Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

Published: August 4, 2016 doi: 10.3791/54090
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, The Ohio State University

Abstract

רצף RNA (RNA-seq) הוא שיטה צדדית שיכול להיות מנוצל כדי לזהות ולאפיין ביטוי גנים, מוטציות, בשילובי גן, RNAs noncoding. תקן RNA-seq דורש 30 - 100 מיליון רצף קורא ויכול לכלול מוצרים RNA מרובות כגון mRNA ו RNAs noncoding. אנו מדגימים כיצד ממוקד RNA-seq (לכיד) מתירה מחקר ממוקד על מוצרי RNA שנבחרו באמצעות ברצף שולחן עבודה. לכידת RNA-seq יכולה לאפיין תמלילים ללא ביאור, נמוכים, או זמני הביעו שאחרת עשויה להחמיץ בשיטות RNA-seq מסורתיות. כאן אנו מתארים את החילוץ של RNA מן שורות תאים, דלדול RNA ריבוזומלי, סינתזת cDNA, הכנת ספריות המינימרקטים, כלת לכידתו של תמלילי ממוקד וסדר זמנית על ברצף שולחן עבודה. אנחנו גם להתוות את צינור ניתוח חישובית, הכולל הערכה בקרת איכות, יישור, זיהוי היתוך, כימות ביטוי גנים וזיהוי nuc יחידגרסאות leotide. assay זה מאפשר רצף תמליל ממוקד לאפיין ביטוי גנים, בשילובי גן, ומוטציות.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מתאר עיבוד בו זמני וניתוח של ארבע דגימות. שיטה זו תואמת RNA שבודד מתאי, רקמות קפואות ורקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין (FFPE). פרוטוקול זה מתחיל עם 50 - 1,000 ננוגרם (250 NG מומלץ) של הפעלת קלט RNA עבור כל דגימה.

1. rRNA דלדול ופיצול של RNA נוהל

  1. rRNA אזילה
    1. הסר elute, הממשלה, שילוב שבר, תערובת הסרת rRNA, חיץ rRNA מחייב חיץ resuspension מ -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת החדר. הסר חוצץ elution, חרוזים הסרת rRNA ו- RNA / cDNA חרוזים פאראמגנטיים ספציפיים מתוך 4 ° C ומביאים לטמפרטורת החדר.
    2. להוסיף 0.25 מיקרוגרם של RNA כדי צינור PCR. לדלל את RNA המוחלט עם nuclease ללא מים טהורים לנפח סופי בסך הכל 10 μl. הוסף 5 μl של חיץ מחייב rRNA על צינור אחד ולאחר מכן להוסיף 5 μl של תמהיל rRNA הרחקה בעדינות pipettדואר מעלה ומטה כדי לערבב. המקום צינורות ב Cycler תרמית עם מכסה מחומם מראש ל -100 מעלות צלזיוס, Cycler תוכנית תרמית ל -68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל את הרנ"א.
    3. לאחר denaturation RNA, להסיר צנורות Cycler תרמי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. צינור הסרת חרוז וורטקס rRNA נמרצות כדי resuspend את החרוזים. להוסיף 35 μl של חרוזי הסרת rRNA צינורות חדשים ולהעביר את תגובת denaturation RNA (20 μl) לצינורות המכילים חרוזי הסרת rRNA.
    4. התאם פיפטה 45 μl ו פיפטה במהירות מעלה ומטה 20x לערבב. דגירה צינורות ב RT עבור 1 דקות. אז במקום צינורות לעמוד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. העברת supernatant צינורות PCR שכותרתו החדש ומניחים צינורות אלה שוב לעמוד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. הדבר מבטיח כי אין חרוזים מועברים. העברת supernatant צינורות PCR שכותרתו חדשה.
    5. RNA וורטקס / חרוזים פאראמגנטיים ספציפיים cDNA ולהוסיף 99 μl של חרוזים על צינור אחד. כל פיפטה בעדינותעד נפח ולמטה 10x לערבב. אם מתחילים עם-RNA מושפל, להוסיף 193 μl של חרוזים פאראמגנטיים RNA / cDNA ספציפיים מוּרבָּך על צינור אחד. לדגור על RT במשך 15 דקות. אז במקום צינורות על מעמד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. סר וזורק supernatants.
    6. הוסף 200 μl של אתנול 70% מוכנים טרי (EtOH). שמור צינורות על מעמד מגנטי ולדאוג לא להפריע את החרוזים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר ולסלק supernatant. אפשר צינורות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות לייבוש.
    7. צנטריפוגה מופשר חיץ הטמפרטורה elution חדר בבית גרם 600 × במשך 5 שניות. להוסיף 11 μl של חיץ elution לצינור כל פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x לערבב. דגירת צינורות ב RT במשך 2 דקות. מניחים צינורות על מעמד מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. העבר 8.5 μl של supernatant לצינורות PCR שכותרתו החדש.
  2. פיצול של rRNA המדולדל RNA
    1. להוסיף 8.5 μl אליוטה, 8.5 ממשלה μl, ו -8.5 תמהיל שבר μl על צינור אחד. פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x לערבב. מקום צינורות ב Cycler תרמית עם התכנית הבאה: מכסה מחומם מראש ל -100 מעלות צלזיוס, 94 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, ולאחר מכן חזק 4 ° C..
      הערה: צעד זה נועד ליצור גודל כנס ממוצע של 155 נ"ב. אם גודל שבר ממוצע של מדגם RNA נמוך מ -200 נ"ב, לדלג על שלב זה והמשך סטרנד ראשון cDNA סינתזה.

