Abstract
РНК секвенирования (Секвенирование РНК) является универсальным методом, который может быть использован для обнаружения и охарактеризовать экспрессию генов, мутации, ген слитые и некодирующих РНК. Стандарт требует 30 Секвенирование РНК - 100 миллионов секвенирования читает и может включать в себя несколько продуктов РНК, такие как мРНК и некодирующих РНК. Мы показываем, как целенаправленный Секвенирование РНК (захват) позволяет более детально изучить на выбранных продуктах РНК с использованием настольного секвенсор. Захват Секвенирование РНК может характеризовать Неаннотированный, низкие или скоротечно выраженные транскриптов, которые иначе могут быть пропущены с использованием традиционных методов Секвенирование РНК. Здесь мы опишем экстракцию РНК из клеточных линий, истощением рибосомальной РНК, синтез кДНК, подготовка библиотек, со штрих-гибридизации и захвата целевых транскриптов и мультиплекс секвенирования на настольном секвенсор. Мы также очертить вычислительный анализ трубопровода, который включает в себя оценку контроля качества, выравнивание, обнаружение фьюжн, экспрессия генов количественной оценки и идентификации одного писварианты leotide. Этот анализ позволяет целенаправленно транскриптов секвенирования охарактеризовать экспрессию гена, гена фьюжн, и мутации.
Protocol
Примечание: Этот протокол описывает одновременную обработку и анализ четырех образцов. Этот метод совместим с РНК, выделенной из клеток, свежезамороженной ткани и фиксированных формалином в парафин ткани (FFPE). Этот протокол начинается с 50 - 1000 нг (250 нг рекомендуется) исходного входа РНК для каждого образца.
1. рРНК Истощение и фрагментация процедуры РНК
- рРНК Истощение
- Удалить элюата, премьер, фрагмент для смеси, удаление рРНК, рРНК буфера для связывания и ресуспендирования буфера от -20 ° C и оттепели при комнатной температуре. Удалить элюирующий буфер, удаление бусинки рРНК и РНК / кДНК специфические парамагнитные шарики от 4 ° С и доводят до комнатной температуры.
- Добавить 0,25 мкг РНК в ПЦР-пробирку. Развести тотальной РНК с нуклеазы сверхчистой водой до общего конечного объема 10 мкл. Добавьте 5 мкл буфера для связывания рРНК в каждую пробирку затем добавляют 5 мкл смеси для удаления рРНК и аккуратно pipettе вверх и вниз, перемешать. Место труб в амплификатор с крышкой, предварительно нагревали до 100 ° C и программе термоциклеру до 68 ° С в течение 5 мин для денатурации РНК.
- После того, как РНК-денатурации, удалить трубки из термоциклеру и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 мин. Vortex рРНК удаления шарика трубки энергично ресуспендирования бисером. Добавьте 35 мкл удаления бусинок рРНК в новые пробирки и переносят реакцию РНК денатурации (20 мкл) в пробирки, содержащие удаление бусинки рРНК.
- Отрегулируйте пипетку до 45 мкл и пипеткой быстро вверх и вниз 20x перемешать. Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение 1 мин. Затем поместите пробирки в магнитный штатив при комнатной температуре в течение 1 мин. Перенести супернатант вновь меченых ПЦР-пробирки и поместить эти трубки снова в магнитном стенде при комнатной температуре в течение 1 мин. Это гарантирует, что никакие шарики не передаются. Перенести супернатант вновь меченых ПЦР пробирки.
- Vortex РНК / кДНК специфические парамагнитные шарики и добавляют 99 мкл шариков в каждую пробирку. Аккуратно пипетку весьгромкости вверх и вниз 10 раз перемешать. Если начиная с деградированных-РНК, добавьте 193 мкл хорошо перемешанных РНК / кДНК специфических парамагнитных шариков в каждую пробирку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем поместите пробирки на магнитный выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. Удаляют супернатанты.
- Добавить 200 мкл свежеприготовленного 70% этанола (EtOH). Держите трубки на магнитной подставке и заботиться, чтобы не мешать бусинки. Выдержите при комнатной температуре в течение 30 секунд, затем снимите и выбросьте супернатант. Разрешить пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин, чтобы высушить.
- Центрифуга оттаивают комнатной температуре элюирования буфера при 600 × г в течение 5 сек. Добавьте 11 мкл буфера для элюции в каждую пробирку и осторожно пипеткой вверх и вниз 10 раз перемешать. Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение 2 мин. Поместите трубки на магнитной подставке при комнатной температуре в течение 5 мин. Передача 8,5 мкл супернатанта к вновь меченых ПЦР пробирки.
- Фрагментация рРНК обедненного РНК
- Добавить 8,5 мкл эльЮт, 8,5 мкл простое число, и 8,5 мкл фрагмента смеси в каждую пробирку. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 10 раз перемешать. Место труб в термоциклеру с следующей программой: предварительно нагретой крышкой до 100 ° С, 94 ° С в течение 8 мин, затем 4 ° С имеет места.
