Abstract
RNA配列（RNAseq）は、遺伝子発現、突然変異、遺伝子融合、および非コードRNAを検出し、特徴付けるために使用することができる汎用性の高い方法です。億シーケンシング読み取り、そのようなmRNAおよび非コードRNAなどの複数のRNA産物を含めることができます - 標準RNAseq 30が必要です。我々は、ターゲットを絞ったRNAseq（キャプチャ）は、デスクトップ・シーケンサーを使用して、選択したRNA産物にフォーカスされた研究を可能にする方法を示します。 RNAseqキャプチャは、そうでなければ、伝統的なRNAseq方法を使用してミスの可能性があることを、注釈なしの低い、または一時的に発現転写産物を特徴づけることができます。ここでは、細胞株からのRNAの抽出、リボソームRNAの枯渇、cDNA合成、バーコードのライブラリ、ハイブリダイゼーションおよびデスクトップ・シーケンサー上のターゲット転写産物と多重シーケンシングのキャプチャの準備について説明します。我々はまた、品質管理評価、整列、融合検出、遺伝子発現の定量化および単NUCの識別を含むコンピュータ解析パイプラインを、概要leotide変種。このアッセイは、遺伝子発現、遺伝子融合、および変異を特徴付ける標的転写物配列決定を可能にします。
Protocol
注：このプロトコルは、4つのサンプルの同時処理および分析について説明します。この方法は、細胞から単離されたRNA、新鮮凍結組織及びホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPE）と互換性があります。各試料についてのRNA入力を開始するの千ngの（250推奨NG） - このプロトコルは50で始まります。
RNA手順の1. rRNAの枯渇とフラグメンテーション
- rRNAを枯渇
- 室温-20℃と融解からの溶出、プライム、フラグメントミックス、rRNAを除去ミックス、rRNAの結合緩衝液および再懸濁緩衝液を除去します。 4°Cから溶出バッファー、rRNAを除去ビーズおよびRNA / cDNAの特定の常磁性ビーズを除去し、室温にもたらします。
- PCRチューブにRNAの0.25μgのを追加します。 10μlの総最終体積にヌクレアーゼフリーの超純水で全RNAを希釈します。各チューブに結合緩衝液rRNAの5μlを添加し、その後のrRNA除去ミックスの5μlを添加し、穏やかにpipett電子上下に混合します。蓋付きサーマルサイクラーに入れチューブは、RNAを変性させ、5分間68℃まで100℃とプログラムサーマルサイクラーに予め加熱しました。
- RNAの変性後、サーマルサイクラーからチューブを除去し、1分間室温でインキュベートします。渦のrRNA除去ビーズチューブを激しくビーズを再懸濁します。新しいチューブにrRNAを除去ビーズの35μlを添加して、rRNAを除去ビーズを含むチューブにRNAの変性反応（20μl）を転送します。
- すぐに45μlのピペットにピペットを調整し、20倍のダウンミックスします。 1分間室温でチューブをインキュベートします。その後、1分間、室温で磁気スタンドにチューブを配置します。新たに標識PCRチューブに上清を移し、1分間室温で磁気スタンドに再びこれらのチューブを配置します。これにはビーズが転送されていないことを保証します。新たに標識PCRチューブに上清を移します。
- 渦RNA / cDNAの特定の常磁性ビーズと各チューブにビーズの99μlを添加します。静かにピペット全体ミックスする上下10倍のボリューム。劣化し-RNAで始まる場合は、各チューブに十分に混合されたRNA / cDNAの特定の常磁性ビーズの193μlを添加します。室温で15分間インキュベートします。その後、5分間、室温で磁気スタンドにチューブを配置します。削除し、上清を捨てます。
- 新たに調製した70％エタノール（EtOH）中の200μlのを追加します。磁気スタンドにチューブを保持し、ビーズを乱さないように注意してください。 30秒間室温でインキュベートし、その後、上清を除去し、廃棄します。乾燥するために10分 - 管が5室温で放置します。
- 遠心分離機は、5秒間600×gで室温の溶出緩衝液を解凍しました。各チューブに溶出バッファー11μLを加え、穏やかにアップピペットと10倍のダウンミックスします。 2分間室温でチューブをインキュベートします。 5分間、室温で磁気スタンドにチューブを入れます。新たに標識PCRチューブに上清の8.5μLを移します。
- rRNAを枯渇RNAの断片化
- 8.5μlのエルを追加UTE、8.5μlのプライム、および各チューブに8.5μlの断片ミックス。静かにアップピペットと10倍のダウンミックスします。プログラム以下とサーマルサイクラーに入れチューブ：8分、100℃、94℃に予熱した蓋をし、4°Cホールド。
注：この手順は、155塩基対の平均インサートサイズを生成するように設計されています。 RNAサンプルの平均断片サイズは200 bpのより低い場合は、このステップをスキップし、第一鎖cDNA合成に進みます。