2. סינתזה cDNA

  1. לסנתז סטרנד ראשון cDNA
    1. סור תערובת סינתזת הגדיל ראשונה מ C -20 ° להפשיר בטמפרטורת חדר.
    2. לתכנת מראש את Cycler התרמית עם ההגדרות הבאות: אפשרות מכסה מראש מאש ומניח ל -100 מעלות צלזיוס, אז 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 42 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וחזקות ב 4 ° C . שמור תוכנית זו כמו "לסנתז -1 סטרנד."
    3. צנטריפוגה גדיל צינור לערבב סינתזה מופשרת ואחת ב 600 & #215; גרם במשך 5 שניות. מערבבים 1 μl הפוכה transcriptase עם 9 μl של תמהיל סינתזת הגדיל הראשון.
    4. הוסף 8 μl של סינתזת הגדיל הראשונה הפוך תמהיל transcriptase על צינור אחד, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 6x לערבב. צנטריפוגה צינורות במשך 4 שניות באמצעות צנטריפוגות שולחן מיני קבוע מהירות 6.0 XG כדי להביא נוזל למטה. מניחים צינורות Cycler התרמית ובחר לסנתז 1 Strand st. כאשר Cycler תרמית מגיע 4 ° C, להסיר צינורות פנה מיד לסנתז השנייה סטרנד cDNA.
  2. לסנתז השנייה סטרנד cDNA
    1. Cycler תרמית טרום החום ל -16 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם מראש ל 30 מעלות צלזיוס. מיקס מאסטר שני גדיל הפשרת חיץ מחדש השעיה על קרח. מראש, להסיר את הבקבוק של חרוזים פאראמגנטיים מ 4 ° C ולתת לעמוד במשך 30 דקות לפחות להביא אותם לטמפרטורת החדר.
    2. הוסף 5 μl של חיץ resuspension על צינור אחד PCR. שילוב ההורים שני גדיל צנטריפוגה ב 600× גרם במשך 5 שניות ומוסיפים 20 μl על צינור אחד PCR. מקום צינורות ב Cycler תרמית מחוממת מראש על 16 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. כאשר הדגירה תושלם, להסיר Cycler תרמית ולאפשר צינורות להגיע לטמפרטורת החדר.
    3. וורטקס החרוזים פאראמגנטיים עד שהם מפוזרים היטב. להוסיף 90 μl של חרוזים פאראמגנטיים מוּרבָּך על צינור אחד. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב. דגירה צינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. צינורות מקום על דוכן מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. סר וזורק 135 μl של supernatant ואז לעזוב צינורות על המעמד המגנטי לבצע לשטוף EtOH. הוסף 200 μl מוכן טרי 80% EtOH על צינור אחד מבלי להפריע את החרוזים, ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. סר וזורק את כל supernatant מכל אחת מהן. חזור עבור סכום כולל של שני שוטף 80% EtOH.
    5. בואו צינורות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות לייבוש על מעמד מגנטי. צנטריפוגה טמפרטורה בחדר המופשרתדואר חיץ resuspension ב g 600 × במשך 5 שניות. הסר צינורות PCR מן לעמוד מגנטי. להוסיף 17.5 חיץ resuspension μl על צינור אחד PCR בעדינות פיפטה כל נפח מעלה ומטה 10x לערבב ביסודיות. דגירה צינורות עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. צינורות מקום על הדוכן המגנטי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר 15 supernatant μl (גדילים כפולים cDNA) ל -0.2 מיליליטר צינורות רצועת PCR.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה כמו cDNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים.