Примечание: Этот шаг предназначен для генерации средний размер вставки 155 пар оснований. Если средний размер фрагмент образца РНК ниже, чем 200 пар оснований, пропустите этот шаг и перейти к первой цепи кДНК синтеза.
- Добавить 8,5 мкл эльЮт, 8,5 мкл простое число, и 8,5 мкл фрагмента смеси в каждую пробирку. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 10 раз перемешать. Место труб в термоциклеру с следующей программой: предварительно нагретой крышкой до 100 ° С, 94 ° С в течение 8 мин, затем 4 ° С имеет места.
2. Синтез кДНК
- Обобщить First Strand кДНК
- Удалить первую смесь синтез-нить от -20 ° C и оттаивают при комнатной температуре.
- Предварительная программа термоциклер со следующими параметрами: Опция предварительного нагрева крышка и установлена на 100 ° С, затем 25 ° С в течение 10 мин, 42 ° С в течение 15 мин, 70 ° С в течение 15 мин и выдержка при температуре 4 ° С , Сохранить эту программу как "синтезируют 1 - й Strand."
- Центрифуга трубки оттаивают-первой цепи синтеза смеси при 600 & #215; г в течение 5 сек. Смешайте 1 мкл обратной транскриптазы с 9 мкл первой синтетической смеси нитей.
- Добавить 8 мкл синтеза первой цепи и обратной транскриптазы смеси в каждую пробирку, осторожно пипеткой вверх и вниз 6 раз перемешать. Центрифуга пробирки в течение 4 секунд с использованием фиксированной скорости мини настольной центрифуге при 6.0 XG, чтобы довести жидкость до дна. Поместите трубы в термоциклеру и выберите синтезируют 1 - й Strand. Когда Термоциклер достигает 4 ° C, удалите трубки и немедленно приступить к Обобщить второй цепи кДНК.
- Обобщить второй цепи кДНК
- Предварительно подогревают Термоциклер до 16 ° С с крышкой предварительно нагретую до 30 ° С. Оттепель второй мастер-нить смеси и повторно суспензию буфера на льду. Заранее снимите бутылку парамагнитных шариков от 4 ° С и дайте постоять в течение по крайней мере 30 минут, чтобы довести их до комнатной температуры.
- Добавьте 5 мкл буфера для ресуспендирования в каждую пробирку PCR. Центрифуга второй нити мастер-микс в 600& Bull; g в течение 5 сек и добавляют по 20 мкл в каждую пробирку PCR. Место труб в предварительно нагретую термоциклеру при 16 ° C в течение 1 часа. При инкубации завершена, удалите из термоциклеру и позволяют трубы до комнатной температуры.
- Вихревые парамагнитные шарики, пока они не будут хорошо рассредоточены. Добавьте 90 мкл хорошо смешанных парамагнитных шариков в каждую пробирку. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз перемешать. Инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 15 мин. Место труб на магнитной подставке при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Удаляют 135 мкл супернатанта затем оставить пробирки на магнитной подставке для выполнения EtOH стирки. Добавьте 200 мкл свежеприготовленные 80% этанола в каждую пробирку, не нарушая бусинки, а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 30 сек. Удаляют все надосадочной жидкости от каждого из них. Повторить в общей сложности двух 80% этанола стирок.
- Пусть пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин, чтобы высушить на магнитной подставке. Центрифуга талой комната TEMPERATURе взмучивания буфер при 600 х г в течение 5 сек. Удалить ПЦР пробирки с магнитной подставкой. Добавить 17,5 мкл буфера ресуспендирования в каждую пробирку PCR и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубируйте пробирки в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Место труб на магнитной выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем перенести 15 мкл супернатанта (двухцепочечную кДНК) до 0,2 мл ПЦР-полосковых трубок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная точка остановки, как кДНК можно хранить при температуре -20 ° С в течение до 7 дней.
3. Библиотека Подготовка
- Окончание : аденилатной 3 '
- Удаление хвостохранилища смеси от -20 ° C и оттепели при комнатной температуре. Предварительная программа термоциклер со следующими параметрами: выбрать опцию предварительного нагрева крышки и установлена на 100 ° С, а затем при 37 ° С в течение 30 мин, 70 ° С в течение 5 мин и выдержка при температуре 4 ° С. Сохранить эту программу как "ATAIL70."
- Добавить 2,5 мкл ресуспендированиябуфера в каждую пробирку. Затем добавьте 12,5 мкл размороженной A-хвостохранилище смеси. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Поместите пробирки в амплификатор и выберите ATAIL70. Когда температура тепловой велосипедист находится при температуре 4 ° С, удалить пробирки для ПЦР с термоциклеру и приступить непосредственно к лигирование адаптеров.
- перевязывать адаптеры
- Удалить соответствующий адаптер РНК трубы, остановить буфера для лигирования и ресуспендирования буфера от -20 ° С и оттаивают при комнатной температуре. Не снимайте трубку лигирования смеси от -20 ° C до тех пор, пока указание сделать это в протоколе. Удалите бутылку парамагнитных шариков от 4 ° С и дайте постоять в течение по крайней мере 30 минут, чтобы довести до комнатной температуры.