- 8.5μlのエルを追加UTE、8.5μlのプライム、および各チューブに8.5μlの断片ミックス。静かにアップピペットと10倍のダウンミックスします。プログラム以下とサーマルサイクラーに入れチューブ：8分、100℃、94℃に予熱した蓋をし、4°Cホールド。
2. cDNA合成
- ファーストストランドcDNAを合成
- -20°Cから第一鎖合成ミックスを外し、室温で解凍。
- 次の設定でプリプログラムサーマルサイクラー：10分間予熱蓋オプションと100℃に設定し、その後、25℃、42℃、15分間、70℃で15分間、4℃で保持します。このプログラムを保存し、「合成する第1ストランド。」
- 600＆＃での遠心分離解凍-第一鎖合成ミックスチューブ215; 5秒間グラム。 1μlのは、第一鎖合成ミックスの9μlの逆転写酵素を混ぜます。
- 第一鎖合成の8μlを添加し、各チューブに転写酵素ミックスを逆転、優しくアップピペットミックスダウンする6倍速。 4秒間遠心管は、底部に液体をもたらすために6.0×gで一定速度ミニ卓上遠心分離機を使用して。サーマルサイクラーにチューブを配置し、合成する第1ストランドを選択します。サーマルサイクラーを4℃に達すると、チューブを除去し、第二鎖cDNAを合成するためにすぐに進んでください。
- 第二鎖cDNAを合成
- 蓋付きの16℃に予熱サーマルサイクラーを30℃に予熱。氷の上の第二鎖マスターミックス、再懸濁バッファーを解凍します。事前に、4°Cから常磁性ビーズのボトルを除去し、室温にそれらをもたらすために少なくとも30分間放置しました。
- 各PCRチューブに再懸濁緩衝液の5μlを添加します。 600での遠心分離の第二鎖マスターミックス5秒間グラム×各PCRチューブに20μlを添加します。 1時間16℃で予熱したサーマルサイクラーにチューブを入れます。インキュベーションが完了すると、サーマルサイクラーから削除して、チューブを室温にさせます。
- 渦常磁性ビーズは、それらが十分に分散するまで。各チューブによく混合された常磁性ビーズの90μlを添加します。穏やかに混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。室温で15分間チューブをインキュベートします。 5分間室温で磁気スタンドにチューブを入れます。
- エタノール洗浄を行うために、磁気スタンドにチューブを残して上清の135μLを取り外し、廃棄します。 30秒間室温でインキュベートした後に、新たにビーズを乱すことなく各チューブに80％エタノールを用意し、200μlのを追加します。それぞれからの上清のすべてを削除し、破棄します。 2 80％エタノール洗浄の合計のために繰り返します。
- 磁気スタンド上で乾燥させる10分 - 管が5室温で放置します。遠心分離機解凍した部屋のtemperatur5秒間600×gでの電子の再懸濁緩衝液。磁気スタンドからPCRチューブを外します。各PCRチューブに17.5μlの再懸濁緩衝液を加え、穏やかに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。室温で2分間チューブをインキュベートします。
- 5分間、室温で磁気スタンドの上に置いてチューブは、その後、0.2ミリリットルのPCRストリップチューブに15μlの上清（二本鎖cDNA）を転送します。
注：これは、cDNAは、7日間まで-20℃で保存することができるように、安全な停止点です。
3.ライブラリの準備
- アデニル3 '末端
- 室温-20℃と融解から-テーリングミックスを削除します。次の設定でプリプログラムサーマルサイクラー：プレヒートリッドオプションを選択した後、30分間37℃に設定し、100℃、70℃に設定し、5分間、4℃で保持します。このプログラムを保存」ATAIL70。」
- 再懸濁の2.5μLを追加各チューブにバッファー。その後、解凍したA-テーリングミックスの12.5μlを添加します。静かに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。サーマルサイクラーにチューブを配置し、ATAIL70を選択します。サーマルサイクラーの温度は4℃である場合には、サーマルサイクラーからPCRチューブを削除し、アダプタを連結するためにすぐに進んでください。
- ライゲーションアダプタ
- 、適切なRNAアダプターチューブを外し、-20℃からライゲーションバッファーおよび再懸濁緩衝液を停止し、室温で解凍。プロトコルにそうするように指示があるまで-20°Cからライゲーション混合管を削除しないでください。 4°Cから常磁性ビーズのボトルを取り外し、室温にもたらすために少なくとも30分間放置しました。
- 30℃にサーマルサイクラーを事前に加熱して、プレヒートリッドオプションを選択して、100℃に設定してください。遠心分離機5秒間600×gで解凍したRNAアダプタチューブは。使用直前に、-20°Cからライゲーションミックスチューブを削除ストレージ。
- 各サンプルチューブに再懸濁緩衝液の2.5μlを添加します。連結混合物の2.5μLを加えます。ライゲーション混合管を使用した後、直ちに-20°Cストレージにを返します。各サンプルチューブに解凍したRNAアダプタ指数の2.5μlを添加します。静かに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。
