderligere sonder kan udformes og tilsat til than eksisterende capture panel.
Evaluering af alignment målinger, specifikt på-target rate, giver oplysninger om, hvor godt den målrettede region blev beriget. En lav on target rate kan skyldes en fejlslagen hybridisering og opsamling, hvorved det ønskede målområde ikke blev taget til fange og beriget. I dette tilfælde skal der udføres en fornyet hybridisering og indfangning af biblioteket sæt. En lav on target rate kan også skyldes manglende nedbryder rRNA, hvilket kan bekræftes ved at beregne procentdelen af rRNA i prøverne. Høj rRNA procent i prøven vil kræve re-forberedelse af prøven begynder med rRNA udtynding. Desuden, hvis biblioteket koncentration falder under kravene til hybridisering og fange, ville det være tilrådeligt at optimere mængden af start input til prøven type og kvalitet (område: 50-1,000 ng).
Mens der er flere fordele for målrettede RNAseq anvendelser findes der også begrænsninger foroverveje. Prøver med dårlig RNA kvalitet baseret på RIN eller graden af fragmentering kan ikke give kvalitet biblioteker for sekvensering. Adskillige grupper har påvist succes med formalinfikserede paraffinindlejrede prøver, men der er prøver, der ikke vil passere til sekventering 24,25,27. Eftersom RNAseq Capture fokuserer på kendte udskrifter, mister fordelene af saglig RNAseq for roman eller fremavlet udskrifter. Hertil kommer, for SNP påvisning, RNAseq metoder kan kun registrere mutationer i udtrykte udskrifter.
Fremtidige muligheder for RNAseq Capture omfatte forskning og kliniske anvendelser. Nylige opdagelse af tusindvis af lange ikke-kodende RNA og deres rolle i biologi vil kræve fokuseret karakterisering. I klinikken, kan RNAseq Capture overskride forskning afprøvning og oversætte til kliniske assays til at karakterisere humane sygdom, såsom cancer, infektionssygdomme, og ikke-invasiv test. I forbindelse med genomisk sekventering approabænke, kan RNAseq Capture integreres til at studere og karakterisere udtrykte genom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits (24 or 96 reactions) | Roche NimbleGen | 05634261001 or 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| Chloroform | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Dry Bath | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
- Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
- Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
- Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
- Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
- Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
- Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
- Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
- Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
- Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
- DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
- Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
- Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
- Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
- Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
- Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
- Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
- Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
- Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).
