Abstract
RNA-sekvensering (RNAseq) är en mångsidig metod som kan användas för att detektera och karakterisera genuttryck, mutationer, genfusioner, och icke-kodande RNA. Standard RNAseq kräver 30-100.000.000 sekvense läser och kan innehålla flera RNA-produkter såsom mRNA och icke-kodande RNA. Vi visar hur riktad RNAseq (capture) medger en fokuserad studie på utvalda RNA-produkter med en stationär sequencer. RNAseq fånga kan karakterisera utan not, låga, eller övergående uttryckta transkript som annars kan missas med traditionella RNAseq metoder. Här beskriver vi utvinning av RNA från cellinjer, ribosomalt RNA utarmning, cDNA-syntes, förberedelse av streckkodade bibliotek, hybridisering och fånga riktade transkript och multiplex sekvense på en stationär sequencer. Vi beskriva också beräknings analys pipeline, vilket inkluderar kvalitetskontroll bedömning, anpassning, fusion upptäckt, genuttryck kvantifiering och identifiering av enstaka nucAleotide varianter. Denna analys möjliggör riktad avskrift sekvensering för att karakterisera genuttryck, genfusioner och mutationer.
Protocol
Obs: Detta protokoll beskriver samtidig bearbetning och analys av fyra prover. Denna metod är kompatibel med RNA isolerat från celler, färskfryst vävnad och formalinfixerad paraffininbäddad vävnad (FFPE). Detta protokoll börjar med 50 - 1000 ng (250 ng rekommenderas) att starta RNA ingång för varje prov.
1. rRNA Utarmning och fragmentering av RNA ordningen
- rRNA Utarmning
- Ta eluerar, början, fragment mix, rRNA borttagning mix, rRNA bindningsbuffert och resuspensionsbuffert från -20 ° C och tina vid rumstemperatur. Ta elueringsbuffert, rRNA borttagning pärlor och RNA / cDNA specifik paramagnetiska pärlor från 4 ° C och sätta till rumstemperatur.
- Lägga 0,25 mikrogram av RNA till PCR-rör. Späd ut den totala RNA med nukleasfritt ultra-rent vatten till en total slutlig volym av 10 pl. Tillsätt 5 pl rRNA bindningsbuffert till varje rör tillsätt sedan 5 pl rRNA borttagning mix och försiktigt pipette upp och ner för att blanda. Placera rören i termocyklern med lock som förvärmts till 100 ° C och programtermocykler till 68 ° C under 5 min för att denaturera RNA.
- Efter RNA-denaturering, ta bort rören från termocyklern och inkubera vid rumstemperatur i 1 min. Vortex rRNA borttagning pärla röret kraftigt för att resuspendera kulorna. Lägg 35 pl rRNA borttagning pärlor till nya rör och överföra RNA denatureringsreaktionen (20 ^) till rör innehållande rRNA borttagning pärlor.
- Justera pipett till 45 pl och pipett snabbt upp och ner 20x att blanda. Inkubera rören vid RT under 1 min. Placera sedan rör i magnetisk stå vid rumstemperatur under 1 minut. Överför supernatanten till nya märkta PCR-rör och placera rören igen i magnetisk stå vid rumstemperatur under 1 minut. Detta säkerställer att inga pärlor överförs. Överför supernatanten till nya märkta PCR-rör.
- Vortex RNA / cDNA specifik paramagnetiska pärlor och tillsätt 99 pl av pärlor till varje rör. Försiktigt pipett helavolym upp och ner 10x att blanda. Om börjar med degraderad-RNA, tillsätt 193 pl välblandad RNA / cDNA specifika paramagnetiska pärlor till varje rör. Inkubera vid RT i 15 min. Placera sedan rören på den magnetiska stå vid rumstemperatur under 5 min. Ta bort och kassera supernatanterna.
- Tillsätt 200 pl av nyframställd 70% etanol (EtOH). Håll rören på magnetisk stå och vara noga med att inte störa pärlorna. Inkubera vid rumstemperatur i 30 sekunder, sedan bort och kassera supernatanten. Tillåta rören stå vid rumstemperatur under 5 - 10 minuter för att torka.
- Centrifug tinade rumstemperatur elueringsbuffert vid 600 x g under 5 sek. Lägga 11 ul av elueringsbuffert till varje rör och försiktigt pipettera upp och ner 10x att blanda. Inkubera rören vid RT under 2 min. Placera rören på magnetiskt stativ vid rumstemperatur under 5 min. Överföra 8,5 | il av supernatanten till nyligen märkta PCR-rör.
- Fragmentering av rRNA urladdat RNA
- Lägga 8,5 pl elute, 8,5 | il prime, och 8,5 | il fragment blandning till varje rör. pipett försiktigt upp och ned 10x att blanda. Placera rören i termocyklern med följande program: för-uppvärmt lock till 100 ° C, 94 ° C under 8 minuter, därefter 4 ° C hold.