- 6.0×gで一定速度ミニ卓上遠心分離機を用いて、4秒間遠心管。予熱したサーマルサイクラーにチューブを入れます。蓋を閉め、30℃で10分間インキュベートします。
- サーマルサイクラーからチューブを外し、連結を不活性化するために各チューブにストップ連結緩衝液の5μlを添加します。静かに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。
- 混合常磁性ビーズの42μLを使用して、79.5μlの上清を捨て、2.2.4 - 2.2.3に記載されているように繰り返し洗浄。 10分 - 磁気スタンドにチューブでは、5室温でサンプルを空気乾燥してみましょう。
- からPCRストリップチューブを削除します磁気スタンドと各チューブに52.5μlの再懸濁緩衝液を追加します。静かに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。 2分間室温で管をインキュベートします。 5分間、または液体が透明になるまで室温で磁気スタンドにチューブを入れます。新しい0.2ミリリットルのPCRストリップチューブに各チューブから50μlの上清を移します。ビーズを乱さないように注意してください。
- 混合常磁性ビーズを50μlを使用し、95μlの上清を捨て、2.2.4 - 2.2.3に記載されているように繰り返し洗浄。 10分 - 磁気スタンドにチューブを使用すると、5 RTでサンプルは空気乾燥してみましょう。
- 磁気スタンドからPCRストリップチューブを取り外し、各チューブに22.5μlの再懸濁緩衝液を追加します。静かに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。
- 2分間室温でチューブをインキュベートします。 5分間、または液体が透明になるまで室温で磁気スタンドにチューブを入れます。に各チューブから20μlの上清を移し新しい0.2ミリリットルのPCRストリップチューブ。ビーズを乱さないように注意してください。これは、安全な停止点であり、cDNAは7日間まで-20℃で保存することができます。
4.ライブラリーの増幅
- DNA断片を豊かに
- 室温-20℃の保存と融解からのPCRマスターミックス、PCRプライマーのカクテルと再懸濁緩衝液を除去します。 4°Cストレージから常磁性ビーズのボトルを取り外し、室温にもたらすために少なくとも30分間放置しました。
- 次の設定でプリプログラムサーマルサイクラー：プレヒートリッドオプションを選択して、100℃に設定し、その後10秒間、30秒間、98℃で、98℃での変性の15サイクルを初期変性を設定し、アニーリング30秒、5分間72℃で1最終伸長サイクルおよび72℃で30秒間、および伸長のために60℃で、4℃で保持します。このプログラムを保存し、「PCR」。
- 解凍したPCRマスターを遠心5秒間600×gでチューブを混合し、PCRプライマー。各サンプルチューブに解凍したPCRプライマーの5μlを添加します。各サンプルチューブに解凍したPCRマスターミックス25μlのを追加します。静かに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。
- 事前にプログラムされたサーマルサイクラーでキャップされたPCRストリップチューブを置きます。蓋を閉じて、PCRプログラムを実行します。 PCRが完了すると、サーマルサイクラーからチューブを除去し、氷上に保ちます。
- 混合常磁性ビーズを50μlを使用し、95μlの上清を捨て、2.2.4 - 2.2.3に記載されているように繰り返し洗浄。 10分 - 磁気スタンドにチューブでは、5室温でサンプルを空気乾燥してみましょう。
- 磁気スタンドからチューブを外し、各サンプルチューブに32.5μlの再懸濁緩衝液を追加します。静かに完全に混合するには、上下10倍のボリューム全体をピペット。 2分間室温でインキュベートします。 5分間、または液体が透明になるまで室温で磁気スタンドにPCRチューブを置きます。その後、30μlのsuコマンドを転送新鮮0.2ミリリットルのPCRチューブにpernatant。
- 蛍光光度計7を用いてcDNAの定量化を行い、キャピラリー電気泳動システム8を用いてcDNAの品質を決定します。
注：これは、安全な停止点であり、cDNAを7日間まで-20℃で保存することができます。注：このライブラリはRNAseqライブラリーであると考えられます。
その後の工程は、キャプチャー・ライブラリーにつながります。
5.ハイブリダイゼーション、キャプチャおよびシーケンシング
- 多重化されたハイブリダイゼーション
- -20°Cからカスタム水和プローブ、簡易ベッド-1 DNA、ユニバーサルブロッキングオリゴ、およびアダプター固有のブロッキングオリゴを削除し、氷上で解凍。