- Предварительно подогревают термоциклеру до 30 ° C и выберите вариант крышки предварительного нагрева и установить до 100 ° C. Центрифуга размороженные РНК адаптер трубки при 600 × г в течение 5 сек. Непосредственно перед использованием, снимите трубку лигирования смеси от -20 ° Cместо хранения.
- Добавить 2,5 мкл ресуспендирования буфера в каждую пробирку. Добавьте 2,5 мкл смеси лигировани. Возвращение трубки лигирования смеси до -20 ° C для хранения сразу после использования. Добавить 2,5 мкл размороженного индекса адаптера РНК в каждую пробирку для образца. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать.
- Центрифуга пробирки в течение 4 сек с использованием фиксированной скорости мини настольной центрифуге при 6,0 х г. Место труб в термоциклеру предварительно нагретый. Закройте крышку и инкубировать при 30 ° С в течение 10 мин.
- Снимите трубки из термоциклеру и добавляют 5 мкл стоп-буфера лигирования в каждую пробирку, чтобы инактивировать перевязку. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать.
- Повторите промывание как описано в разделе 2.2.3 - 2.2.4, используя 42 мкл смешанных парамагнитных шариков, и отбрасывая 79,5 мкл супернатанта. С помощью трубок на магнитной подставке, пусть образцы воздушно-сухом состоянии при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин.
- Удалите стрип пробирки для ПЦР измагнитная подставка и добавьте 52,5 мкл буфера ресуспендирования в каждую пробирку. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение 2 мин. Место труб на магнитной подставке при комнатной температуре в течение 5 мин или пока жидкость не станет прозрачной. Передача 50 мкл супернатанта из каждой пробирки на новые 0,2 мл ПЦР-полосковых трубок. Будьте осторожны, чтобы не нарушить бусинки.
- Повторите промывание как описано в разделе 2.2.3 - 2.2.4, используя 50 мкл смешанных парамагнитных шариков, и отбрасывая 95 мкл супернатанта. С помощью трубок на магнитной подставке, пусть образцы воздушно-сухой при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин.
- Удалите полоску пробирки для ПЦР с магнитной подставкой и добавьте 22,5 мкл буфера для ресуспендирования в каждую пробирку. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать.
- Инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 2 мин. Место труб на магнитной подставке при комнатной температуре в течение 5 мин или пока жидкость не станет прозрачной. Передача 20 мкл супернатанта из каждой пробирки кНовый 0,2 мл ПЦР полосы трубки. Будьте осторожны, чтобы не нарушить бусинки. Это безопасная точка остановки и кДНК можно хранить при температуре -20 ° С в течение до 7 дней.
4. Библиотека Amplification
- Пополните фрагментов ДНК
- Извлеките основной смеси ПЦР, коктейль ПЦР-праймер и ресуспендирования буфера от -20 ° C хранения и оттаивания при комнатной температуре. Удалите бутылку парамагнитных шариков из хранения 4 ° C и дайте постоять в течение по крайней мере 30 минут, чтобы довести до комнатной температуры.
- Предварительная программа термоциклер со следующими параметрами: выберите опцию предварительного нагрева крышки и установить до 100 ° С, а затем установить первоначальную денатурации при 98 ° С в течение 30 сек, 15 циклов денатурации при 98 ° С в течение 10 сек, отжиг при 60 ° С в течение 30 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 30 секунд, один последний цикл удлинения при 72 ° С в течение 5 мин и выдержка при температуре 4 ° С. Сохранить эту программу как "ПЦР".
- Центрифуга талой мастер ПЦРперемешать и праймеры для ПЦР пробирки при 600 × г в течение 5 сек. Добавьте 5 мкл размороженных ПЦР-праймеров для каждой пробирки. Добавьте 25 мкл размороженного Master Mix ПЦР для каждой пробирки. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать.
- Поместите блокированы стрип пробирки для ПЦР в запрограммированный термоциклеру. Закройте крышку и запустить программу ПЦР. Когда ПЦР завершена, удалите трубки из термоциклеру и держать на льду.
- Повторите промывание как описано в разделе 2.2.3 - 2.2.4, используя 50 мкл смешанных парамагнитных шариков, и отбрасывая 95 мкл супернатанта. С помощью трубок на магнитной подставке, пусть образцы воздушно-сухом состоянии при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин.
- Удалить труб из магнитного стенда и добавьте 32,5 мкл буфера для ресуспендирования в каждую пробирку. Аккуратно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Поместите пробирки для ПЦР на магнитной подставке при комнатной температуре в течение 5 мин или пока жидкость не станет прозрачной. Затем перенесите 30 мкл суpernatant свежие 0,2 мл ПЦР-пробирки.