3. הכנת הספרייה

  1. קצוות "Adenylate 3
    1. הסר A-עוקב מיקס -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת החדר. לתכנת מראש את Cycler תרמית עם ההגדרות הבאות: בחר באפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחזק על 4 מעלות צלזיוס. שמור תוכנית זו כמו "ATAIL70."
    2. להוסיף 2.5 μl של resuspensionחיץ על צינור אחד. לאחר מכן להוסיף 12.5 μl של תמהיל A-עוקב מופשר. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות. מניחים את צינורות Cycler התרמית ובחר ATAIL70. כשהטמפרטורה Cycler התרמית היא ב 4 ° C, להסיר את צינורות PCR מן Cycler תרמי פנה מייד ולקשור מתאמים.
  2. מתאמים ולקשור
    1. הסר צינורות מתאם RNA מתאימים, להפסיק חיץ קשירת חיץ resuspension מ -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת חדר. אין להסיר את הצינור לערבב קשירה מ -20 ° C עד שיתבקש לעשות זאת בפרוטוקול. הסר את בקבוק חרוזים פאראמגנטיים מ 4 ° C ולתת לעמוד במשך לפחות 30 דקות כדי להביא לטמפרטורת החדר.
    2. טרום לחמם את Cycler תרמית עד 30 ° C ובחר באפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה צינורות מתאם RNA מופשר ב 600 גרם × במשך 5 שניות. מייד לפני השימוש, להסיר את הצינור לערבב קשירה מ -20 ° Cאִחסוּן.
    3. להוסיף 2.5 μl של חיץ resuspension על צינור אחד מדגם. להוסיף 2.5 μl של תמהיל קשירה. החזר את צינור תמהיל קשירת עד -20 ° C אחסון מיד לאחר השימוש. להוסיף 2.5 μl של מדד מתאם RNA מופשר על צינור אחד מדגם. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    4. צינורות צנטריפוגה במשך 4 שניות באמצעות צנטריפוגות שולחן מיני קבוע מהירות 6.0 x גרם. צינורות מקום Cycler התרמית מחומם מראש. סגור את המכסה לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    5. הסר צינורות מ Cycler התרמי להוסיף 5 μl של חיץ קשירת תחנה על צינור אחד כדי להשבית את הקשירה. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    6. חזור על לשטוף כמתואר 2.2.3 - 2.2.4, באמצעות 42 μl של חרוזים פאראמגנטיים מעורבים, השלכת 79.5 supernatant μl. עם הצינורות על מעמד מגנטי, ולתת אוויר יבש דגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות.
    7. הסר את צינורות רצועת PCR מןמעמד מגנטי ולהוסיף חיץ resuspension 52.5 μl על צינור אחד. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות. דגירה צינורות בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. מניח את הצינורות על המעמד המגנטי ב RT במשך 5 דקות או עד שהנוזלים ברורים. העברת 50 μl של supernatant מהצינור כל 0.2 חדש מ"ל צינורות PCR רצועה. יש להיזהר שלא להפריע את החרוזים.
    8. חזור על לשטוף כמתואר 2.2.3 - 2.2.4, באמצעות 50 μl של חרוזי פאראמגנטיים מעורבים, ולהשאיר 95 supernatant μl. עם הצינורות על מעמד מגנטי, ולתת אוויר יבש דגימות ב RT במשך 5 - 10 דק '.
    9. הסר את צינורות רצועת PCR מהדוכן המגנטי ולהוסיף חיץ resuspension 22.5 μl על צינור אחד. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    10. דגירת הצינורות ב RT במשך 2 דקות. מניח את הצינורות על המעמד המגנטי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות או עד שהנוזלים ברורים. העברתי 20 μl supernatant מצינור כל עלצינור 0.2 מ"ל PCR רצועה חדשה. יש להיזהר שלא להפריע את החרוזים. זוהי נקודת עצירה בטוחה ניתן לאחסן cDNA ב -20 ° C עד 7 ימים.

4. הגברת הספרייה

  1. עשר DNA שברי
    1. הסר את תערובת מאסטר PCR, קוקטייל פריימר PCR ו חיץ resuspension מהאחסון -20 ° C ו להפשיר בטמפרטורת החדר. הסר את בקבוק חרוזים פאראמגנטיים מהאחסון 4 ° C ולתת לעמוד במשך לפחות 30 דקות כדי להביא לטמפרטורת החדר.
    2. לתכנת מראש את Cycler תרמית עם ההגדרות הבאות: בחר באפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קבע denaturation הראשונית ב 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 15 מחזורים של denaturation על 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, חישול ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וסיומת ב 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, מחזור הארכה אחת אחרון ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחזיקו על 4 מעלות צלזיוס. שמור תוכנית זו כמו "PCR."
    3. צנטריפוגה מאסטר PCR מופשרלערבב פריימרים PCR צינורות ב g 600 × במשך 5 שניות. הוסף 5 μl של פריימרים PCR מופשר על צינור אחד מדגם. הוסף 25 μl של תמהיל מאסטר PCR מופשר על צינור אחד מדגם. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות.
    4. מניח את צינורות PCR רצועת כתרי Cycler התרמית המתוכנתת מראש. סגור את המכסה ולהפעיל תוכנית ה- PCR. כאשר PCR יושלם, להסיר צנורות Cycler תרמית ולשמור על קרח.
    5. חזור על לשטוף כמתואר 2.2.3 - 2.2.4, באמצעות 50 μl של חרוזי פאראמגנטיים מעורבים, ולהשאיר 95 supernatant μl. עם הצינורות על מעמד מגנטי, ולתת אוויר יבש דגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות.
    6. הסר צינורות מהדוכן המגנטי ולהוסיף חיץ resuspension 32.5 μl על צינור אחד מדגם. בעדינות פיפטה את הווליום כולו ולמטה 10x לערבב ביסודיות. לדגור על RT במשך 2 דקות. מניח את צינורות PCR על המעמד המגנטי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות או עד שהנוזלים ברורים. ואז להעביר 30 μl supernatant צינורות 0.2 מ"ל PCR טריים.
    7. בצע כימות של cDNA באמצעות fluorometer 7 ולקבוע איכות cDNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימי 8.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה cDNA יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים. הערה: ספרייה זו נחשבת ספריית RNA-seq.
      צעדים לאחר להוביל ספרייה לכידה.