- 低バインド1.5mlチューブでは、500 ngのDNA結合（サンプルあたり125 ngのを多重する場合4サンプル）、5μlの簡易ベッド-1 DNA（1μgの/μl）を、1ULユニバーサルブロッキングオリゴ、0.5μlのP7（6ヌクレオチド）特定のアダプタブロッキングオリゴ（この量は、多重conditiに応じて調整する必要があるかもしれませんオリゴを遮断するアドオン）と0.5μlのP7（8ヌクレオチド）アダプタ固有の（この量は、マルチプレックスの条件に応じて調整する必要があるかもしれません）。
- 回転の反対方向を向いたキャップオープンで真空濃縮器でサンプルチューブを置きます。 20分間または液体の完全蒸発するまで45℃で乾燥した内容。
- 8.5μlの2×ハイブリダイゼーション緩衝液、3.4μlのハイブリダイゼーション成分Aと1.1μlのヌクレアーゼを含まない水で乾燥したコンテンツを再懸濁します。再懸濁し、ボルテックス毎に2.5分間、10分を許可します。 0.2ミリリットルのPCRチューブに再懸濁させ、材料を移し、サーマルサイクラーで95℃で10分間インキュベートします。
- サーマルサイクラーからハイブリダイゼーションサンプルチューブを外し、1.5ピコモル/μlの濃度で再懸濁したカスタムプローブの2μlを添加します。また、0.75ピコモル/μlの濃度で再懸濁したカスタムプローブの4μlを添加します。 65°Cで - （24時間16）で一晩ハイブリダイゼーション反応をインキュベートします。
注：プローブさまざまなベンダーから購入したのを使用してもよいし、メーカーの指示に従ってください。ハイブリダイゼーション工程の時間も変えることができます。
- ビーズの調製とキャプチャ
- 4°Cからストレプトアビジン結合常磁性ビーズのボトルを取り外し、室温で30分間平衡化。 1倍ワーキングソリューションを作成するために、10倍の洗浄緩衝液（I、II、III、および厳格な）と2.5倍ビーズ洗浄緩衝液を希釈します。
- 新しい1.5 mlチューブにに小分けし、1×洗浄バッファー140μlの私は。私は、少なくとも2時間、ヒートブロックで65℃で1×洗浄緩衝液の1×厳しいバッファと分量の全量を加熱します。
- 1.5mlチューブに小分けし、キャプチャあたりストレプトアビジン結合常磁性ビーズを100μl。磁石上に置き、上清を捨てます。 10秒間100μlのビーズとボルテックスあたり200μlのビーズ洗浄バッファーを追加します。 5分または上清が透明になるまで - 2用の磁石上に置きます。上清が透明になったら、それを破棄して再2回の洗浄の合計のためにもう一度泥炭。
- ビーズ洗浄バッファーを除去した後、最初の出発ボリュームとして等量のビーズ洗浄バッファーを追加する（ すなわち 、1つの捕捉のための100μl）を。再懸濁し、0.2ミリリットルのPCRチューブに移します。 5分または上清が透明になるまで - 2のための磁気ラックにチューブを置きます。上清を捨てます。
- 65℃のサーマルサイクラーでのハイブリダイゼーションサンプルとビーズの両方で、混合するために上下10倍のビーズチューブやピペットにハイブリダイゼーション混合物を転送します。 、45分間65℃でインキュベートし、ボルテックスし、一定速度（6.0 XG）卓上ミニ遠心機を用いて、4秒間のサンプルをスピンダウン。
- ビーズウォッシュ
- サーマルサイクラーからキャプチャチューブを外し、混合する10秒間のチューブとボルテックスに100μlの予熱した1×洗浄バッファーIを追加します。新鮮な低バインド1.5mlチューブに混合物を転送します。磁気分離ラックにチューブを置き、2許可 - 分離のためまたは上清が透明になるまで5分。 Discard上清。
- 200μlの予熱1×リンジェント洗浄バッファーを添加し、混合するためにダウンして10回をピペットと。 5分間65℃でインキュベートします。磁気分離ラックにチューブを置き、2許可 - 分離のためまたは上清が透明になるまで3分。上清を捨てます。 2回の洗浄の合計のためにもう一度ストリンジェントな洗浄を繰り返します。
- 200μlの室温の1倍を追加混合する2分間Iと渦を洗浄緩衝液。磁気分離ラックにチューブを置き、2可能 - 分離のためまたは上清が透明になるまで5分。上清を捨てます。
- 200μlの室温の1倍を追加混合する1分間のバッファIIと渦を洗います。磁気分離ラックにチューブを置き、2可能 - 分離のためまたは上清が透明になるまで5分。上清を捨てます。
- 200μlの室温の1倍を追加混合する30秒間バッファIIIと渦を洗います。分離のためまたは上清まで5分 - 2を可能にする磁気分離ラックにチューブを置きます明らかです。上清を捨てます。
- 磁気分離ラックからチューブを外し、ビーズを再懸濁し、20μlのヌクレアーゼフリー水を追加します。ピペッティングにより、10回上下徹底的に混ぜます。
- ポストキャプチャPCR増幅
- 4°Cから常磁性ビーズを除去し、室温で30分間平衡化。
- RTで-20℃と融解からのホットスタートPCRレディ・ミックス（2×）およびPCRプライマーミックスを削除した後、氷上に置きます。 （これらのボリュームが1、ハイブリダイゼーションライブラリー+ 10％過剰のためのものである）PCRプライマー1の2.75μlのとPCRプライマー2の2.75μlの2倍ホットスタートPCRレディ・ミックスの27.5μLを組み合わせることにより、ライブラリー増幅マスターミックスを準備します。