- Выполнить количественную оценку кДНК с использованием флуорометр 7 и определения качества кДНК с использованием системы электрофореза капиллярной 8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная точка остановки и кДНК можно хранить при температуре -20 ° С в течение до 7 дней. Примечание: Эта библиотека считается библиотека Секвенирование РНК.
Последующие шаги приводят к библиотеке Capture.
5. Гибридизация, захват и секвенирование
- Multiplexed гибридизация
- Удалить пользовательские гидратированных зондов, Cot-1 ДНК, универсальные блокирующие олигонуклеотиды и адаптер специфические блокирующие олигонуклеотиды от -20 ° C и оттаивают на льду.
- В низком привязывать 1,5 мл трубки, смешайте 500 нг ДНК (125 нг на образец при мультиплексировании 4 образца), 5 мкл Cot-1 ДНК (1 мкг / мкл), 1UL универсальные блокирующие олигонуклеотиды, 0,5 мкл P7 (6 нуклеотид) адаптер конкретных блокирующие олигонуклеотиды (эта сумма может потребоваться корректировка в зависимости от мультиплексной conditiУНС) и 0,5 мкл P7 (8 нуклеотид) адаптер специфические блокирующие олигонуклеотиды (эта сумма может потребоваться корректировка в зависимости от условий мультиплексов).
- Поместите пробирку в вакуумной концентратором с крышкой открытым, обращенной в противоположном направлении вращения. Содержание сухого вещества при 45 ° С в течение 20 мин или до полного испарения жидкости.
- Ресуспендируют высушенного содержание с 8,5 мкл 2х буфера гибридизации, 3,4 мкл гибридизация компонента А и 1,1 мкл нуклеазы свободной воды. Разрешить 10 минут для ресуспендирования и вихря через каждые 2,5 мин. Передача ресуспендировали-материала в 0,2 мл ПЦР-пробирку и инкубировать при 95 ° С в течение 10 мин на амплификатор.
- Удалить гибридизацию пробирку из термоциклеру и добавить 2 мкл пользовательских зондов ресуспендировали при концентрации 1,5 пмоль / мкл. В качестве альтернативы, добавить 4 мкл пользовательских зондов ресуспендировали при концентрации 0,75 пмоль / мкл. Инкубируйте реакции гибридизации в течение ночи (16 - 24 ч) при 65 ° С.
Примечание: Зонды, приобретенные у различных производителей могут быть использованы и инструкции изготовителя должны быть соблюдены. Продолжительность стадии гибридизации может также изменяться.
- Бусина Подготовка и захват
- Удалить бутылку стрептавидином в сочетании парамагнитными гранулами от 4 ° С и уравновешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Разбавьте 10х моющий Буферы (I, II, III, и Строгие) и 2.5x бисера промывочного буфера для создания 1x рабочие решения.
- Алиготе 140 мкл 1х промывочного буфера I в в свежую 1,5 мл трубки. Тепло все количество 1х строгого буфера и аликвоты 1x промывочного буфера I при 65 ° С в блоке тепла в течение по меньшей мере 2 ч.
- Алиготе 100 мкл стрептавидин-связанных парамагнитных шариков на захват в 1,5 мл трубки. Поместите на магнит и отбросить супернатант. Добавить 200 мкл шарик промывочного буфера на 100 мкл шариков и вихрь в течение 10 сек. Место на магнит для 2 - 5 мин или до супернатант ясно. После того, как супернатант ясно, снимите его и повторноторфа еще раз в общей сложности на двух стирок.
- После удаления шарика промывочного буфера, добавляют равный объем шарика промывочного буфера в качестве первоначального исходного объема (т.е. 100 мкл для одного захвата). Ресуспендируют и передачи в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Поместите трубку в магнитной стойке для 2 - 5 мин или до супернатант ясно. Удалите супернатант.
- С помощью обоих образца гибридизации и бусин в термоциклеру при 65 ° С, передавать гибридизацию смесь на бортовое трубки и пипетки вверх и вниз 10 раз, чтобы перемешать. Инкубировать при 65 ° С в течение 45 мин, вихря и спином вниз образца в течение 4 сек с использованием фиксированной скорости (6,0 XG) настольный мини-центрифугу.
- Бусина Wash
- Удалить захвата трубки из термоциклеру и добавить 100 мкл предварительно нагретую 1x промывочный буфер I к трубке и вихревые в течение 10 сек для смешивания. Передайте смесь свежей низкой привязывать 1,5 мл трубки. Поместите пробирку в магнитном стойке разделения и позволяют 2 - 5 мин для разделения или до супернатант ясно. Discard супернатант.
- Добавить 200 мкл подогретого 1x строгий промывочный буфер и пипеткой вверх и вниз 10 раз перемешать. Инкубируют при 65 ° С в течение 5 мин. Поместите пробирку в стойку магнитной сепарации и позволяют 2 - 3 мин для разделения или до супернатант ясно. Удалите супернатант. Повторите строгие мыть еще раз в общей сложности на двух стирок.