Anmärkning: Detta steg är utformat för att generera en genomsnittlig insertstorlek på 155 bp. Om den genomsnittliga fragmentstorleken av RNA-prov är lägre än 200 bp, hoppa över detta steg och gå vidare till First Strand cDNA syntes.
- Lägga 8,5 pl elute, 8,5 | il prime, och 8,5 | il fragment blandning till varje rör. pipett försiktigt upp och ned 10x att blanda. Placera rören i termocyklern med följande program: för-uppvärmt lock till 100 ° C, 94 ° C under 8 minuter, därefter 4 ° C hold.
2. cDNA-syntes
- Syntetisera First Strand cDNA
- Ta första strängsyntesen mix från -20 ° C och tina vid rumstemperatur.
- Pre-program termocyklern med följande inställningar: värm lock alternativ och inställd på 100 ° C, därefter 25 ° C under 10 minuter, 42 ° C under 15 minuter, 70 ° C under 15 minuter och håll vid 4 ° C . Spara filen som "Synthe en st Strand."
- Centrifug tinade-första strängsyntes mix rör vid 600 & #215; g i 5 sek. Blanda 1 l omvänt transkriptas med 9 il första strängsyntes mix.
- Tillsätt 8 pl första strängsyntes och omvänt transkriptas mix till varje rör försiktigt pipettera upp och ner 6x att blanda. Centrifugrör för fyra sekunder med hjälp av en fast hastighet mini bordscentrifug vid 6,0 xg för att få vätska till botten. Placera rören i termocyklern och välj Synthe en st Strand. När värmecykeln når 4 ° C, ta bort rören och fortsätt omedelbart att syntetisera andra Strand cDNA.
- Syntetisera andra Strand cDNA
- Förvärmning termocykler till 16 ° C med lock som förvärmts till 30 ° C. Tina andra strängen Master Mix och resuspension buffert på is. I förväg, ta ut flaskan av paramagnetiska pärlor från 4 ° C och låt stå i minst 30 minuter för att föra dem till rumstemperatur.
- Tillsätt 5 | il av resuspension buffert till varje PCR-rör. Centrifug andra strängen huvudblandning på 600X g under 5 sek och tillsätt 20 | il till varje PCR-rör. Placera rören i förvärmd termocyklern vid 16 ° C under 1 timme. När inkubationen är avslutad, ta bort från termocyklern och tillåta rören att komma till rumstemperatur.
- Vortex de paramagnetiska pärlorna tills de är väl spridda. Lägg 90 il väl blandad paramagnetiska pärlor till varje rör. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda. Inkubera rören vid rumstemperatur under 15 min. Placera rören på den magnetiska stå vid rumstemperatur under 5 min.
- Ta bort och kassera 135 pl supernatant sedan lämna rören på den magnetiska monter för att utföra EtOH tvätt. Tillsätt 200 | il nyberedd 80% EtOH till varje rör utan att störa pärlorna, sedan inkubera vid rumstemperatur under 30 sek. Ta bort och kasta alla supernatanten från vardera. Upprepa för totalt två 80% EtOH tvättar.
- Låt rören stå vid rumstemperatur under 5 - 10 minuter för att torka på den magnetiska stativ. Centrifugera den upptinade rums Temperature resuspension buffert vid 600 x g under 5 sek. Ta bort PCR-rör från magnetisk monter. Lägg 17,5 l resuspension buffert till varje PCR-rör och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10x att blanda väl. Inkubera rören i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Placera rören på den magnetiska stå vid rumstemperatur under 5 min, sedan överföra 15 | il supernatant (dubbelsträngat cDNA) till 0,2 ml PCR-remsor rör.
OBS: Detta är en säker stoppställe som cDNA kan lagras vid -20 ° C i upp till 7 dagar.
3. Bibliotek Framställning
- Adenylat 3'-ändarna
- Ta bort A-handel mix från -20 ° C och tina vid rumstemperatur. Pre-program termocyklern med följande inställningar: välj före värmelock alternativ och inställd på 100 ° C, sedan in vid 37 ° C under 30 minuter, 70 ° C under 5 min och håll vid 4 ° C. Spara filen som "ATAIL70."
- Tillsätt 2,5 pl av resuspensionbuffert till varje rör. Lägg sedan till 12,5 il tinat A-svans mix. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda väl. Placera rören i termocyklern och välj ATAIL70. När värmecykeln temperaturen är vid 4 ° C, avlägsna PCR-rören från termocykelanordning och fortsätt omedelbart att ligera adaptorer.