- セットアップ20ビーズのμlを加えて全量50μlのためのライブラリーの増幅マスターミックス30μlので捕捉されたDNAを添加することにより、PCRチューブでの反応。キャップチューブを適切と混合する渦。固定速度ミニタブを使用して、4秒間遠心管6.0×gでルトップ遠心分離機。
- 以下のPCRプログラムをセットアップします： - 65で15秒、アニーリング98℃での変性の12サイクルプレヒートリッドオプションを選択して、100℃に設定してから、45秒、10のために98℃での初期変性を設定60秒間72℃で30秒、延長、1回の最終伸長60秒間72℃でのサイクルと4℃で保持するための°C。
- サーモサイクラーからサンプルを削除し、75μlの常磁性ビーズを追加します。よく混合し、室温で15分間インキュベートします。
- 2室温で磁石にチューブを入れる - 3分、その後、上清を除去します。その後、上清を除去する30秒間インキュベートし、200μlの80％エタノールを添加することにより、磁石にビーズを洗浄します。 2 80％の洗浄の合計のために繰り返します。
- ビーズを乾燥させるために10分 - 5 RTでインキュベートします。割れに乾燥しないで下さい。トリスEDTA pHが8.0（1×TE溶液）22μlの再懸濁ビーズおよび溶出のために3分を可能にします。 5分目 - 3用磁石上にサンプルを置きます転送全くビーズを確保していない新鮮な低バインド1.5mlチューブに溶出した製品を20μl、エン引き継がれます。
- 蛍光光度計7を用いて捕捉するcDNAの定量化を行い、キャピラリー電気泳動システム8を使用してキャプチャするcDNAの品質を決定します。
- デスクトップシーケンサは手順9のロード
- 氷上で、0.1％のTween 20を解凍10 N NaOHおよびハイブリダイゼーション緩衝液10mMのトリス-Cl pHが8.5を用いて、4 nMの最終濃度まで取り込まれたcDNAライブラリーを希釈します。使用前に約30分間、RTの水にデスクトップシーケンサv2の試薬キットボックス1を解凍。 MAXの充填ライン10の上方に記入しないでください。これはシーケンシングプラットフォーム固有の手順で、製造元の指示によって異なる場合がありますのでご注意ください。
- マイクロ遠心チューブ（常に新鮮な準備）に980μlのヌクレアーゼを含まない水で20μlの10NのNaOHを組み合わせることにより、0.2 N NaOHを1ミリリットルを準備します。 4 nmのことでPHIXライブラリ（ライブラリ制御）を希釈0.1％Tween 20で3μlの10mMのトリス-Cl pHが8.5と10 nMのライブラリ制御の2μLを組み合わせます。
- 混合するために簡単に5 0.2 N NaOHをμlの渦に4nmのライブラリーの5μLを組み合わせることにより、最終的なライブラリとライブラリ制御を変性させます。 6.0×gで一定速度ミニテーブルトップ遠心機を用いて4秒間遠心管。 5分のライブラリーを変性させ、室温でインキュベートします。
- 変性ライブラリの10μLを含むチューブに予冷したハイブリダイゼーション緩衝液990μLを加えます。これは、20 pMのライブラリになります。マーク日付で変性20 pMのライブラリとは、-20℃で3週間まで保存することができます。
- 12.5 pMのライブラリ制御をもたらすように予冷したハイブリダイゼーション緩衝液および希釈されたライブラリ制御の225μlの20 pMのライブラリ制御の375μLを混ぜます。溶液を混合するために数回転倒。
- 12.5 pMの変性ライブラリ制御と混合する渦の6μlの変性の最終ライブラリーの594μLを兼ね備えています。組み合わせSAMPを設定脇氷の上ルライブラリとライブラリ制御サンプルは、デスクトップシーケンサ試薬カートリッジにロードする準備が整うまで。
6.データ解析
- シーケンス品質評価
- シーケンスの品質評価11を使用して、生の配列データ（FASTQファイル）の品質を計算します。
注：この手順は、それがさらに下流の分析に供される前にデータを評価するのに役立ちます。ソフトウェアは、内蔵のパラメータを指定して実行され、各FASTQファイルのメトリックのセットを生成します。
- シーケンスの品質評価11を使用して、生の配列データ（FASTQファイル）の品質を計算します。
- アラインメント
- シーケンスがGTFファイルとして既知の転写産物を提供しながら、Tophat2 12（バージョン2.0.10）を使用して参照ヒトゲノムのhg19とトランスクリプトームに（FASTQファイル）を読み込む合わせます。出力は、BAMファイルと呼ばれるバイナリアライメント形式の形態です。
- Samtools 13（バージョン0.1.19を使用して、並べ替えやインデックスなどの後処理手順を実行します）BAMファイルに。 SAMを並べ替え、マーキング複製を実行し、サイズの計算とピカールツール14（バージョン1.84）を用いた再生グループを追加または交換を挿入します。