- Добавить 200 мкл 1x температура в помещении промывочный буфер I и вихревое течение 2 мин перемешать. Поместите пробирку в стойке магнитной сепарации и позволяя 2 - 5 мин для разделения или до супернатанта ясно. Удалите супернатант.
- Добавить 200 мкл 1x комнатная температура промывочный буфер II и вихрь в течение 1 мин перемешать. Поместите пробирку в стойке магнитной сепарации и позволяя 2 - 5 мин для разделения или до супернатанта ясно. Удалите супернатант.
- Добавить 200 мкл 1x комнатная температура промывочный буфер III и вихрь в течение 30 секунд, чтобы перемешать. Поместите пробирку в магнитном стойке сепарации, позволяющей 2 - 5 мин для разделения или до супернатантачисто. Удалите супернатант.
- Снимите трубку из стойки магнитной сепарации и добавляют 20 мкл нуклеазы без воды ресуспендирования бисером. Тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 10 раз.
- После захвата ПЦР - амплификация
- Удалить парамагнитными гранулами от 4 ° С и уравновешивают при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалите горячий старт ПЦР Ready Mix (2x) и ПЦР-праймер смеси от -20 ° С и оттепели при комнатной температуре, а затем поместить на лед. Подготовка библиотеки усиления Master Mix путем объединения 27,5 мкл 2x горячего старта PCR Ready Mix с 2,75 мкл ПЦР-праймер 1 и 2,75 мкл ПЦР-праймера 2 (эти объемы за 1 гибридизация библиотеки плюс 10% -ный избыток).
- Установка реакция в ПЦР-пробирку, добавляя 20 мкл бус плюс захваченный ДНК с 30 мкл библиотеки амплификации мастер-смеси общим объемом 50 мкл. Крышка трубки правильно и вихревая перемешать. Центрифуга пробирки в течение 4 секунд с использованием мини-вкладки с фиксированной скоростьюле-центрифуга 6,0 х г.
- Настройте следующую программу ПЦР: выберите опцию предварительного нагрева крышки и установить до 100 ° С, а затем установить первоначальную денатурации при 98 ° С в течение 45 сек, 10 - 12 циклов денатурации при 98 ° С в течение 15 секунд, отжиг при 65 ° С в течение 30 с и удлинение при 72 ° С в течение 60 секунд, один последний цикл удлинения при 72 ° С в течение 60 секунд и держать при температуре 4 ° С.
- Удалить образец из амплификатор и добавить 75 мкл парамагнитных шариков. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Поместите трубки на магнит при комнатной температуре в течение 2 - 3 мин, а затем удалить супернатант. Мытье бусинки на магните путем добавления 200 мкл 80% этанола, инкубирование в течение 30 сек с последующим удалением надосадочной жидкости. Повторить в общей сложности двух 80% стирок.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин, чтобы позволить бусин высохнуть. Не более сухой к образованию трещин. Ресуспендируют бусины в 22 мкл Трис-ЭДТА рН 8,0 (1x TE Solution) и позволяют 3 мин для элюции. Поместите образец на магнит в течение 3 - 5 мин гоен передачи 20 мкл элюированного продукта к свежему низкой связывают 1,5 мл трубки, гарантируя отсутствие бусин переносятся.
- Выполнение количественной оценки захваченных кДНК с использованием флуорометр 7 и определяют качество захваченного кДНК с использованием системы электрофореза капиллярной 8.
- Desktop секвенсор Процедура загрузки 9
- Развести захваченный библиотеки кДНК до конечной концентрации 4 нм с использованием 10 мМ Трис-Cl рН 8,5 с 0,1% твина 20. оттепели 10 N NaOH, и буфер гибридизации на льду. Примерно за 30 минут до использования, оттепель рабочего стола секвенсор v2 Набор реагентов коробки 1 в РТ воде. Не заливайте выше MAX питающая линия 10. Обратите внимание, что это конкретная процедура секвенирование платформы и может изменяться в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Приготовьте 1мл 0,2 N NaOH путем объединения 20 мкл 10 N NaOH с 980 мкл нуклеазы свободной воды в микроцентрифужных трубки (всегда готовятся свежие). Развести библиотеку PhiX (библиотека управления) до 4 нмобъединения 2 мкл 10 управления библиотекой нм с 3 мкл 10 мМ Трис-Cl рН 8,5 с 0,1% Tween 20.
- Денатурации окончательной библиотеки и управления библиотекой путем объединения 5 мкл библиотеки 4nm с 5 мкл 0,2 N NaOH и вихрем кратко перемешать. Центрифуга пробирки в течение 4 секунд с использованием фиксированной скорости мини настольный центрифуге при 6,0 х г. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин для денатурации библиотек.
- Добавьте 990 мкл предварительно охлажденного буфера гибридизации в пробирки, содержащие 10 мкл денатурированных библиотек. Это приводит к библиотеке 20 пм. Марк денатурированный 20 пМ библиотека с датой и может храниться в течение 3 недель при температуре -20 ° C.