5. הכלאה, לכידת סידור

  1. כלת multiplexed
    1. סר מנהג בדיקות hydrated, DNA מיטת-1, oligos חסימה אוניוורסלי, oligos חסימת ספציפיים מתאם מ -20 ° C ו להפשיר על קרח.
    2. בתוך צינור מ"ל נמוך לאגד 1.5, לשלב 500 DNA ng (125 ng לדגימה כאשר דגימות ריבוב 4), 5 μl DNA מיטת-1 (1 מיקרוגרם / μl), oligos חסימת אוניברסלי 1ul, 0.5 μl P7 (6 נוקליאוטידים) מתאם ספציפי חסימת oligos (סכום זה עשוי צריך להיות מותאם בהתאם conditi זמניתons) ו -0.5 μl P7 (8 נוקלאוטיד) מתאם oligos ספציפי חסימה (סכום זה עשוי צריך להיות מותאם בהתאם לתנאי זמני).
    3. מניחים את הצינור מדגם בתוך concentrator ואקום עם פתוח כובע פונה לכיוון ההפוך של הסיבוב. תוכן יבש ב 45 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות או עד אידוי מוחלט של נוזל.
    4. Resuspend תוכן יבשים עם חיץ הכלאה 8.5 μl 2x, 3.4 רכיב הכלאה μl ו -1.1 מים חינם μl nuclease. אפשר 10 דקות עבור resuspension מערבולת כל 2.5 דקות. העבר-החומר המושהה לצינור 0.2 מ"ל PCR לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על Cycler תרמית.
    5. סור צינור מדגם הכלאה בין Cycler תרמית ולהוסיף 2 μl של בדיקות מותאמות אישית resuspended בריכוז של 1.5 pmol / μl. לחלופין, להוסיף 4 μl של בדיקות מותאמות אישית resuspended בריכוז של 0.75 pmol / μl. הכלאת דגירת תגובת הלילה (16 - 24 שעות) על 65 מעלות צלזיוס.
      הערה: Probeים שנרכש מיצרנים שונים עשוי לשמש הוראות היצרן צריכות להיות אחריו. משך שלב הכלאה עשוי להשתנות גם.
  2. הכנת חרוז ו ללכוד
    1. הסר בקבוק חרוזים פאראמגנטיים מצמידים streptavidin מ -4 ° C לאזן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לדלל 10x לשטוף חוצצים (I, II, III, ומחמירים) ו 2.5x חרוז הצפת לשטוף ליצור פתרונות עבודה 1x.
    2. Aliquot 140 μl של חיץ לשטוף 1x לי לתוך צינור 1.5 מיליליטר טרי. כמות חום כולו של חיץ aliquot מחמיר 1x של חיץ לשטוף 1x אני על 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום במשך שעה לפחות 2.
    3. Aliquot 100 μl של חרוזים פאראמגנטיים מצמידים streptavidin לכל ללכוד לתוך צינור 1.5 מ"ל. מניחים על מגנט וזורקים supernatant. הוסף 200 μl לשטוף חרוז חיץ לכל 100 חרוזים μl ו מערבולת למשך 10 שניות. מניחים על אבן שואבת 2 - 5 דקות או עד supernatant ברור. לאחר supernatant ברור, וזורקים אותו מחדשכבול פעם נוספת עבור סכום כולל של שני שוטף.
    4. לאחר הסרת חיץ לשטוף חרוז, להוסיף למאגר לשטוף חרוז נפח שווה כמו נפח התחלה ראשוני (כלומר, 100 μl עבור לכידה אחד). Resuspend והעברת צינור 0.2 מ"ל PCR. מניח צינורית מתל מגנטי 2 - 5 דקות או עד supernatant ברור. supernatant מחק.
    5. בשני מדגם ההכלאה וחרוזי Cycler התרמית על 65 מעלות צלזיוס, להעביר את תערובת ההכלאה אל הצינור החרוז ומעלה פיפטה ולמטה 10x לערבב. לדגור על 65 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, מערבולת ספין למטה מדגם עבור 4 שניות באמצעות מהירות קבועה (6.0 XG) צנטריפוגות מינית בטבלה העליונה.
  3. חרוז Wash
    1. הסר צינור ללכוד מ Cycler תרמית ולהוסיף 100 μl מחומם מראש הצפת 1x לשטוף לי אל הצינור מערבולת במשך 10 שניות כדי לערבב. מעביר את תערובת צינור מיליליטר נמוך לאגד טרי 1.5. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי ולאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. Dsupernatant iscard.
    2. הוספת 200 חיץ לשטוף מחמירים 1x שחומם מראש μl ו פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי ולאפשר 2 - 3 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. supernatant מחק. חזור על לשטוף מחמירים פעם נוספת עבור סכום כולל של שני שוטף.
    3. הוספת 200 1x הטמפרטורה μl חדר לשטוף חיץ לי מערבולת למשך 2 דקות לערבב. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי המאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. supernatant מחק.
    4. הוסף 200 μl 1x בטמפרטורת החדר לשטוף חיץ II ו מערבולת דקות 1. לערבב. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי המאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatant ברור. supernatant מחק.