- RNAseq品質評価
- RNAseq品質評価を使用してRNAseqデータの品質管理指標のシリーズを計算します。このソフトウェアへの入力はTophat2配向からBAMファイル15です。出力は合計読取り回数、重複を一覧表示したHTMLファイルで、とりわけ、 などの読み取り率とのrRNAの割合を、マッピングされました。
- バリアントコーリング
- 位置合わせのためにSTAR（バージョン2.4.0）16を使用し、単一のヌクレオチド呼び出すバリアントフラグにGATKの（バージョン3.3から0）HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM後処理工程およびフィルタリング基準を使用して、出力から偽陽性を削除します。
- 遺伝子発現
- 遺伝子発現USIを計算しますタキシード・スイート18からngのカフスソフトウェア（バージョン2.1.1）。
注：入力がTophat2アライメントツールからBAMファイルです。出力は式がFPKMのように計算されたアイソフォーム、遺伝子や転写物のレベル、（百万あたりのキロベースあたりの断片はマップされた読み込み）で生成されます。
- 遺伝子発現USIを計算しますタキシード・スイート18からngのカフスソフトウェア（バージョン2.1.1）。
- フュージョンコーリング
- ChimeraScan 19（バージョン0.4.5）、トップハットフュージョン20カスタムおよびTRUP 21を用いて、各試料からの融合を呼び出します。 Oncofuse 22（バージョン1.0.9b2）を使用して、ドメインの融合に注釈を付けます。
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Representative Results
RNAseqキャプチャの模式的ハイライトの重要なステップは、図1に示されている。既知の変異を有する四癌細胞株がRNAseqキャプチャ手法の有効性を実証するために使用された（K562 ABL1融合 、RET融合とLC2と、EOL1 PDGFRalpha融合およびRT-でFGFR3融合 4）。 4つのサンプルを一緒にプールし、100 bpのはFASTQファイルを生成し、デスクトップ・シーケンサー、上に読み込み、2回で配列決定しました。人間のトランスクリプトームの1）品質管理の評価、2）位置合わせ、3）遺伝子発現の定量化、4）融合呼び出し、および5）バリアント呼び出し：FASTQファイルには、5つの主要コンポーネントが含まれRNAseq解析パイプライン、を介して実行されました。整列ファイル（BAM）は、単一ヌクレオチド変異体を呼び出して、遺伝子発現を計算するために使用されます。融合は、トップハットフュージョン（自分のアライメントを行う）などの融合発信者を、使用して呼び出され、出力がusin注釈されていますグラム融合検出ソフトウェア。
遺伝子RNAseqからの発現とキャプチャの比較は千倍のキャプチャ方法（ 図2A）を使用して10によって標的転写物の濃縮を示しています。また、 図2Bは RNAseqに比べてキャプチャを使用して標的転写領域へのマッピングを読み取るの割合の増加を示します。品質管理対策の評価は、図3に示されている。キャプチャしRNAseqは、トランスクリプトーム（3A、94％ 対 93％）に整列の点で均等に行い、インサートサイズ（3B、174 bpの対 162 bp）を意味します。捕捉法を用いて、エクソン領 域のより高い割合が配列決定される（ 図3（c）、77％ 対 60％）、逆イントロン領域の低い割合は、配列決定される（3次元、4％ 対 20％）。サンプルあたりの総読み出し数は3Eに示されていますRNAseq（3F、4％ 対 15％）と比較した場合、キャプチャ方法を使用して低かったです。
表1に示される融合検出出力は、正規化された融合読み取り支持して生成されます。 RNAseqはすべての4つの細胞株のための融合を検出することに成功したキャプチャします。キャプチャとRNAseqの重複領域で呼ばれる一塩基変異体の比較は、図4に表示されます。これは、ターゲット領域内のキャプチャとRNAseq間の変種の高い一致を示しています。
図1. 回路図RNAseqキャプチャ手順の。この実証実験では、RNAは、最初depleがありますリボソームRNAのテッド、逆転写酵素を用いて相補的DNA（cDNA）の化学的断片化および合成が続きます。次に、cDNAはポリアデニル化およびライブラリーを生成するために、プラットフォーム固有のアダプタに両端に連結されます。適切なアダプタでのみcDNAライブラリーをPCRによって増幅されます。ライブラリは、カスタムオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし、磁気ビーズを用いて捕捉されています。キャプチャされ、ライブラリのこの小さな量は、次世代シーケンシングのための十分なを持っているために二回目を増幅する必要があります。複数のライブラリは、その後、並行して配列決定することができます。