- Смешайте 375 мкл 20 пМ библиотеки управления с 225 мкл предварительно охлажденного буфера гибридизации и разбавленного контроля библиотеки, чтобы привести в библиотеке управления 12,5 пм. Инверсия несколько раз, чтобы перемешать раствор.
- Объединить 594 мкл денатурированного окончательной библиотеки с 6 мкл 12,5 мкМ денатурированного управления библиотекой и вихрем перемешать. Установите комбинированный SAMPбиблиотека ле и управления библиотекой в сторону на льду, пока образцы не будут готовы к загрузке в картридж реагента для рабочего секвенсор.
Анализ 6. Данные
- Оценка качества Последовательность
- Рассчитывают качество данных сырых последовательности (fastq файлов) с использованием оценки качества последовательности 11.
Примечание: Этот шаг позволяет оценить данные, прежде чем он дополнительно подвергают анализу ниже по течению. Программное обеспечение работает со встроенными параметрами и производит набор метрик для каждого файла fastq.
- Рассчитывают качество данных сырых последовательности (fastq файлов) с использованием оценки качества последовательности 11.
- центровка
- Выровнять последовательности считывает (fastq файлы) в геноме hg19 ссылка человека и транскриптом с использованием Tophat2 12 (версия 2.0.10), обеспечивая при этом известные транскриптов в виде файла GTF. Выход в виде двоичного формата выравнивания называемый файлом БАМ.
- Выполните шаги постобработки включая сортировку и индексацию с использованием Samtools 13 (версия 0.1.19) На файл БАМ. Выполните дубликат маркировки, переназначения SAM, вставить расчет размера и добавления или замены чтения групп с помощью инструментов Пикара 14 (версия 1.84).
- Оценка качества Секвенирование РНК
- Рассчитайте ряд метрик контроля качества для данных Секвенирование РНК с использованием оценки качества Секвенирование РНК. Исходные данные для этого программного обеспечения является BAM файл 15 из выравнивания Tophat2. Выходной сигнал представляет собой HTML - файл , который перечисляет общее количество чтения, дубликатов, отображенных чтения процент и процент рРНК и т.д., среди других.
- Вариант Призвание
- Используйте ЗВЕЗДУ (версия 2.4.0) 16 для выравнивания , а затем вызвать однонуклеотидным варианты с использованием GATK ( в версии 3.3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM шаги постобработки и критерии фильтрации для флага и удаления ложных срабатываний от выхода.
- Экспрессия генов
- Вычислить экспрессии генов USIнг Запонки программного обеспечения (версия 2.1.1) из Tuxedo пакета 18.
Примечание: Входной является BAM файл из Tophat2 инструмента выравнивания. Выход производится на изоформы, генов и транскриптов уровне, где выражение вычисляется как FPKM (Фрагменты на килобаза на миллион Mapped прочтений).
- Вычислить экспрессии генов USIнг Запонки программного обеспечения (версия 2.1.1) из Tuxedo пакета 18.
- Fusion Призвание
- Вызов слитые из каждого образца с использованием ChimeraScan 19 (версия 0.4.5), TopHat Fusion 20 пользовательских и Труп 21. Аннотирования слитые для доменов , использующих Oncofuse 22 (версия 1.0.9b2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематическое освещающих ключевые шаги в Секвенирование РНК Capture показан на рисунке 1. Четыре раковые клеточные линии с известными мутациями были использованы для демонстрации эффективности метода Секвенирование РНК Capture (K562 с ABL1 фьюжн, LC2 с RET фьюжн, EOL1 с PDGFRalpha фьюжн и RT- 4 с фьюжн FGFR3). Четыре образца были объединены вместе и секвенировали с 2x 100 п.н. считывает на настольном секвенсор, который генерирует FASTQ файлы. FASTQ файлы были проведены с помощью анализа трубопровода Секвенирование РНК, который включает в себя пять основных компонентов: 1) оценка контроля качества, 2) выравнивание к человеческому транскриптома, 3) экспрессия гена количественной оценки, 4) слияние телефонных и 5) вариант вызова. Файл выравнивания (BAM) используется для вызова одиночных нуклеотидных вариантов и рассчитать экспрессию генов. Гибриды вызываются с помощью слияния вызывающих абонентов, таких как TopHat Fusion (выполнение их собственного выравнивания), а выход аннотированный USINг программное обеспечение для обнаружения слияния.
Сравнение экспрессии генов от Секвенирование РНК и захвата демонстрирует обогащение целевых стенограммы от 10 до 1000 раз с использованием метода захвата (рис 2А). Кроме того, на фиг.2В показано увеличение процентов считывает отображение в соответствующие регионы транскриптов с помощью захвата по сравнению с Секвенирование РНК. Оценка мер контроля качества представлена на рисунке 3. Захват и Секвенирование РНК работают одинаково с точки зрения выравнивания к транскриптома (3A, 94% против 93%) , а средний размер вставки (3B, 174 пар оснований против 162 б.п.). С помощью метода захвата, более высокий процент exonic областей секвенируют (3C, 77% против 60%), и , наоборот , более низкий процент интронных областей секвенируют (3D, 4% против 20%). Всего на счету чтения на выборку изображены в 3Е (3F, 4% против 15%).