- Ligera Adaptrar
- Ta lämpliga RNA adapter rör, stoppa ligeringsbuffert och resuspensionsbuffert från -20 ° C och tina vid rumstemperatur. Ta inte bort ligeringsblandningen röret från -20 ° C till dess att uppmanas att göra det i protokollet. Ta flaskan med paramagnetiska pärlor från 4 ° C och låt stå i minst 30 minuter för att få till rumstemperatur.
- Värm termocyklern till 30 ° C och välj före värmelock alternativ och inställd på 100 ° C. Centrifugera de upptinade RNA adapter rören vid 600 xg under 5 sek. Omedelbart före användning, ta bort ligeringsblandningen röret från -20 ° Clagring.
- Tillsätt 2,5 pl av resuspension buffert till varje provrör. Tillsätt 2,5 pl av ligeringsblandningen. Återgå ligeringsblandningen röret till -20 ° C lagring omedelbart efter användning. Tillsätt 2,5 pl av den tinade RNA adapter index till varje provrör. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda väl.
- Centrifugrör för fyra sekunder med hjälp av en fast hastighet mini bordscentrifug vid 6,0 x g. Placera rören i den förvärmda termocykelapparat. Stäng locket och inkubera vid 30 ° C under 10 min.
- Ta bort rören från termocykler och tillsätt 5 pl stopp ligeringsbuffert till varje rör för att inaktivera ligatur. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda väl.
- Upprepa tvätta som beskrivs i 2.2.3 - 2.2.4, med hjälp av 42 pl blandad paramagnetiska pärlor, och kasta 79,5 pl supernatant. Med rören på magnetstativ, låt prover lufttorka vid rumstemperatur i 5-10 min.
- Avlägsna PCR-band rör frånmagnetiska stå och lägga 52,5 l resuspension buffert till varje rör. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda väl. Inkubera rören vid rumstemperatur under 2 min. Placera rören på magnetiskt stativ vid RT under 5 min eller tills vätskan är klar. Överför 50 ul av supernatanten från varje rör till nya 0,2 ml PCR-band rör. Se till att inte störa pärlorna.
- Upprepa tvätta som beskrivs i 2.2.3 - 2.2.4, med användning av 50 pl blandad paramagnetiska pärlor, och kasta 95 pl supernatant. Med rören på magnetstativ, låt prover lufttorka vid RT under 5 - 10 min.
- Avlägsna PCR-band rören från den magnetiska stå och lägga 22,5 l resuspension buffert till varje rör. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda väl.
- Inkubera rören vid RT under 2 min. Placera rören på den magnetiska stå vid rumstemperatur under 5 min eller tills vätskan är klar. Överföring 20 | j, l supernatanten från varje rör till ennytt 0,2 ml PCR-band rör. Se till att inte störa pärlorna. Detta är en säker stoppunkt och cDNA kan lagras vid -20 ° C i upp till 7 dagar.
4. Bibliotek Amplifiering
- Berika DNA-fragment
- Avlägsna PCR Master Mix, PCR-primer cocktail och resuspensionsbuffert från -20 ° C lagring och tina vid rumstemperatur. Avlägsna flaska paramagnetiska pärlor från 4 ° C lagring och låt stå i minst 30 minuter för att få till rumstemperatur.
- Pre-program termocyklern med följande inställningar: välj före värmelock alternativ och inställd på 100 ° C, sedan in initial denaturering vid 98 ° C under 30 sekunder, 15 cykler av denaturering vid 98 ° C under 10 sekunder, hybridisering vid 60 ° C under 30 sekunder, och förlängning vid 72 ° C under 30 sek, ett slutligt förlängningscykel vid 72 ° C under 5 min och håll vid 4 ° C. Spara filen som "PCR".
- Centrifugera den upptinade PCR Masterblanda och PCR-primrar rören vid 600 xg under 5 sek. Tillsätt 5 pl tinade PCR primers till varje provrör. Tillsätt 25 pl tinade PCR Master Mix till varje provrör. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda väl.
- Placera utjämnade PCR remsor rör i den förprogrammerade termocyklern. Stäng locket och köra PCR-programmet. När PCR är klar, ta bort rören från termocykeln och hålla på is.
- Upprepa tvätta som beskrivs i 2.2.3 - 2.2.4, med användning av 50 pl blandad paramagnetiska pärlor, och kasta 95 pl supernatant. Med rören på magnetstativ, låt prover lufttorka vid rumstemperatur i 5-10 min.
- Ta rören från den magnetiska stå och lägga 32,5 l resuspension buffert till varje provrör. pipett försiktigt hela volymen upp och ner 10x att blanda väl. Inkubera vid RT i 2 min. Placera PCR-rören på den magnetiska stå vid rumstemperatur under 5 min eller tills vätskan är klar. Sedan överföra 30 pl SUpernatant till färska 0,2 ml PCR-rör.
- Utför kvantifiering av cDNA med användning av en fluorometer 7 och bestämma cDNA kvalitet med hjälp av ett kapillärelektrofores-system 8.