配列決定データは、遺伝子融合、発現または変異などの目的のRNAのイベントのために分析されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. C測定さRNAseq。A、4癌細胞株K562でキャプチャしてRNAseq間の遺伝子発現の比較対キャプチャで標的遺伝子、LC2、EOL1およびRT-4のomparisonは万人当たりのキロベースあたりの読み込みマッピングされた（logスケール）（FPKM）を読み込みます。目標と目的の遺伝子が非標的遺伝子（灰色）と比較して（青）濃縮されている。Bの割合は、標的領域へのマッピングを読み取り、4癌細胞株でRNAseqライブラリに対してキャプチャに増加している。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
図 4つの代表的癌細胞株におけるRNAseq 対キャプチャの 3 シーケンシングメトリクス。Aの割合は、トランスクリプトームへのマッピングを読み取り、
| 細胞株 | 融合 | ライブラリの種類 | 合計読み込み | ターゲットに読み込みます | サポート正規化された核融合は読み込み（NFSR） | ||
| TophatFusion | ChimeraScan | TRアップ | |||||
| K562 | BCR-ABL | RNAseq | 150300482 | 279438 | 0 | 438 | 0 |
| キャプチャー | 9341148 | 7566087 | 598 | 343 | 0 | ||
| LC2 | CCDC6-RET | RNAseq | 128861790 | 307566 | 0 | 97 | 0 |
| キャプチャー | 12320692 | 10314284 | 71 | 44 | 6 | ||
| EOL1 | FIP1L1-PDGFRA | RNAseq | 135321406 | 225222 | 0 | 0 | 170 |
| キャプチャー | 9317418 | 7680818 | 143 | 0 | 7 | ||
| RT4 | FGFR3 -TACC3 | RNAseq | 161350024 | 208741 | 0 | 131 | 469 |
| キャプチャー | 8305950 | 6563574 | 358 | 88 | 34 | ||
K562、LC2、EOL1およびRT-4のRNAseq 対捕獲のための 表1 の融合検出。この表は、4つの癌細胞株と、このデモで利用三つの異なる融合検出アルゴリズム、TopHat2、ChimeraScan、およびTRUPが表示されます。この表は、RNAseqのために利用より大きい6000万読み込みに比べ未満千万総読み取り使用してキャプチャして融合を検出する能力を実証します。読み込みがサポート融合を割ることにより計算した支援融合は、キナーゼによって読み込む読み込み、百万を掛けました。
「図4「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 54090 / 54090fig4.jpg" />
RNAseq 対キャプチャを呼びかけ 図4. SNV。これらのベン図は、4つの細胞株（K562、LC2、EOL1およびRT-4）のそれぞれについて、キャプチャしてRNAseqによって検出された単一ヌクレオチドバリアント（SNVs）の数を示しています。これは、標的領域内のキャプチャとRNAseq間SNVsの高い一致を示しています。K562（81.3パーセント）、LC2（78.3パーセント）、EOL1（89.5パーセント）およびRT-4（73.9パーセント）のの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
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Discussion
RNAseq CaptureはRNAseqとマイクロアレイとの間の中間の戦略は、トランスクリプトームの選択した部分を評価するためのアプローチです。キャプチャの利点は、デスクトップ・シーケンサー、高スループット、およびゲノム変化の検出にコスト削減、迅速なターンアラウンドタイムを含みます。この方法は、RNAスプライシングを調べ、単一ヌクレオチド変異体を4-6を検出し 、遺伝子融合または構造的再配列24を識別するために、非コードRNA 23を特徴付けるために適合させることができます。さらに、この方法は、ホルマリンで固定を受け、パラフィンブロック24,25に埋め込 まれている臨床的または処理されたサンプルに適用することができます。