Выход обнаружения Fusion показано в таблице 1 , генерируется с нормированными фьюжн поддержки чтения. Захват Секвенирование РНК была успешной в выявлении слитые для всех четырех клеточных линий. Сравнение отдельных вариантов нуклеотидных называемых в пересекающихся областях захвата и Секвенирование РНК отображается на рисунке 4. Это демонстрирует высокую согласованность между вариантами захвата и Секвенирование РНК в целевом регионе.
Рисунок 1. Схема Секвенирование РНК Захват шагов. В этой экспериментальной демонстрации, РНК сначала depleTed рибосомальной РНК, с последующей химической фрагментации и синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы. Далее, кДНК Полиаденилированная и лигировали на обоих концах для конкретных платформ адаптеров для создания библиотеки. Только библиотеки кДНК с надлежащими адаптерами, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Библиотеки затем гибридизуют пользовательских зондов олигонуклеотидных и захвачено с использованием магнитных шариков. Это небольшое количество захваченной библиотеки должен быть усилен во второй раз, чтобы иметь достаточно для следующего поколения последовательности. Несколько библиотек можно затем секвенировали параллельно. Секвенирование данные анализируются для РНК событий , представляющих интерес , таких как ген слитых, экспрессии или мутации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Comparison целевых генов в Capture против Секвенирование РНК. А, Джин сравнения экспрессии между улавливанию и Секвенирование РНК в четырех линиях раковых клеток К562, LC2, EOL1 и RT-4 , измеренных на килобаза читает на миллион отображенной читает (FPKM) (логарифмическая шкала). Адресные интерес генов обогащены (синий) по сравнению с нецелевых генов (серым цветом). B, Процент чтений отображения в целевом регионе увеличивается в Capture по сравнению с библиотеками Секвенирование РНК в четырех линиях раковых клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
Рисунок 3. Секвенирование Метрики Capture против Секвенирование РНК в четырех Представитель рака клеточных линий. А, Процент читает отображение на транскриптома,
| Клеточная линия | сращение | Type Library | Общее Читает | На Target Читает | Нормализованная Fusion Поддержка Читает (NFSR) | ||
| TophatFusion | ChimeraScan | TRUP | |||||
| K562 | BCR-ABL | Секвенирование РНК | 150300482 | 279438 | 0 | 438 | 0 |
| Захватить | 9341148 | 7566087 | 598 | 343 | 0 | ||
| LC2 | CCDC6-RET | Секвенирование РНК | 128861790 | 307566 | 0 | 97 | 0 |
| Захватить | 12320692 | 10314284 | 71 | 44 | 6 | ||
| EOL1 | FIP1L1-PDGFRA | Секвенирование РНК | 135321406 | 225222 | 0 | 0 | 170 |
| Захватить | 9317418 | 7680818 | 143 | 0 | 7 | ||
| RT4 | FGFR3 -TACC3 | Секвенирование РНК | 161350024 | 208741 | 0 | 131 | 469 |
| Захватить | 8305950 | 6563574 | 358 | 88 | 34 | ||
Таблица 1. Обнаружение Fusion для захвата против Секвенирование РНК из К562, LC2, EOL1 и РТ-4. Эта таблица показывает четыре линии раковых клеток и три различных алгоритмов обнаружения слияния, TopHat2, ChimeraScan и TRUP , используемые в этой демонстрации. Эта таблица демонстрирует способность обнаруживать слитые с захватом с использованием менее 10 миллионов всего чтений по сравнению с более чем 60 миллионов чтений используется для Секвенирование РНК. Fusion поддерживающий чтений были рассчитаны путем деления слияния с поддержкой чтения на киназа читает, умноженный на один миллион.
"Рисунок 4" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54090 / 54090fig4.jpg" />
Рисунок 4. SNV вызова для захвата против Секвенирование РНК. Эти диаграммы Венна показывают количество однонуклеотидных вариантов (SNVs) , которые были обнаружены улавливанию и Секвенирование РНК для каждого из четырех клеточных линий (К562, LC2, EOL1 и РТ-4). Это иллюстрирует высокую согласованность SNVs между улавливанию и Секвенирование РНК в целевом-регионе:. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) и РТ-4 (73,9%) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию эта фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Секвенирование РНК Захват является промежуточным между стратегией и Секвенирование РНК микрочипов подходы к оценке выбранной части транскриптома. Преимущества Capture включают сокращение затрат, быстрое время обработки данных на настольном секвенсор, высокой пропускной способности и выявления геномных изменений. Этот метод может быть адаптирован для характеристики РНК 23 некодирующих, обнаружение единичных нуклеотидных вариантов 4-6, исследовать сплайсинг РНК, а также для идентификации генов слитые или структурные перестройки 24. Кроме того, этот подход может быть применен к клиническим или обработанных образцах , которые были подвергнуты фиксации формалином и заливали в парафиновые блоки 24,25.