OBS: Detta är en säker stoppunkt och cDNA kan lagras vid -20 ° C i upp till 7 dagar. Obs: Detta bibliotek anses vara en RNAseq bibliotek.
Efterföljande steg leder till en Capture bibliotek.
5. Hybridisering, Capture och sekvensering
- multiplexerade Hybridisering
- Ta bort anpassade hydrerade sonder, Cot-1-DNA, universella blockerande oligos och adapterspecifika blockerings oligos från -20 ° C och tina på is.
- I en låg bind 1,5 ml rör, kombinera 500 ng DNA (125 ng per prov när multiplexering 4 prover), 5 pl Cot-1-DNA (1 mikrogram / l), 1UL universella blockerande oligos, 0,5 pl P7 (6 nukleotid) adapter specifik blockerande oligos (detta belopp kan behöva justeras beroende på multiplex conditions) och 0,5 l P7 (8 nukleotid) adapter specifika blockerings oligos (detta belopp kan behöva justeras beroende på multiplex villkor).
- Placera provröret i ett vakuum koncentrator med locket öppet vänd mot motsatt rotationsriktning. Torrhalter vid 45 ° C under 20 min eller tills fullständig förångning av vätskan.
- Resuspendera torkade innehåll med 8,5 pl 2x hybridiseringsbuffert, 3,4 l hybridisering komponent A och 1,1 l nukleas fritt vatten. Låt 10 minuter för resuspension och vortexa var 2,5 minuter. Överföra återsuspenderades-material till en 0,2 ml PCR-rör och inkubera vid 95 ° C under 10 min på en termocykelapparat.
- Avlägsna hybridisering provrör från termocyklern och tillsätt 2 pl av anpassade sonder återsuspenderade i en koncentration av 1,5 pmol / | il. Alternativt, tillsätt 4 ^ il av anpassade sonder återsuspenderade i en koncentration av 0,75 pmol / | il. Inkubera hybridiseringsreaktion över natten (16-24 h) vid 65 ° C.
OBS: Sonds inköpta från olika leverantörer kan användas och tillverkarens instruktioner ska följas. Varaktigheten av hybridiseringssteget kan också variera.
- Bead Förberedelser och Capture
- Ta flaska streptavidin-kopplade paramagnetiska pärlor från 4 ° C och jämvikt vid rumstemperatur i 30 minuter. Späd 10x tvättbuffertar (I, II, III, och stränga) och 2.5x Bead tvättbuffert för att skapa 1x arbetslösningar.
- Alikvotera 140 pl 1x tvättbuffert I till en ny 1,5 ml rör. Värme hela mängden 1x stränga buffert och delprov 1x tvättbuffert I vid 65 ° C i ett värmeblock under åtminstone två timmar.
- Alikvot 100 pl streptavidin-kopplade paramagnetiska pärlor per infångning i ett 1,5 ml rör. Placera på magnet och kassera supernatanten. Tillsätt 200 pl pärla tvättbuffert per 100 pl pärlor och vortex under 10 sekunder. Placera på magnet för 2-5 minuter eller tills supernatanten är klar. När supernatanten är klar, kassera den och retorv gång för totalt två tvättar.
- Efter avlägsnande av pärla tvättbuffert, tillsätt lika stor volym pärla tvättbuffert som initiala startvolymen (dvs 100 ul för en fångst). Resuspendera och överföring till en 0,2 ml PCR-rör. Placera röret i magnetisk rack för 2-5 minuter eller tills supernatanten är klar. Släng supernatanten.
- Med både prov hybridisering och pärlor i värmecykel vid 65 ° C, överföra hybridiseringsblandning till pärla röret och pipett upp och ner 10x att blanda. Inkubera vid 65 ° C under 45 min, vortex och centrifugera ner provet i 4 sek med användning av en fast hastighet (6,0 xg) bordsskiva minicentrifug.
- Bead Wash
- Ta fånga röret från termocykeln och tillsätt 100 pl förvärmd 1x tvättbuffert I till röret och vortexblanda i 10 sekunder för att blanda. Överför blandningen till ett färskt låg bind 1,5 ml rör. Placera röret i en magnetisk separationsställ och tillåta 2-5 min för separation eller tills supernatanten är klar. Discard supernatant.
- Tillsätt 200 | il förvärmd 1x stringent tvättbuffert och pipettera upp och ner 10 gånger för att blanda. Inkubera vid 65 ° C under 5 min. Placera röret i den magnetiska separationsställ och tillåta 2-3 min för separation eller tills supernatanten är klar. Släng supernatanten. Upprepa stringent tvätt en gång mer för totalt två tvättar.