    5. הוסף 200 μl 1x בטמפרטורת החדר לשטוף חיץ III ו מערבולת למשך 30 שניות כדי לערבב. מניחים את הצינור במעמד הפרדה מגנטי המאפשר 2 - 5 דקות להפרדה או עד supernatantברור. supernatant מחק.
    6. הסר את הצינור ממדף הפרדה המגנטי ולהוסיף 20 μl מי nuclease ללא resuspend את החרוזים. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים.
  4. לכידת הודעת הגברת PCR
    1. הסר חרוזים פאראמגנטיים מ -4 ° C לאזן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. הסר תחילת PCR חם מוכן מערבבים (2x) ו- PCR פריימר Mix מ -20 ° C ו להפשיר ב RT ואז מניחים על קרח. הכן מיקס מאסטר הגברה הספרייה על ידי שילוב 27.5 μl של תערובת מוכנה PCR להתחיל חם 2x עם 2.75 μl של ה- PCR פריימר 1 ו 2.75 μl של פריימר PCR 2 (כרכים אלה הם עבור 1 הספרייה הכלאה פלוס 10 עודף%).
    3. הגדרת התגובה בצינור PCR על ידי הוספת 20 μl של חרוזים בתוספת DNA שנתפס עם 30 μl של תמהיל מאסטר הגברת ספרייה עבור בנפח כולל של 50 μl. צינור שווי כראוי מערבולת לערבב. צינורות צנטריפוגה במשך 4 שניות באמצעות כרטיסייה מינית מהירות קבועהle-top צנטריפוגות ב 6.0 x גרם.
      1. הגדר את תוכנית ה- PCR הבאה: לבחור את האפשרות המכסה מראש מהאש ומניחים ל -100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קבע denaturation הראשונית ב 98 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 10 - 12 מחזורים של denaturation על 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות רחבה על 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, מחזור הארכה אחת אחרון ב 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות וחזקות על 4 מעלות צלזיוס.
    4. הסר מדגם מן thermocycler ולהוסיף 75 חרוזים פאראמגנטיים μl. מערבבים היטב לדגור על RT במשך 15 דקות.
    5. מניחים צינורות על מגנט בטמפרטורת החדר למשך 2 - 3 דקות ולאחר מכן להסיר supernatant. לשטוף חרוזים על מגנט על ידי הוספת אתנול 200 μl 80%, דוגרת במשך 30 שניות ולאחר מכן הסרת supernatant. חזור עבור סכום כולל של שני שוטף 80%.
    6. לדגור על RT במשך 5 - 10 דקות, כדי לאפשר חרוזים להתייבש. אל על יבש פיצוח. חרוזים Resuspend ב 22 μl של טריס-EDTA pH 8.0 (פתרון TE 1x) ולאפשר 3 דקות עבור elution. מניחים דגימה על שואבת 3 - ה 5 דקותen העביר 20 μl של מוצר eluted לצינור מיליליטר נמוך לאגד טרי 1.5, להבטיח שום חרוזים מתבצעים מעל.
    7. בצע כימות של cDNA שנתפסו באמצעות fluorometer 7 ולקבוע איכות cDNA שנתפסו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימי 8.
  5. הליך טוען ברצף שולחן 9
    1. לדלל ספריית cDNA שנתפסו לריכוז סופי של 4 ננומטר באמצעות 10 מ"מ טריס-Cl-pH 8.5 עם 0.1% Tween 20. ההפשרה 10 N NaOH חיץ הכלאה על הקרח. כ -30 דקות לפני השימוש, להפשיר תיבת ערכת מגיב v2 ברצף העבודה 1 במים RT. אין למלא מעל המילוי המרבי LINE 10. שימו לב שמדובר בהליך פלטפורמה ספציפית רצף ועשוי להשתנות לפי הוראות היצרן.
    2. הכן 1ml של 0.2 N NaOH ידי שילוב 20 μl 10 N NaOH עם 980 מים חינם nuclease μl בצינור microcentrifuge (תמיד להכין טרי). לדלל את ספריית PhiX (שליטת ספרייה) עד 4 ננומטר ידישילוב של 2 μl שליטת ספריית 10 ננומטר עם 3 μl 10mm טריס-Cl-pH 8.5 עם 0.1% Tween 20.
    3. לפגל ספרייה סופית ושליטת ספרייה ידי שילוב 5 μl של ספריית 4nM עם 5 μl של 0.2 N NaOH ו מערבולת בקצרה לערבב. צינורות צנטריפוגה במשך 4 שניות באמצעות צנטריפוגות בטבלה העליונה מיני מהירות קבועה 6.0 x גרם. לדגור על RT במשך 5 דקות כדי לפגל ספריות.
    4. להוסיף 990 μl של חיץ הכלאה מראש צונן אל הצינורות המכילים 10 μl של ספריות מפוגלות. התוצאה היא ספריית 20 PM. סמן את ספריית 20 PM המפוגל עם התאריך ניתן לאחסן עד 3 שבועות ב -20 ° C.
    5. מערבב 375 μl של 20 PM מלא ספרייה עם 225 μl של חיץ הכלאה מראש צונן ובקרת ספרייה מדוללת לגרום פקד 12.5 pm ספרייה. היפוך מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון.
    6. מערבב 594 μl של ספרייה סופית מפוגלת עם 6 μl שליטת ספרייה מפוגלת 12.5 בערב, המערבולת לערבב. הגדר את samp בשילובle ספרייה ובקר ספרייה בצד על קרח עד דגימות מוכנות לטעון לתוך המחסנית מגיב ברצף שולחן עבודה.