Есть несколько существенных преимуществ захвата Секвенирование РНК по сравнению с микрочипом, в режиме реального времени количественный ПЦР, Sanger секвенирования и секвенирования ДНК. Микрочипов ограничено высоким фоном из-за перекрестной гибридизации и неспецифического связывания зондов. Количественное генов с лвл выражение ограничено из - за фонового шума, в то время как высокий уровень экспрессии гена измерения зависят от насыщения сигнала 1. По сравнению с захватом Секвенирование РНК, ПЦР в реальном времени оказывается трудно воспроизвести. Кроме того, Секвенирование РНК позволяет для обнаружения новых транскриптов, требует меньше начальной исходного материала и может обнаружить альтернативный сплайсинг 26 .в контраст по отношению к Sanger секвенирования Секвенирование РНК обеспечивает более высокую пропускную способность и анализа низкой выраженной микроРНК. Sanger секвенирования оказалось ценным инструментом для проверки слитых с известными экзон-экзона перекрестков и соматические мутации ДНК, однако идентификация новых слитых тормозится требованиями априорной кандидата точки останова. Секвенирование ДНК не является экономически эффективным, требует большего пространства для хранения данных, и не в состоянии обнаружения посттранскрипционных модификаций.
Есть несколько важных шагов, участвующих в Секвенирование РНК Capture. Во-первых, для повышения урожайности библиотечных продуктов изРНК / кДНК конкретных парамагнитные шарики и парамагнитные шарики во время мытья, будьте осторожны, чтобы не более сушки гранул, что приведет к потере урожая. Кроме того, не под-сушки гранул, обеспечивают весь этанол удаляют из пробирок, как этанол может уменьшить выход кДНК. Во- вторых, гибридизация библиотек кДНК с комплементарными зондами зависит от постоянной температуры, мы рекомендуем согревающее промывочный буфер I и Строгий буфер до 65 ° С в течение по меньшей мере двух часов заранее. Кроме того, после гибридизации необходимо для поддержания 65 ° С в течение связывания и мыть шагов. Зонды, используемые здесь, были разработаны для экзонов генов, представляющих интерес для разработки лекарственных средств, включая киназ, генов, участвующих в общих перестроек, таких как факторы транскрипции и ведению домашнего хозяйства генов. Кроме того, содержание генов настраивается и размеры захвата панели может варьироваться. Кроме того, как новая информация о геномных областей возникает, дополнительные датчики могут быть разработаны и добавлены к тон существующей панели захвата.
Оценка показателей выравнивания, а именно на целевой скорости, предоставляет информацию о том, как хорошо обогатилась целевой регион. Низкий уровень на мишени может быть из-за неудачной гибридизации и захвата, в результате чего желаемый целевой регион не был захвачен и обогащенным. В этом случае, повторная гибридизация и захват множества библиотек должна быть выполнена. Низкий уровень на мишени может быть также из-за отказа истощать рРНК, который может быть подтвержден путем вычисления процентного содержания рРНК в образцах. Высокий процент рРНК в образце будет требовать повторной подготовки образца, начиная с истощением рРНК. Кроме того, если концентрация библиотека падает ниже требований, предъявляемых к гибридизации и захвата, было бы целесообразно, чтобы оптимизировать количество исходного входа для данного типа образца и качества (диапазон: 50-1,000 нг).
Хотя Есть несколько преимуществ для целевых приложений Секвенирование РНК, существуют также ограничениярассматривать. Образцы с низким качеством РНК на основе RIN или степени фрагментации может не дать библиотек качества для секвенирования. Несколько групп продемонстрировали успех с формалином фиксированных залитых парафином образцов, однако есть образцы , которые не будут проходить для секвенирования 24,25,27. Кроме того, поскольку Секвенирование РНК Capture фокусируется на известных транскриптов, она теряет преимущества беспристрастной Секвенирование РНК для романа или Неаннотированный транскриптов. Кроме того, для обнаружения SNP, методы Секвенирование РНК можно обнаружить только мутации в выраженных транскриптов.
Будущие возможности Секвенирование РНК включают Capture исследований и клинического применения. Недавнее открытие тысяч длинных некодирующие РНК и их роль в биологии потребует целенаправленной характеристику. В клинике Секвенирование РНК Capture может распространяться за пределы тестирования исследований и перевести на клинические анализы, чтобы охарактеризовать человека заболеваний, таких как рак, инфекционные заболевания, и неинвазивного тестирования. В сочетании с геномной секвенирования approaчес, Секвенирование РНК Захват может быть интегрирован для изучения и характеризуют выраженный геном.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits (24 or 96 reactions) | Roche NimbleGen | 05634261001 or 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| Chloroform | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Dry Bath | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
- Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
- Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
- Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
- Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
- Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
- Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
- Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
- Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
- Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
- DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
- Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
- Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
- Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
- Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
- Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
- Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
- Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
- Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).