- Tillsätt 200 | il rumstemperatur 1 x tvätt buffert I och vortexblanda i 2 min för att blanda. Placera röret i den magnetiska separationsställ och tillåta 2-5 min för separation eller tills supernatanten är klar. Släng supernatanten.
- Tillsätt 200 pl rumstemperatur 1x tvättbuffert II och skaka i 1 minut för att blanda. Placera röret i den magnetiska separationsställ och tillåta 2-5 min för separation eller tills supernatanten är klar. Släng supernatanten.
- Tillsätt 200 pl rumstemperatur 1x tvättbuffert III och skaka i 30 sekunder för att blanda. Placera röret i den magnetiska separationen rack tillåter 2-5 min för separation eller tills supernatantenär klart. Släng supernatanten.
- Ta bort röret från den magnetiska separationsställ och tillsätt 20 pl nukleasfritt vatten för att återsuspendera pärlorna. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner 10 gånger.
- Post Capture PCR-förstärkning
- Ta bort paramagnetiska pärlor från 4 ° C och jämvikt vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Ta bort varmstart PCR Ready Mix (2x) och PCR primermix från -20 ° C och tina vid RT och sedan placera på is. Förbered bibliotek förstärkning Master Mix genom att kombinera 27,5 pl 2x varmstart PCR Ready Mix med 2,75 pl PCR Primer 1 och 2,75 pl PCR-primer 2 (dessa volymer är för en hybridisering bibliotek plus 10% överskott).
- Setup reaktionen i PCR-rör genom att tillsätta 20 | il pärlor plus fångade DNA med 30 | il av biblioteket amplifiering huvudblandning för en total volym av 50 | il. Kapsylröret ordentligt och virvel för att blanda. Centrifugrör för fyra sekunder med hjälp av en mini flik fast hastighetle-top centrifug vid 6,0 x g.
- Ställ in följande PCR-program: välj förvärmning lock alternativ och inställd på 100 ° C, sedan in initial denaturering vid 98 ° C under 45 sekunder, 10 - 12 cykler av denaturering vid 98 ° C under 15 sekunder, hybridisering vid 65 ° C under 30 sekunder och förlängning vid 72 ° C under 60 sek, ett slutligt förlängningscykel vid 72 ° C under 60 sek och håll vid 4 ° C.
- Ta prov från termo och tillsätt 75 pl paramagnetiska pärlor. Blanda väl och inkubera vid RT i 15 min.
- Placera rören på magnet vid rumstemperatur under 2-3 min och sedan avlägsna supernatanten. Tvätta pärlor på magneten genom att tillsätta 200 pl 80% etanol, inkubering under 30 sekunder sedan avlägsna supernatanten. Upprepa för totalt två 80% tvättar.
- Inkubera vid RT i 5 - 10 minuter för att tillåta pärlorna att torka. Inte över torrt för sprickbildning. Resuspendera pärlor i 22 pl Tris-EDTA pH 8,0 (1x TE-lösning) och låt tre minuter för eluering. Placera provet på magnet för 3 - 5 min then överföring 20 pl eluerad produkt till en ny låg bind 1,5 ml rör, garanterar inga pärlor överföras.
- Utför kvantifiering av infångade cDNA med hjälp av fluorometer 7 och bestämma fångade cDNA kvalitet med hjälp av ett kapillärelektrofores-system 8.
- Desktop Sequencer laddas ordningen 9
- Späd fångas cDNA-bibliotek till en slutlig koncentration av 4 nM med användning av 10 mM Tris-Cl pH 8,5 med 0,1% Tween 20. Tina 10 N NaOH och hybridiseringsbuffert på is. Cirka 30 minuter före användning, tina skrivbords sequencer v2 reagens kit box 1 i RT vatten. Fyll inte över MAX-linje 10. Observera att detta är en sekvenseringsplattform särskilt förfarande och kan variera enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered 1 ml 0,2 N NaOH genom att kombinera 20 ul 10 N NaOH med 980 pl nukleasfritt vatten i ett mikrocentrifugrör (alltid förbereda färska). Späd PhiX bibliotek (bibliotek kontroll) till 4 nM avkombinera 2 | il av 10 nM bibliotekskontroll med 3 | j, l 10 mM Tris-Cl pH 8,5 med 0,1% Tween 20.
- Denaturera slutlig bibliotek och bibliotek kontroll genom att kombinera 5 pl 4 nM bibliotek med 5 pl av 0,2 N NaOH och skaka kort för att blanda. Centrifugrör för fyra sekunder med hjälp av en fast hastighet mini bordscentrifug vid 6,0 x g. Inkubera vid RT i 5 min för att denaturera bibliotek.
- Lägg 990 ul av pre-kyld hybridiseringsbuffert till rören innehållande 10 pl av denaturerad bibliotek. Detta resulterar i en 20 pM-bibliotek. Mark det denaturerade 20 pM bibliotek med det datum och kan förvaras i upp till 3 veckor vid -20 ° C.