マイクロアレイと比較してRNAseqキャプチャのいくつかの重要な利点がありますが、リアルタイム定量PCR、サンガー配列決定及びDNA配列決定。マイクロアレイによるクロスハイブリダイゼーションおよびプローブの非特異的結合に高いバックグラウンドにより制限されます。リットルを持つ遺伝子の定量高度に発現された遺伝子の測定は、信号飽和1の影響を受けている間OW発現は、バックグラウンドノイズによる制限されています。 RNAseq取り込みと比較して、リアルタイムPCRを再現することは困難で証明します。また、RNAseqは、新規の転写産物の検出を可能にする、より少ない出発入力材料を必要とし、サンガー配列決定に選択的スプライシング26 .INのコントラストを検出することができ、RNAseqは、より高いスループットと低発現するmiRNAの分析を可能にします。サンガー配列決定は、既知のエクソン - エクソン接合部および体細胞のDNA変異を有する融合の検証のための貴重なツールであることが証明されている、しかし、新たな融合体の同定は、先験的候補ブレークポイントの要件によって妨げられています。 DNA配列決定は、効率的なコストではなく、データのより大きな記憶空間を必要とし、転写後修飾を検出することができません。
RNAseqキャプチャに関与するいくつかの重要なステップがあります。まず、からライブラリ製品の歩留まりを向上させます洗浄液中の常磁性ビーズおよび常磁性ビーズ特定のRNA / cDNAは、以上の収量の損失につながるビーズを、乾燥しないように注意が必要です。また、アンダー乾燥ビーズ、すべてのエタノールを保証しないエタノールのcDNAの収率を減少させることができるように、サンプルチューブから除去されます。第二に、相補的なプローブとのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションは、私たちは、事前に、少なくとも2時間、65℃に加温洗浄緩衝液Iと厳格なバッファをお勧めし、一貫した温度に依存します。さらに、ハイブリダイゼーション後に結合および洗浄工程の間に、65℃を維持するために不可欠です。ここで使用されるプローブは、キナーゼ、転写因子などの一般的な再編成に関与する遺伝子、およびハウスキーピング遺伝子を含む薬剤開発のための目的の遺伝子のエクソンのために設計されました。また、遺伝子の含有量はカスタマイズ可能で、キャプチャパネルのサイズは変えることができます。ゲノム領域の新たな情報に応じて、さらに、付加的なプローブを設計し、tに加えることができます彼は、キャプチャパネルを既存の。
アライメント指標の評価、特にオンターゲット率は、標的領域は、濃縮されどれだけの情報を提供します。低オンターゲット率は、所望の標的領域が捕捉され、濃縮されたされなかったことにより失敗したハイブリダイゼーションおよびキャプチャ、に起因する可能性があります。この場合、ライブラリのセットの再ハイブリダイゼーションおよびキャプチャが実行されなければなりません。低オンターゲット率はまたサンプル中のrRNAの割合を計算することによって確認することができるのrRNAを枯渇させる障害に起因し得ます。サンプル内の高rRNAの割合は、rRNAを枯渇から始まるサンプルの再準備が必要になります。ライブラリーの濃度は、ハイブリダイゼーションおよび捕捉のための要件を下回る場合に加えて、サンプルのタイプ及び品質（：50〜1000 ngの範囲）の入力を開始する量を最適化することが賢明であろう。
対象とRNAseqアプリケーションのためのいくつかの利点がありますが、またには限界があります検討してください。 RINまたは断片化の度合いに基づいて、貧弱なRNAの品質を有するサンプルを配列決定のために品質のライブラリを得られない場合があります。いくつかのグループは、しかし、配列決定24,25,27のために通過しないサンプルがある、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルでの成功を実証しています。 RNAseqキャプチャが知られている転写産物に焦点を当てので、それは小説や注釈のない転写産物のための公平なRNAseqの利点を失います。また、SNP検出のために、RNAseq方法は、発現した転写物中の突然変異を検出することができます。
RNAseqキャプチャの今後の機会は、研究と臨床応用が含まれます。長い非コードRNAおよび生物学におけるその役割の何千もの最近の発見は、集束特性評価が必要になります。クリニックでは、RNAseqキャプチャは、研究試験を超えて延びてもよいし、例えば、癌、感染症、および非侵襲的検査として、ヒトの疾患を特徴付けるために、臨床アッセイに変換されます。ゲノム配列決定のapproaに関連してCHES、RNAseqキャプチャは、発現のゲノムを研究し、特徴づけるために統合することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits (24 or 96 reactions) | Roche NimbleGen | 05634261001 or 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| Chloroform | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Dry Bath | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
References
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