6. ניתוח נתונים

  1. להערכת איכות רצף
    1. חשב את איכות נתוני רצף הגלם (קבצי fastq) באמצעות הערכת איכות רצף 11.
      הערה: פעולה זו מסייעת להעריך את הנתונים שלפניו הוא נתון מעבר לניתוח במורד הזרם. התוכנה פועלת עם פרמטרים המובנית ומייצרת סט של ערכים לכל קובץ fastq.
  2. יישור
    1. יישר רצף קורא (קבצים fastq) אל hg19 ו transcriptome הגנום האנושי התייחסות באמצעות 12 Tophat2 (גרסה 2.0.10) תוך מתן תמלילי ידוע כקובץ GTF. הפלט הוא בצורת תבנית יישור בינארי בשם הקובץ BAM.
    2. בצע שלבים עיבוד פוסט כולל מיון ויצירת אינדקס באמצעות Samtools 13 (גרסה 0.1.19) על קובץ BAM. בצע כפול סימון, סידור מחדש SAM, הכנס חישוב גודל הוספה או החלפה של קבוצות קריאה באמצעות כלים פיקארד 14 (גרסה 1.84).
  3. להערכת איכות RNA-seq
    1. לחשב סדרה של מדדי בקרת איכות עבור נתוני RNA-seq באמצעות הערכת איכות RNA-seq. קלט תוכנה זו הוא קובץ BAM 15 מן יישור Tophat2. הפלט הוא קובץ HTML המפרט ספירה לקריאה כוללת, כפילויות, ממופה לקרוא אחוז ואחוז rRNA, וכו ', בין יתר.
  4. שיחות Variant
    1. השתמש STAR (גרסה 2.4.0) 16 ליישור ואז להתקשר נוקלאוטיד בודד וריאנטים באמצעות של GATK (גרסה 3.3-0) HaplotypeCaller 17 צעדים .Follow GATK BAM שלאחר עיבוד קריטריונים לסינון לסמן ולהסיר תוצאות חיוביות שגויות מהפלט.
  5. ביטוי גנים
    1. חישוב usi ביטוי גניםng חפתים התוכנה (גירסה 2.1.1) מתוך הסוויטה טוקסידו 18.
      הערה: הקלט הוא קובץ BAM מ כלי יישור Tophat2. התפוקה מופקת על איזופורם, רמת הגן והתעתיקים, שבו הביטוי מחושב FPKM (שברים לכל kilobase למיליון ממופי כניסות).
  6. שיחות Fusion
    1. התקשר בשילובים מכל מדגם באמצעות ChimeraScan 19 (גרסה 0.4.5), Tophat Fusion 20 מותאמים אישית TRUP 21. ויסמנו את בשילובים לדומיינים באמצעות Oncofuse 22 (1.0.9b2 גרסה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צעדים מפתח סכמטי הדגשת ב לכידת RNA-seq מוצג באיור 1. ארבע שורות תאי סרטן עם מוטציות ידועות שימשו כדי להדגים את האפקטיביות של טכניקה לכידת RNA-seq (K562 עם פיוז'ן ABL1, LC2 עם פיוז'ן RET, EOL1 עם פיוז'ן PDGFRalpha ו RT- 4 עם פיוז'ן FGFR3). ארבע הדוגמאות היו נקווה יחד להפיק ולרצף עם 2x 100 נ"ב קורא על ברצף שולחן העבודה, אשר מייצר קבצי FASTQ. קבצי FASTQ נוהלו באמצעות צינור ניתוח RNA-seq, הכולל חמישה מרכיבים עיקריים: 1) הערכת בקרת איכות, 2) יישור transcriptome האנושי, 3) כימות ביטוי גנים, 4) קוראים היתוך, ו -5) קוראים גרסה. קובץ יישור (BAM) הוא נהג לכנות גרסאות נוקלאוטיד בודד ולחשב ביטוי גנים. Fusions נקרא באמצעות מתקשרי היתוך, כגון פיוז'ן TopHat (ביצוע היישור שלהם) ואת התפוקה היא מבואר usinבתוכנת איתור ההיתוך גרם.

השוואה של ביטוי גנים מ RNA-seq ולכידה מדגימה העשרה של תמלילי ממוקד ב -10 עד 1,000 פי בשיטה הלכידה (איור 2 א). בנוסף, איור 2B מראה עליית האחוז קורא מיפוי אזורי התמליל הממוקד באמצעות לכידה לעומת RNA-seq. הערכת אמצעי בקרת איכות מיוצגת באיור 3. לכידת RNA-seq לבצע לא פחות מבחינת יישור אל transcriptome (3A, 94% לעומת 93%) ולהתכוון גודל להוסיף (3B, 174 נ"ב לעומת 162 נ"ב). באמצעות השיטה ללכוד, אחוז גבוה יותר של אזורי exonic הוא רצף (3C, 77% לעומת 60%), ומנגד שיעור נמוך יותר של אזורי רצפי האינטרונים הם רצף (3D, 4% לעומת 20%). ספירה לקריאה סה"כ לדגימה מתוארת 3E (3F, 4% לעומת 15%).

פלט זיהוי Fusion שניתן לראות בטבלה 1 מופק עם היתוך מנורמל לתמוך קורא. לכידת RNA-seq היה מוצלח באיתור התכה עבור כל שורות התאים הארבע. השוואת גרסאות נוקלאוטיד יחיד בשם חופפות אזורים של לכידת RNA-seq מוצג באיור 4. זה מדגים הקונקורדנציה גבוה של גרסאות בין לכידת RNA-seq בתוך אזור היעד.