- Blanda 375 pl av 20 pM bibliotekskontroll med 225 | il av pre-chilled hybridiseringsbuffert och späddes bibliotek kontroll för att resultera i en 12:05 bibliotek kontroll. Vänd flera gånger för att blanda lösningen.
- Kombinera 594 il denaturerad slut bibliotek med 6 pl 12:05 denaturerad bibliotek kontroll och skaka för att blanda. Ställ den kombinerade sample bibliotek och bibliotekskontroll åt sidan på is tills prover är redo att ladda in i reagenspatronen skrivbords sequencer.
6. Dataanalys
- Bedömning sekvens Kvalitet
- Beräkna kvaliteten på råsekvensdata (fastq filer) med hjälp av sekvens kvalitetsbedömning 11.
OBS: Detta steg hjälper till att bedöma data innan de utsattes vidare till nedströms analys. Mjukvaran körs med inbyggd parametrar och ger en uppsättning av statistik för varje fastq fil.
- Beräkna kvaliteten på råsekvensdata (fastq filer) med hjälp av sekvens kvalitetsbedömning 11.
- Inriktning
- Rikta sekvens läser (fastq filer) till referens mänskliga genomet hg19 och transkriptom använder Tophat2 12 (version 2.0.10) samtidigt som kända transkript som GTF-fil. Utgången är i form av ett binärt inriktnings format som kallas den BAM-filen.
- Utför efterbehandling steg inklusive sortering och indexering med hjälp Samtools 13 (version 0.1.19) På BAM-filen. Utför dubblett märkning, ordna om SAM, insatsens storlek beräkning och Lägga till eller byta lästa grupper som använder Picard verktyg 14 (version 1.84).
- RNAseq kvalitetsbedömning
- Beräkna en serie av kvalitetskontrollmått för RNAseq data med RNAseq kvalitetsbedömning. Ingången till detta program är en BAM fil 15 från Tophat2 inriktningen. Utgången är en HTML-fil som listar totala läs räkna, dubbletter, kartlagt läsa procent och rRNA procent, etc., bland andra.
- variant Calling
- Använd STAR (version 2.4.0) 16 för inriktning och sedan ringa enstaka nukleotid varianter använder GATK s (Version 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Följ GATK BAM efter processteg och kriterier filtrerings att flagga och ta bort falska positiva från utgången.
- Genexpression
- Beräkna genuttryck using Manschettknappar programvara (version 2.1.1) från Tuxedo suite 18.
OBS: Ingången är en BAM fil från Tophat2 justeringsredskapet. Utsignalen produceras vid den isoform, genen och transkriptnivå, där uttryckningen beräknas som FPKM (Fragment per kilobas per Million Mapped Läser).
- Beräkna genuttryck using Manschettknappar programvara (version 2.1.1) från Tuxedo suite 18.
- fusions Calling
- Ring fusioner från varje prov med användning ChimeraScan 19 (version 0.4.5), Tophat Fusion 20 anpassade och Trup 21. Kommentera fusionerna för domäner med Oncofuse 22 (version 1.0.9b2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk belyser nyckelstegen i RNAseq Capture visas i figur 1. Fyra cancercellinjer med kända mutationer användes för att demonstrera effektiviteten av RNAseq Capture-tekniken (K562 med ABL1 fusion, LC2 med RET fusion, EOL1 med PDGFRalpha fusion och RT- 4 med FGFR3 fusion). De fyra proverna slogs samman och sekvenserades med 2x 100 bp läser på en stationär sequencer, som genererar FASTQ filer. FASTQ filer kördes genom en RNAseq pipeline analys, som omfattar fem huvudkomponenter: 1) bedömning kvalitetskontroll, 2) anpassning till mänskliga transkriptom, 3) genuttryck kvantifiering, 4) fusion ringer, och 5) variant ringer. Inriktnings fil (BAM) används för att ringa single nucleotide varianter och beräkna genexpression. Fusioner kallas användning av fusions uppringare, såsom TopHat Fusion (och som utför sin egen inriktning) och utgången är kommenterad using fusions upptäckt programvara.
Jämförelse av genuttryck från RNAseq och fånga demonstrerar anrikningen av riktade transkript från 10 till 1000-faldigt med användning av infångningsmetod (Figur 2A). Dessutom visar figur 2B en ökning i procent av läser mappning till de riktade transkript regioner som använder capture jämfört med RNAseq. Bedömning av åtgärder för kvalitetskontroll representeras i Figur 3. Fånga och RNAseq utför lika när det gäller anpassning till transkriptom (3A, 94% jämfört med 93%) och medelinsättningsstorleken (3B, 174 bp jämfört med 162 bp). Använda insamlingsmetoden, är en högre andel exonic regioner sekvenserats (3C, 77% jämfört med 60%), och omvänt en lägre andel av intron regioner sekvens (3D, 4% jämfört med 20%). Totalt lästa räknas per prov visas i 3E (3F, 4% jämfört med 15%).
Fusion detekteringsutsignal visas i tabell 1 genereras med normaliserad fusion stöder läser. Fånga RNAseq var framgångsrik i att detektera fusioner för alla fyra cellinjer. Jämförelse av single nucleotide varianter kallas i överlappande områden för fångst och RNAseq visas i figur 4. Detta visar en hög överensstämmelse av varianter mellan Capture och RNAseq inom målområdet.
Figur 1. Schematisk av RNAseq Capture trappan. I detta experimentella demonstration, är RNA första depleted av ribosomalt RNA, följt av kemisk fragmentering och syntes av komplementärt DNA (cDNA) med användning av omvänt transkriptas. Därefter cDNA polyadenylerad och ligerades i båda ändarna till plattformsspecifika adaptrar för att generera ett bibliotek. Endast cDNA-bibliotek med rätt adaptrar sedan med PCR. Bibliotek hybridiseras sedan till anpassade oligonukleotidprober och tagits med magnetiska pärlor. Denna lilla mängd fångade bibliotek måste förstärkas en andra gång för att ha tillräckligt för nästa generations sekvensering. Flera bibliotek kan sedan sekvens parallellt. Sekvense data analyseras för RNA-händelser av intresse, såsom genfusioner, uttryck eller mutationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. CÄMFÖRELSE av riktade gener i Capture kontra RNAseq. A, Gene expression jämförelse mellan Capture och RNAseq i fyra cancercellinjer K562, LC2, EOL1 och RT-4 mätt med läser per kilobas per miljon mappade läser (FPKM) (Log skala). Riktade gener av intresse anrikas (blå) jämfört med icke-riktade gener (grå). B, Andel läsningar kartläggning till målområdet ökas i Capture kontra RNAseq bibliotek i fyra cancercellinjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. sekvense Metrics av Capture kontra RNAseq i fyra representativa cancercellinjer. A, Andel läser kartläggning till transkriptom,
| cELLINJE | Fusion | bibliotek Typ | totalt Läser | On Target Läser | Normaliserad Fusion Stödjande Reads (NFSR) | ||
| TophatFusion | ChimeraScan | TRUPP | |||||
| K562 | BCR-ABL | RNAseq | 150300482 | 279438 | 0 | 438 | 0 |
| Ta till fånga | 9341148 | 7566087 | 598 | 343 | 0 | ||
| LC2 | CCDC6-RET | RNAseq | 128861790 | 307566 | 0 | 97 | 0 |
| Ta till fånga | 12320692 | 10314284 | 71 | 44 | 6 | ||
| EOL1 | FIP1L1-PDGFRA | RNAseq | 135321406 | 225222 | 0 | 0 | 170 |
| Ta till fånga | 9317418 | 7680818 | 143 | 0 | 7 | ||
| RT4 | FGFR3 -TACC3 | RNAseq | 161350024 | 208741 | 0 | 131 | 469 |
| Ta till fånga | 8305950 | 6563574 | 358 | 88 | 34 | ||
Tabell 1. Fusion Detection för Capture kontra RNAseq av K562, LC2, EOL1 och RT-4. Denna tabell visar fyra cancercellinjer och tre olika fusion algoritmer, TopHat2, ChimeraScan och Trup används i denna demonstration. Denna tabell visar förmågan att upptäcka fusioner med Capture använder mindre än 10 miljoner totalt läser jämfört med mer än 60 miljoner läser används för RNAseq. Fusion uppbär läser beräknades genom att dividera fusion stöder läser av kinas läser, multiplicerat med en miljon.
"Bild 4" src = "/ filer / ftp_upload / 54090 / 54090fig4.jpg" />
Figur 4. SNV kräver Capture kontra RNAseq. Dessa venndiagram visar antalet Single Nucleotide varianter (SNVs) som upptäcktes av Capture och RNAseq för var och en av fyra cellinjer (K562, LC2, EOL1 och RT-4). Detta illustrerar hög överensstämmelse av SNVs mellan Capture och RNAseq inom riktade-region. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) och RT-4 (73,9%) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNAseq Capture är ett mellan strategi mellan RNAseq och microarray metoder för att utvärdera en vald del av transkriptom. Fördelarna med Capture inkluderar reducerad kostnad, snabb handläggningstid på en stationär sequencer, hög genomströmning, och detektion av genomiska förändringar. Metoden kan anpassas för att karakterisera icke-kodande RNA 23, detektera enstaka nukleotid-varianter 4-6, undersöka RNA-splitsning, och för att identifiera genfusioner eller strukturella omlagringar 24. Vidare kan tillämpas denna inställning till kliniska eller bearbetade prover som har genomgått fixering med formalin och inbäddade i paraffinblock 24,25.
Det finns flera viktiga fördelar med RNAseq fånga jämfört med microarray, i realtid kvantitativ PCR, Sanger-sekvensering och DNA-sekvensering. Mikromatris begränsas av hög bakgrund på grund av korshybridisering och icke-specifik bindning av prober. Kvantifiering av gener med low uttryck är begränsat på grund av bakgrundsbrus, medan höggradigt uttryckta genen mätningar påverkas av signalmättnad 1. Jämfört med RNAseq fånga, bevisar realtids-PCR svåra att reproducera. Dessutom ger RNAseq för detektion av nya transkript, kräver mindre startinsatsmaterial och kan upptäcka alternativ splits 26 .I motsats till Sanger-sekvensering, kan RNAseq för högre genomströmning och analys av låg uttryckt miRNA. Sanger-sekvensering har visat sig vara ett värdefullt verktyg för kontroll av fusioner med kända exon-exon korsningar och somatiska DNA-mutationer, men identifiering av nya fusioner hindras av krav på a priori kandidat brytpunkt. DNA-sekvensering är inte kostnadseffektivt, kräver större lagringsutrymme för data och är oförmögen att detektion av post-transkriptionella modifieringar.
Det finns flera viktiga steg i RNAseq Capture. Först, för att förbättra utbytet av biblioteksprodukter frånRNA / cDNA specifik paramagnetiska pärlor och paramagnetiska pärlor under tvättar, vara försiktig med att inte över torka pärlorna, vilket kommer att leda till förlust av avkastning. Också, inte under torka pärlorna, se all etanol tas bort från provrören, som etanol kan minska cDNA avkastning. För det andra är hybridisering av cDNA-bibliotek med komplementära prober beroende av konstant temperatur, rekommenderar vi uppvärmningen tvättbuffert I och Stringent buffert till 65 ° C under minst två timmar i förväg. Vidare är det efter hybridisering viktigt att upprätthålla 65 ° C under bindande och tvätta steg. Sonderna som används här har utformats för exonerna av gener av intresse för läkemedelsutveckling inklusive kinaser, gener som är involverade i vanliga omdisponeringar som transkriptionsfaktorer, och hus hålla gener. Dessutom är geninnehåll anpassningsbar och fånga panelstorlekar kan variera. Vidare, såsom ny information om genomregioner uppkommer, ytterligare prober kan utformas och läggas till than befintlig capture panel.
Utvärdering av inriktnings mått, speciellt på målsatsen, ger information om hur väl målområdet anrikades. En låg på-måltakt kan bero på en misslyckad hybridisering och avskiljning, varigenom den önskade målregionen inte fångades och berikas. I detta fall måste en re-hybridisering och infångning av biblioteket inställda att utföras. En låg på-target hastigheten kan också vara på grund av fel för att utarma rRNA, vilket kan bekräftas genom att beräkna procentandelen av rRNA i proverna. Hög rRNA procent i provet kommer att kräva åter beredning av provet börjar med rRNA utarmning. Dessutom, om bibliotekskoncentrationen faller under kraven för hybridisering och fånga, skulle det vara lämpligt att optimera mängden utgångs ingång för provet typ och kvalitet (intervall: 50-1000 ng).
Även om det finns flera fördelar för riktade RNAseq applikationer finns också begränsningaröverväga. Prover med dålig RNA kvalitet baserat på RIN eller graden av fragmentering kan inte ge bibliotek kvalitetsmål för sekvensering. Flera grupper har visat framgång med formalinfixerade paraffininbäddade prover, men det finns prover som inte kommer att passera för sekvense 24,25,27. Vidare, eftersom RNAseq Capture fokuserar på kända transkript, förlorar det fördelarna med opartisk RNAseq för nya eller utan not transkript. Dessutom, för SNP upptäckt, RNAseq metoder kan bara detektera mutationer i uttryckta transkript.
Framtida möjligheter RNAseq Capture omfattar forskning och kliniska tillämpningar. Senaste upptäckten av tusentals långa icke-kodande RNA och deras roll i biologi kräver fokuserad karakterisering. I kliniken kan RNAseq Capture sträcka sig bortom testa forskning och översätta till kliniska tester för att karakterisera mänskliga sjukdomar såsom cancer, infektionssjukdomar, och icke-invasiv testning. I samband med genomisk sekvense approaches kan RNAseq Capture integreras för att studera och karakterisera uttryckta genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits (24 or 96 reactions) | Roche NimbleGen | 05634261001 or 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| Chloroform | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Dry Bath | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
- Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
- Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
- Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
- Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
- Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
- Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
- Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
- Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
- Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
- DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
- Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
- Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
- Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
- Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
- Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
- Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
- Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
- Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).