איור 1
איור 1. סכמטי של שלבים לכידת RNA-seq. בהפגנה זו ניסיוני, RNA הוא הראשון depleטד של RNA ריבוזומלי, ואחריו קיטוע סינתזה כימית של דנ"א משלים (cDNA) באמצעות reverse transcriptase. בשלב הבא, cDNA הוא polyadenylated ו ligated בשני הקצוות למתאמי-פלטפורמה ספציפית כדי ליצור ספריה. רק ספריות cDNA עם מתאמים נכונים הם מוגברים לאחר מכן על ידי PCR. ספריות אז הם הכלאה כדי בדיקות oligonucleotide אישית שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים. כמות קטנה זו של ספריית בשבי חייבת להיות מוגברת בשנית שיהיה מספיק עבור סידור הדור הבא. ספריות מרובות יכולות להיות רצף ואז במקביל. נתוני רצף מנותחים לאירועי RNA של עניין כגון תערובות גנים, ביטוי או מוטציות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. Comparison של גנים ממוקדים לכיד לעומת RNA-seq. A, השוואת ביטוי גנים בין לכידת RNA-seq בארבע שורות תאי סרטן K562, LC2, EOL1 ו RT-4 נמדדו על ידי קורא לכל kilobase למ' ממופה קורא (FPKM) (בסולם התחבר). גנים ממוקדים עניין מועשרים (כחולים) לעומת גנים הלא ממוקד (אפור). B, האחוז קורא מיפוי האזור מוגבר לכיד לעומת ספריות RNA-seq בארבע שורות תאי הסרטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3
איור 3. מדדי רצף של לכידה לעומת RNA-seq בארבע שורות תאי נציג סרטן. A, האחוז קורא מיפוי אל transcriptome, C, אחוז קורא באזורים exonic. D, אחוז קורא באזורים רצפי האינטרונים. E, רצף סה"כ קורא. F, אחוז קורא מיפוי RNA ריבוזומלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

שורת תאים היתוך סוג הספרייה סה"כ קורא על היעד יקרא קורא מנורמל Fusion תמיכה (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TRלְמַעלָה
K562 BCR-ABL RNA-seq 150,300,482 279,438 0 438 0
לִלְכּוֹד 9,341,148 7,566,087 598 343 0
LC2 CCDC6-RET RNA-seq 128,861,790 307,566 0 97 0
לִלְכּוֹד 12,320,692 10,314,284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNA-seq 135,321,406 225,222 0 0 170
לִלְכּוֹד 9,317,418 7,680,818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNA-seq 161,350,024 208,741 0 131 469
לִלְכּוֹד 8,305,950 6,563,574 358 88 34

איתור Fusion 1. טבלה לכידה לעומת RNA-seq של K562, LC2, EOL1 ו RT-4. טבלה זו מציגה ארבע שורות תאי הסרטן ושלושה אלגוריתמים לזיהוי פיוז'ן שונים, TopHat2, ChimeraScan, ו TRUP מנוצלות ההפגנה הזאת. טבלה זו ממחישה את היכולת לזהות בשילובים עם לכידת באמצעות פחות מ -10 מיליון הכולל קורא לעומת יותר מ -60 מיליון כניסות מנוצל עבור RNA-seq. התומכות Fusion קורא חושבו על ידי חלוקת פיוז'ן תומכת קורא ידי קינאז קורא, כשהוא מוכפל ממיליון.

</ Html"איור 4" src = "/ files / ftp_upload / 54,090 / 54090fig4.jpg" />
איור 4. SNV הקוראת לכידת לעומת RNA-seq. דיאגרמות ון אלו מציגים את המספר של יחיד נוקלאוטיד נוסחים שונים (SNVs) כי התגלו על ידי לכידת RNA-seq עבור כל אחת מארבע שורות תאים (K562, LC2, EOL1 ו RT-4). זה ממחיש הקונקורדנציה גבוה של SNVs בין לכידת RNA-seq בתוך-אזור:. K562 (81.3%), LC2 (78.3%), EOL1 (89.5%) ו RT-4 (73.9%) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לכידת RNA-seq היא אסטרטגית ביניים בין RNA-seq ו microarray גישות לשערוך חלק נבחר של transcriptome. היתרונות של לכידה כולל עלות מופחתת, זמן אספקה ​​מהיר על ברצף שולחן עבודה, קצב העברת נתונים גבוהים, וזיהוי של שינויים הגנומי. השיטה יכולה להיות מותאמת לאפיין RNAs ללא קידוד 23, לזהות נוקלאוטיד בודד גרסות 4-6, לבחון שחבור, ולזהות בשילובי גן או rearrangements המבני 24. יתר על כן, ניתן ליישם גישה זו דגימות קליניות או מעובד שעברו קיבוע עם בפורמלין מוטבע בבלוקים פרפין 24,25.

ישנם מספר יתרונות משמעותיים של לכידת RNA-seq לעומת microarray, PCR כמותי בזמן אמת, רצף סנגר ואת רצפי DNA. Microarray מוגבל על ידי רקע גבוה עקב כלת צלב הלא ספציפי מחייב של בדיקות. כימות של גנים עם lביטוי ow ​​מוגבל בשל רעשי רקע, תוך מדידות גן מבוטאות בכמות גבוהה מושפעות רווית אות 1. לעומת ללכוד RNA-seq, בזמן אמת PCR מוכיח שקשה לשחזר. בנוסף, RNA-seq מאפשר זיהוי של תמלילי הרומן, דורש חומר הזנה המוצא פחות והוא יכול לזהות בניגוד אלטרנטיבה שחבור 26 .בשנת כדי רצף סנגר, RNA-seq מאפשר קצב העברת נתונים גבוה וניתוח של מירנה הביע נמוכה. רצף סנגר הוכיח להיות כלי רב ערך עבור אימות של התכה עם צומת אקסון-אקסון ידועים מוטציות DNA סומטיים, אולם זיהוי של התכת רומן מתעכב על ידי דרישות של נקודת עצירת מועמד אפריורי. רצפי DNA אינו עלות יעילה, דורשים שטח אחסון גדול יותר עבור נתונים, והוא מסוגל זיהוי של שינויים שלאחר תעתיק.

ישנם מספר שלבים קריטיים הכרוכים לכיד RNA-seq. ראשית, כדי לשפר את התשואה של מוצרי ספרייה מתוךRNA / חרוזים חרוזים פאראמגנטיים ספציפיים פאראמגנטיים cDNA במהלך שוטף, להיות זהירים לא מעל לייבש את החרוזים, אשר יוביל לאובדן של תשואה. כמו כן, לא תחת לייבש את החרוזים, להבטיח כל אתנול יוסר דוגמיות, כמו אתנול יכול להפחית תשואה cDNA. שנית, הכלאה של ספריות cDNA עם בדיקות משלימות תלויה בטמפרטורה עקבית, אנו ממליצים התחממות הצפה לשטוף לי ומחמירות הצפה עד 65 מעלות צלזיוס לפחות שתי שעות מראש. יתר על כן, לאחר הכלאה זה חיוני כדי לשמור על 65 מעלות צלזיוס במהלך השלבים מחייבים ולשטוף. הבדיקות משמשות כאן תוכננו עבור אקסונים של גני העניין לפיתוח תרופות כוללים קינאזות, גני המעורבים rearrangements הנפוצה כגון גורמי שעתוק, וגני ניהול משק בית. יתר על כן, תוכן הגנום ניתן להתאמה אישית וגדלים לוח ללכוד יכול להשתנות. יתר על כן, מידע חדש על אזורים גנומית מתעורר, בדיקות נוספות יכולות להיות מתוכננות והוסיפו ל- tהוא קיים לוח צילום.

הערכת מדדי יישור, שיעור על היעד במיוחד, מספק מידע על מידת הצלחה של האזור הועשר. שיעור על היעד נמוך יכול להיות בגלל הכלאה נכשלה ללכוד, לפיה אזור היעד הרצוי לא נתפס מועשרת. במקרה זה, מחדש כלת לכידתו של סט הספרייה חייבת להתבצע. שיעור על היעד נמוך עשוי להיות גם עקב אי לרוקן rRNA, אשר יכול להיות מאושר על ידי חישוב אחוז rRNA בדגימות. אחוז rRNA הגבוה בתוך המדגם ידרוש מחדש הכנת המדגם החל דלדול rRNA. בנוסף, אם ריכוז הספרייה נמוך מהדרישה עבור הכלאה ללכוד, יהיה זה רצוי כדי לייעל את כמות הקלט החל לסוג מדגם ואיכות (טווח: 50-1,000 נ"ג).

אמנם יש מספר יתרונות עבור יישומי RNA-seq ממוקדים, יש גם מגבלותלשקול. דוגמאות עם איכות RNA עניה המבוססת על RIN או מידת הפיצול לא עשויות להניב ספריות איכות עבור סידור. כמה קבוצות הוכיחו הצלחה עם דגימות פרפין מוטבע קבוע בפורמלין, אולם ישנם דוגמאות כי לא יעבור על רצף 24,25,27. יתר על כן, מאז לכידת RNA-seq מתמקדת תמלילים ידועים, היא מאבדת את היתרונות של RNA-seq המשוחדת לרומן או תעתיקים ללא ביאור. בנוסף, לגילוי SNP, שיטות RNA-seq יכולות לזהות מוטציות רק תמלילים לידי ביטוי.

הזדמנויות עתידיות של לכידת RNA-seq כוללות מחקר ויישומים קליניים. התגלית האחרונה של אלף RNA ללא קידוד הארוך ותפקידם בביולוגיה תדרוש אפיון ממוקד. במרפאת, לכידת RNA-seq רשאית להאריך מעבר בדיקות מחקר לתרגם מבחנים קליניים לאפיין מחל אנושיות כגון סרטן, מחלות זיהומיות, וכן לבצע בדיקה לא פולשנית. יחד עם approa מיפוי גנומיצ 'ס, לכידת RNA-seq ניתן לשלב ללמוד ולאפיין את הגנום לידי ביטוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
  7. Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
  8. Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
  9. Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
  10. Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
  11. Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  14. Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
  15. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  18. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  19. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  20. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
  21. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
  22. Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  23. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  24. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
  25. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  26. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  27. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 114 רצף RNA הכלאה ללכוד בשילובי גן ביטוי RNA-seq הממוקד
ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J.… More

Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter