Abstract
RNA-sekvensering (RNAseq) er en allsidig fremgangsmåte som kan benyttes til å detektere og karakterisere genekspresjon, mutasjoner, genfusjoner, og ikke-kodende RNA. Standard RNAseq krever 30-100 millioner sekvense leser og kan inkludere flere RNA produkter som mRNA og ikke-kodende RNA. Vi viser hvordan målrettet RNAseq (capture) tillater en fokusert studie på utvalgte RNA produkter ved hjelp av en stasjonær sequencer. RNAseq fangst kan karakterisere Umerket, lav, eller forbigående uttrykt utskrifter som kan ellers bli savnet ved hjelp av tradisjonelle RNAseq metoder. Her beskriver vi utvinning av RNA fra cellelinjer, ribosomalt RNA utarming, cDNA syntese, utarbeidelse av strekkode biblioteker, hybridisering og fangst av målrettede vitnemål og multiplex sequencing på en stasjonær sequencer. Vi skisserer også den beregnings analyse rørledningen, som omfatter kvalitetskontroll vurdering, justering, fusjon deteksjon, genekspresjon kvantifisering og identifisering av enkelt NUCleotide varianter. Denne analysen gir mulighet for målrettet transkripsjon sekvensering for å karakter genekspresjon, Genfusjonene, og mutasjoner.
Protocol
Merk: Denne protokollen beskriver den samtidige behandling og analyse av fire prøver. Denne metoden er kompatibel med RNA isolert fra celler Dypfryst vev og formalinfiksert parafin-embedded tissue (FFPE). Denne protokollen begynner med 50 - 1000 ng (250 ng anbefales) av utgangs RNA inngang for hver prøve.
1. rRNA Nedbryting og fragmentering av RNA Prosedyre
- rRNA Nedbryting
- Fjern elute, prime, fragment mix, rRNA fjerning mix, rRNA bindingsbuffer og resuspensjon buffer fra -20 ° C og tine i romtemperatur. Fjerne elueringsbuffer, rRNA fjerning perler og RNA / cDNA-spesifikk paramagnetiske kuler fra 4 ° C og bringe til romtemperatur.
- Legg 0,25 mikrogram av RNA PCR rør. Fortynn total RNA med nuklease-fri ultrarent vann til et totalt sluttvolum på 10 pl. Tilsett 5 mL av rRNA bindingsbuffer til hvert rør deretter legge til 5 mL av rRNA fjerning blanding og forsiktig pipette opp og ned for å blande. Plasser rørene i termosykler med lokk forvarmet til 100 ° C og program thermal cycler til 68 ° C i 5 minutter for å denaturere RNA.
- Etter RNA denaturering, fjerne rørene fra thermal cycler og inkuber ved værelsestemperatur i 1 min. Vortex rRNA fjerning perle tube kraftig for å suspendere perlene. Legg 35 ul rRNA fjerning perler til nye rør og overføre RNA denaturering reaksjons (20 ul) til rør innehold rRNA fjerning av perler.
- Juster pipette til 45 mL og pipette raskt opp og ned 20x å blande. Inkuber rørene ved RT i 1 min. Deretter plasserer rørene i magnetisk stå i romtemperatur i 1 min. Overfør supernatanten til nylig merkede PCR-rørene og plassere disse rørene igjen i magnetisk stå i romtemperatur i 1 min. Dette sikrer at ingen perler overføres. Overfør supernatanten til nylig merkede PCR-rørene.
- Vortex RNA / cDNA-spesifikk paramagnetiske kuler og tilsett 99 ul av perler til hvert rør. Forsiktig pipette helevolum opp og ned 10x å blande. Hvis du starter med degradert-RNA, tilsett 193 mL av godt blandet RNA / cDNA spesifikke paramagnetiske kuler i hvert rør. Inkuber ved RT i 15 min. Deretter plasserer rørene i magnet stå i romtemperatur i 5 minutter. Fjern og kast supernatanten.
- Tilsett 200 ul av nylaget 70% etanol (EtOH). Hold rørene på magnetisk stativ og ta vare å ikke forstyrre perlene. Inkuber ved romtemperatur i 30 sek, og ta ut og kast supernatanten. Tillate rør å stå ved romtemperatur i 5 - 10 min for å tørke.
- Sentrifuger tint romtemperatur elueringsbuffer ved 600 x g i 5 sek. Legg 11 ul elueringsbuffer til hvert rør og forsiktig pipettere opp og ned 10 ganger for å blande. Inkuber rørene ved romtemperatur i 2 min. Plassere rørene på magnetisk stå i romtemperatur i 5 minutter. Overfør 8,5 ul av supernatanten til nylig merkede PCR-rørene.
- Fragmentering av rRNA utarmet RNA
- Legg 8,5 mL elute, 8,5 mL prime, og 8,5 ul fragment blanding til hvert rør. Forsiktig pipette opp og ned 10x å blande. Plasser rørene i termosykler med følgende program: forvarmet lokk til 100 ° C, 94 ° C i 8 min, deretter 4 ° C hold.
MERK: Dette trinnet er utformet for å generere en gjennomsnittlig innskuddsstørrelse på 155 bp. Hvis gjennomsnittlig fragment størrelse på RNA prøven er lavere enn 200 bp, hopper du over dette trinnet og gå til First Strand cDNA Synthesis.
- Legg 8,5 mL elute, 8,5 mL prime, og 8,5 ul fragment blanding til hvert rør. Forsiktig pipette opp og ned 10x å blande. Plasser rørene i termosykler med følgende program: forvarmet lokk til 100 ° C, 94 ° C i 8 min, deretter 4 ° C hold.
2. cDNA Synthesis
- Syntetisere First Strand cDNA
- Fjern første tråd syntese blanding fra -20 ° C og tining ved værelsestemperatur.
- Pre-program termosykler med følgende innstillinger: forvarming lokk alternativ og sett til 100 ° C, deretter 25 ° C i 10 min, 42 ° C i 15 min, 70 ° C i 15 min og hold ved 4 ° C . Lagre dette programmet som "syntetisere en st Strand."
- Sentrifuger tinte-syntese av første kjede blandingsrøret på 600 & #215; g i 5 sek. Bland 1 mL revers transkriptase med 9 mL av første tråd syntese mix.
- Legg 8 mL av første tråd syntese og revers transkriptase mix til hvert rør, forsiktig pipette opp og ned 6x å blande. Sentrifugerør for 4 sek ved hjelp av en fast hastighet mini tabletop sentrifuger ved 6,0 xg å bringe væske til bunnen. Plasser rør i termosykler og velg syntetisere en st Strand. Når den termosykler når 4 ° C, fjern rør og fortsette umiddelbart å syntetisere andre Strand cDNA.
- Syntetisere Second Strand cDNA
- Forvarm thermal cycler til 16 ° C med lokk forvarmet til 30 ° C. Thaw andre tråden mester mix og re-suspensjon buffer på is. På forhånd fjerne flaske paramagnetiske kuler fra 4 ° C og la stå i minst 30 minutter for å bringe dem til romtemperatur.
- Tilsett 5 mL av resuspensjon buffer til hver PCR-rør. Sentrifuger andre tråden mester mix 600X g i 5 sek og tilsett 20 ul til hver PCR-rør. Plasser rørene i forvarmet thermal cycler ved 16 ° C i 1 time. Når inkubasjon er ferdig, fjern fra termosykler og la rør for å komme til romtemperatur.
- Vortex de paramagnetiske kuler til de er godt spredt. Legg 90 mL av godt blandede paramagnetiske kuler til hvert rør. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10x å blande. Inkuber rørene ved værelsestemperatur i 15 min. Plasser rørene på magnetstativet ved romtemperatur i 5 min.
- Fjern og kast 135 mL av supernatant deretter forlate rør på magnetstativet for å utføre EtOH vask. Tilsett 200 ul ferskt tilberedte 80% EtOH til hvert rør uten å forstyrre kulene, og deretter inkuberes ved romtemperatur i 30 sek. Fjern og kast alt av supernatanten fra hver. Gjenta for totalt to 80% EtOH vasker.
- La rørene stå ved romtemperatur i 5 - 10 min for å tørke på den magnetiske stativet. Sentrifuger tint rom temperature resuspendering buffer ved 600 x g i 5 sek. Fjern PCR-rørene fra magnetisk stativ. Legg 17,5 mL resuspensjon buffer til hver PCR rør og forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt. Inkuber rørene i 2 minutter ved romtemperatur.
- Plasser rørene på magnet stå i romtemperatur i 5 minutter, og deretter overføre 15 ul supernatant (dobbeltkjedet cDNA) til 0,2 ml PCR-strips.
MERK: Dette er en trygg stoppunktet som cDNA kan oppbevares ved -20 ° C i opptil 7 dager.
3. Bibliotek Forberedelse
- Adenylate 3 'Ends
- Fjern A-tailing blanding fra -20 ° C og tining ved værelsestemperatur. Pre-programmet termosykleren med følgende innstillinger: velg pre-heat lokk alternativet og satt til 100 ° C, og deretter satt til 37 ° C i 30 min, 70 ° C i 5 min og holde ved 4 ° C. Lagre dette programmet som "ATAIL70."
- Legg 2,5 mL av resuspensjonbuffer til hvert rør. Deretter legger 12,5 mL av tinte A-tailing mix. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt. Plasser rørene i termosykleren og velg ATAIL70. Når den termosykler temperaturen er ved 4 ° C, fjerne de PCR-rørene fra thermal cycler og fortsetter straks for å ligere adaptere.
- ligate Adaptere
- Fjern egnede RNA adapterrørene, stoppe ligeringsbuffer og resuspensjon buffer fra -20 ° C og tining ved værelsestemperatur. Ikke fjern ringsblandingen røret fra -20 ° C før du blir bedt om å gjøre det i protokollen. Fjern flasken med paramagnetiske kuler fra 4 ° C og la stå i minst 30 min for å bringe til romtemperatur.
- Forvarm termosykler til 30 ° C og velge den forhåndsoppvarming lokk alternativ og satt til 100 ° C. Sentrifuger tinte RNA adapter rør på 600 × g i 5 sek. Umiddelbart før bruk, fjerner ligeringsblandingsrøret fra -20 ° Clagring.
- Legg 2,5 mL av resuspensjon buffer til hvert prøverør. Legg 2,5 ul av ligeringsblandingen. Returnere ringsblandingsrøret til -20 ° C lagring umiddelbart etter bruk. Legg 2,5 mL av den tinte RNA adapteren indeksen til hvert prøverør. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt.
- Sentrifugerør for 4 sek ved hjelp av en fast hastighet mini tabletop sentrifuger ved 6,0 x g. Plasser rørene i den forvarmede thermal cycler. Lukk lokket og inkuber ved 30 ° C i 10 min.
- Fjerne rørene fra thermal cycler og tilsett 5 ul stoppligeringsbuffer til hvert rør for å inaktivere ligering. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt.
- Gjenta vask som beskrevet i 2.2.3 - 2.2.4, bruker 42 mL av blandede paramagnetiske kuler, og forkaster 79,5 mL supernatant. Med rørene på magnetstativet, la prøvene lufttørke ved romtemperatur i 5 - 10 min.
- Fjern PCR strips framagnetisk stativ og legge til 52,5 mL resuspensjon buffer i hvert rør. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt. Inkuber rørene ved værelsestemperatur i 2 min. Plasser rørene på den magnetiske stå ved romtemperatur i 5 minutter eller til væsken er klar. Overfør 50 mL av supernatanten fra hvert rør til nye 0,2 ml PCR strips. Pass på å ikke forstyrre perlene.
- Gjenta vaske som beskrevet i 2.2.3 - 2.2.4, ved anvendelse av 50 ul av blandede paramagnetiske kuler, og forkaster 95 ul supernatant. Med rørene på magnetstativet, la prøvene lufttørke ved romtemperatur i 5 - 10 min.
- Fjern PCR strips fra den magnetiske stativet og legge til 22,5 mL resuspensjon buffer i hvert rør. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt.
- Inkuber rørene ved RT i 2 min. Plasser rørene på magnet stå i romtemperatur i 5 minutter eller inntil væsken er klar. Overføre 20 ul supernatant fra hvert rør til ennye 0,2 ml PCR stripe tube. Pass på å ikke forstyrre perlene. Dette er en sikker stoppunktet og cDNA kan bli lagret ved -20 ° C i opp til 7 dager.
4. Library Amplification
- Berik DNA-fragmenter
- Ta av PCR Master Mix, PCR primer cocktail og resuspensjon buffer fra -20 ° C lagring og tine i romtemperatur. Fjern flaske paramagnetiske kuler fra 4 ° C lagring og la stå i minst 30 minutter for å bringe til romtemperatur.
- Pre-program termosykler med følgende innstillinger: velge den forhåndsoppvarming lokk alternativ og sett til 100 ° C, og deretter satt innledende denaturering ved 98 ° C i 30 sek, 15 sykluser med denaturering ved 98 ° C i 10 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek, en endelig forlengelse syklus ved 72 ° C i 5 min og hold ved 4 ° C. Lagre dette programmet som "PCR."
- Sentrifuger tint PCR mesterblande og PCR-primere rør ved 600 x g i 5 sek. Tilsett 5 ul av PCR-primere tint til hvert prøverør. Tilsett 25 ul opptint PCR masterblanding til hvert prøverør. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt.
- Plasser avkortet PCR strips i pre-programmerte termosykler. Lukk lokket og kjøre PCR-programmet. Når PCR er ferdig, fjerner rør fra termosykler og holde på is.
- Gjenta vaske som beskrevet i 2.2.3 - 2.2.4, ved anvendelse av 50 ul av blandede paramagnetiske kuler, og forkaster 95 ul supernatant. Med rørene på magnetstativet, la prøvene lufttørke ved romtemperatur i 5 - 10 min.
- Fjerne rørene fra den magnetiske stativet og tilsett 32,5 mL resuspensjon buffer til hvert prøverør. Forsiktig pipette hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande godt. Inkuber ved romtemperatur i 2 min. Plasser PCR-rørene på magnet stå i romtemperatur i 5 minutter eller inntil væsken er klar. Deretter overføre 30 mL supernatant å friske 0,2 ml PCR rør.
- Utfør kvantifisering av cDNA ved hjelp av et fluorometer 7 og bestemme cDNA kvalitet ved hjelp av en kapillær elektroforese system 8.
MERK: Dette er en trygg stoppunktet og cDNA kan oppbevares ved -20 ° C i opptil 7 dager. Merk: Dette biblioteket er ansett som en RNAseq bibliotek.
Påfølgende trinn fører til en Capture bibliotek.
5. Hybridisering, Capture og Sequencing
- multiplex Hybridisering
- Fjern tilpasset hydrert sonder, Cot-1 DNA, universell blokkerer oligos og adapter bestemte blokkerer oligos fra -20 ° C og tine på is.
- I et lite bind 1,5 ml tube, kombinere 500 ng DNA (125 ng per prøve når multiplexing 4 prøver), 5 mL Cot-1 DNA (1 ug / ul), 1UL universell blokkerer oligonukleotider, 0,5 mL P7 (6 nukleotid) adapter bestemt blokkerer oligos (dette beløpet kan måtte justeres avhengig av multiplex Kondisjoneons) og 0,5 mL P7 (8 nukleotid) adapter spesifikke blokkerer oligonukleotider (dette beløpet kan måtte justeres avhengig av multiplekse forhold).
- Plassere prøverøret i en vakuum-konsentrator med lokket åpent vender motsatt rotasjonsretning. Tørrstoffinnhold ved 45 ° C i 20 min eller inntil fullstendig fordampning av væsken.
- Suspender tørket innhold med 8,5 mL 2x hybridisering buffer, 3,4 mL hybridisering komponent A og 1,1 mL nukleasefritt fritt vann. Tillat 10 min for resuspensjon og virvle hver 2,5 min. Overfør resuspendert-materiale til et 0,2 ml PCR-rør og inkuberes ved 95 ° C i 10 min på en termosykler.
- Fjern hybridisering prøverør fra thermal cycler og tilsett 2 ul av tilpassede prober resuspendert ved en konsentrasjon på 1,5 pmol / pl. Alternativt legge 4 mL av tilpassede prober resuspendert i en konsentrasjon på 0,75 pmol / mikroliter. Inkuber hybridisering reaksjon over natten (16-24 timer) ved 65 ° C.
MERK: Probes kjøpt fra ulike leverandører kan benyttes, og bør følges produsentens instruksjoner. Varigheten av hybridisering trinnet kan også variere.
- Bead Forberedelse og Capture
- Fjern flaske med streptavidin-koblet paramagnetiske kuler fra 4 ° C og likevekt ved romtemperatur i 30 min. Tynn ut 10X vask buffere (I, II, III, og Strenge) og 2.5x Bead Wash Buffer å skape 1x arbeidsløsninger.
- Delmengde 140 mL av 1x vaskebuffer jeg inn til en frisk 1,5 ml tube. Varme hele mengden av 1x strenge buffer og aliquot av 1 x vaskebuffer I ved 65 ° C i en varmeblokk i minst 2 timer.
- Alikvoter 100 ul streptavidin-koblet paramagnetiske kuler pr fange inn i et 1,5 ml rør. Plasser på magnet og kast supernatanten. Tilsett 200 mL perle vaskebuffer per 100 mL perler og vortex i 10 sek. Plasser på magnet for 2-5 minutter eller til overstående er klart. Når supernatanten er klar, kast den og retorv igjen for totalt to vaskinger.
- Etter fjerning av vulsten vaskebuffer, tilsett samme volum vulst vaskebuffer som opprinnelig startvolum (det vil si 100 ul av en fangst). Resuspender og overføring til et 0,2 ml PCR-rør. Plasser røret i magnetstativ for 2-5 minutter eller til overstående er klart. Kast supernatant.
- Med både hybridisering prøven og perler i den termosykler ved 65 ° C, overfør blandingen til hybridisering vulsten røret og pipetten opp og ned 10 ganger for å blande. Inkuber ved 65 ° C i 45 minutter, vortex og spinne ned prøven i 4 sekunder ved hjelp av en fast hastighet (6,0 xg) table-top mini sentrifuge.
- Bead Wash
- Fjern fange rør fra termosykler og tilsett 100 mL forvarmet 1x vaskebuffer jeg til og vortex i 10 sekunder for å blande. Overfør blandingen til en frisk lav bind 1,5 ml rør. Plasser røret på en magnetisk separasjonsstativ og tillate 2-5 min for separering eller inntil supernatanten er klar. Discard supernatant.
- Tilsett 200 ul forvarmet 1x strengere vaskebuffer og pipette opp og ned 10 ganger for å blande. Inkuber ved 65 ° C i 5 minutter. Plasser røret på den magnetisk separasjon stativet og at 2 - 3 min for separering eller inntil supernatanten er klar. Kast supernatant. Gjenta stringent vask en gang til for en total av to vaskinger.
- Tilsett 200 ul romtemperatur 1x vaskebuffer jeg og vortex i 2 min å blande. Plasser røret i magnetisk separasjon rack og la 2-5 min for separasjon eller inntil supernatanten er klar. Kast supernatant.
- Tilsett 200 ul romtemperatur 1x vaskebuffer II og vortex i 1 min å blande. Plasser røret i magnetisk separasjon rack og la 2-5 min for separasjon eller inntil supernatanten er klar. Kast supernatant.
- Tilsett 200 ul romtemperatur 1x vaskebuffer III og vortex i 30 sekunder for å blande. Plasser røret i magnetisk separasjon stativet slik at 2-5 min for separasjon eller til supernatanter klart. Kast supernatant.
- Fjerne røret fra magnetisk separasjon stativet og tilsett 20 ul nuklease-fritt vann for å resuspendere kulene. Bland grundig ved å pipettere opp og ned 10 ganger.
- Post Capture PCR Amplification
- Fjern paramagnetiske kuler fra 4 ° C og likevekt ved romtemperatur i 30 min.
- Fjern varmstart PCR Ready Mix (2x) og PCR Primer Mix fra -20 ° C og tine ved romtemperatur og deretter plassere på is. Forbered bibliotek forsterkning Master Mix ved å kombinere 27,5 mL av 2x varmstart PCR Ready Mix med 2,75 mL av PCR Primer 1 og 2,75 mL av PCR primer 2 (disse volumene er for en hybridisering bibliotek pluss 10% overskudd).
- Oppsett reaksjonen i PCR-rør ved å tilsette 20 ul av perler pluss fanget DNA med 30 pl av bibliotek amplifikasjon masterblanding til et totalvolum på 50 ul. Cap rør ordentlig og virvle å blande. Sentrifugerør for 4 sek ved hjelp av en fast hastighet mini table-top sentrifuger ved 6,0 x g.
- Sett opp følgende PCR-programmet: velg pre-heat lokk alternativet og satt til 100 ° C, og deretter sette innledende denaturering ved 98 ° C i 45 sek, 10 - 12 sykluser av denaturering ved 98 ° C i 15 sek, hybridisering ved 65 ° C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 60 sek, en endelig forlengelse syklus ved 72 ° C i 60 sek og hold ved 4 ° C.
- Fjern prøven fra termo og legge 75 ul paramagnetiske kuler. Bland godt og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Plassere rørene på magneten ved romtemperatur i 2 - 3 minutter, og deretter fjerne supernatanten. Vask perler på magneten ved tilsetning av 200 ul 80% etanol, inkubering i 30 sek og deretter fjerning av supernatanten. Gjenta for totalt to 80% vasker.
- Inkuber ved RT i 5 - 10 min for å tillate at perlene tørke. Ikke over tørt for sprekkdannelser. Resuspender perler i 22 ul Tris-EDTA pH 8,0 (1x TE løsning) og tillate 3 min for eluering. Plasser prøven på magnet for 3 - 5 min then overføring 20 ul eluert produktet til en frisk lav-bind 1,5 ml tube, noe som sikrer ingen perler er overført.
- Utfør kvantifisering av fangede cDNA ved hjelp fluorometer 7 og bestemme fanget cDNA kvalitet ved hjelp av en kapillær elektroforese system 8.
- Desktop Sequencer Laster Prosedyre 9
- Fortynn fanget cDNA-bibliotek til en endelig konsentrasjon på 4 nM ved anvendelse av 10 mM Tris-Cl pH 8,5 med 0,1% Tween 20 tine 10 N NaOH og hybridiseringsbuffer på is. Omtrent 30 minutter før bruk, tine desktop sequencer v2 reagenssett boks 1 i RT vann. Ikke fyll over maksimumslinjen 10. Vær oppmerksom på at dette er en sekvenseplattformspesifikk prosedyre og kan variere i henhold til produsentens anvisninger.
- Forbered 1 ml 0,2 N NaOH ved å kombinere 20 ul 10 N NaOH med 980 mL nukleasefritt fritt vann i en mikro tube (alltid forberede frisk). Fortynn pHix bibliotek (bibliotek kontroll) til 4 nM etterå kombinere 2 ul 10 nM bibliotek kontroll med 3 pl 10 mM Tris-Cl pH 8,5 med 0,1% Tween 20.
- Denaturering endelig bibliotek og bibliotek kontroll ved å kombinere 5 mL av 4Nm bibliotek med 5 mL av 0,2 N NaOH og vortex kort for å blande. Sentrifugerør for 4 sek ved hjelp av en fast hastighet mini table-top sentrifuger ved 6,0 x g. Inkuber ved RT i 5 minutter for å denaturere biblioteker.
- Legg 990 ul pre-avkjølt hybridiseringsbuffer til rørene inneholdende 10 ul av denaturerte biblioteker. Dette resulterer i en 20 pM bibliotek. Marker denaturert 20 pM bibliotek med dato og kan lagres i opptil tre uker ved -20 ° C.
- Bland 375 ul av 20 pM bibliotek kontroll med 225 ul pre-avkjølt hybridiseringsbuffer og fortynnet bibliotek kontroll for å resultere i en 24:05 bibliotek kontroll. Snu flere ganger for å blande løsningen.
- Kombiner 594 mL av denaturert endelig bibliotek med 6 ul 24:05 denaturert bibliotek kontroll og virvle å blande. Sett sammen SAMPle bibliotek og bibliotek kontroll til side på is inntil prøvene er klar til å laste inn i skrivebordet sequencer reagensforpakningen.
6. Data Analysis
- Sequence Quality Assessment
- Beregn kvaliteten på rå sekvensdata (fastq filer) ved hjelp av sekvens kvalitetsvurdering 11.
MERK: Dette trinnet bidrar til å vurdere dataene før de blir ytterligere utsatt for nedstrøms analyse. Programvaren kjører med innebygd parametere og produserer et sett med beregninger for hver fastq fil.
- Beregn kvaliteten på rå sekvensdata (fastq filer) ved hjelp av sekvens kvalitetsvurdering 11.
- Alignment
- Rett sekvens leser (fastq filer) til referansen menneskelige genom hg19 og transkriptom hjelp Tophat2 12 (versjon 2.0.10) samtidig som kjent transkripsjoner som en GTF-fil. Utgangen er i form av et binært innretting format kalt BAM-filen.
- Utfør legg behandlingstrinn inkludert sortering og indeksering bruker Samtools 13 (versjon 0.1.19) På BAM-filen. Utfør dobbeltmarkering, bestilling SAM, setter størrelse beregning og legge til eller erstatte lesegrupper som bruker Picard verktøy 14 (versjon 1.84).
- RNAseq Quality Assessment
- Beregn en serie med kvalitetskontroll beregninger for RNAseq data ved hjelp RNAseq kvalitetsvurdering. Inngangen til denne programvaren er en BAM-fil 15 fra Tophat2 justering. Utgangen er en HTML-fil som viser total lese teller, duplikater, kartlagt lese prosent og rRNA prosent, etc., blant andre.
- variant Calling
- Bruk STAR (versjon 2.4.0) 16 for justering og deretter ringe enkelt nukleotid varianter bruker GATK s (versjon 3,3 til 0) HaplotypeCaller 17 .Følg GATK BAM etterbehandlingstrinn og filtreringskriterier for å markere og fjerne falske positiver fra utgangen.
- Genuttrykk
- Beregn genuttrykk USIng Mansjettknapper (versjon 2.1.1) fra Tuxedo suite 18.
MERK: Inngangs er en BAM-fil fra Tophat2 justeringsverktøy. Utgangen er produsert ved isoform, genet og karakternivå, der uttrykket er beregnet som FPKM (Fragments per kilobase per million Kartlagt Leser).
- Beregn genuttrykk USIng Mansjettknapper (versjon 2.1.1) fra Tuxedo suite 18.
- Fusion Calling
- Ring fusjoner fra hver prøve ved hjelp ChimeraScan 19 (versjon 0.4.5), Tophat Fusion 20 skikk og trup 21. Kommentere fusjonene for domener med Oncofuse 22 (versjon 1.0.9b2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk fremheve viktige skritt i RNAseq Capture er vist i figur 1. Fire kreftcellelinjer med kjente mutasjoner ble brukt til å demonstrere effektiviteten av RNAseq Capture teknikk (K562 med ABL1 fusjon, LC2 med RET fusjon, EOL1 med PDGFRalpha fusjon og RT- 4 med FGFR3 fusion). De fire prøvene ble slått sammen og sekvensert med 2x 100 bp leser på en stasjonær sequencer, som genererer FASTQ filer. FASTQ filene ble kjørt gjennom en RNAseq analyse rørledning, som omfatter fem hovedkomponenter: 1) kvalitetskontroll vurdering, 2) justering til menneskelig transkriptomet, 3) genekspresjon kvantifisering, 4) fusjon ringer, og 5) variant ringer. Justeringen fil (BAM) brukes for å ringe ett nukleotid varianter og beregne genekspresjon. Fusjoner blir kalt bruker fusion innringere, for eksempel Hat Fusion (som utfører sin egen justering) og produksjonen er kommentert using fusjon deteksjon programvare.
Sammenligning av genuttrykk fra RNAseq og fangst viser anrikning av målrettede transkripsjoner med 10 til 1000 ganger ved hjelp av fangstmetoden (figur 2A). I tillegg viser figur 2B en økning i prosent av leser tilordning til de målrettede transkripsjons regioner ved hjelp av fangst i forhold til RNAseq. Vurdering av kvalitetskontroll tiltak er representert i Figur 3. Fang og RNAseq utføre like når det gjelder justering til transkriptomet (3A, 94% vs. 93%) og at innsatsen størrelse (3B, 174 bp vs. 162 bp). Ved hjelp av fangstmetode, er en høyere prosentandel av exonic regioner sekvensert (3C, 77% vs. 60%), og omvendt en lavere andel av intronic regionene er sekvensert (3D, 4% vs. 20%). Total lese tellinger per prøve er angitt i 3E (3F, 4% vs. 15%).
Fusion deteksjon utgang vist i tabell 1 er generert med normalisert fusjon støtte leser. Capture RNAseq lyktes i å oppdage fusjoner for alle fire cellelinjer. Sammenligning av single nucleotide variantene kalles i overlappende områder av fangst og RNAseq vises i Figur 4. Dette viser en høy samstemmighet varianter mellom Capture og RNAseq innenfor målområdet.
Figur 1. Skjematisk av RNAseq Capture Trappen. I denne eksperimentelle demonstrasjonen, er RNA første depleted av ribosomalt RNA, etterfulgt av kjemisk fragmentering og syntese av komplementært DNA (cDNA) under anvendelse av revers transkriptase. Deretter blir cDNA polyadenylert og ligeres i begge ender for å plattformspesifikke adaptere for å generere et bibliotek. Bare cDNA biblioteker med riktige adaptere er så forsterket av PCR. Bibliotekene blir deretter hybridisert til tilpassede oligonukleotidprober og tatt med magnetiske kuler. Denne lille mengden fanget bibliotek må forsterkes en gang å ha nok til neste generasjon sekvensering. Flere biblioteker kan deretter bli sekvensert parallelt. Sekvensering av data er analysert for RNA hendelser av interesse som Genfusjonene, uttrykk eller mutasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Comparison av Målrettede Gener i Capture versus RNAseq. A, Gene uttrykk sammenligning mellom Capture og RNAseq i fire kreftcellelinjer K562, LC2, EOL1 og RT-4 målt ved leser per kilobase per million kartlagt leser (FPKM) (Logg skala). Målrettet gener av interesse er beriket (blå) sammenlignet med ikke-målrettede gener (grå). B, Andel leser kartlegging til målrettede regionen er økt i Capture versus RNAseq bibliotekene i fire kreftcellelinjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sekvense Metrics av Capture versus RNAseq i fire Representant Cancer Cell Lines. A, Andel leser kartlegging til transkriptom,
| celle~~POS=TRUNC | Fusion | bibliotek Type | totalt antall lest | På Target Leser | Normalisert Fusion Støtte Leser (NFSR) | ||
| TophatFusion | ChimeraScan | TROPP | |||||
| K562 | BCR-ABL | RNAseq | 150300482 | 279438 | 0 | 438 | 0 |
| Capture | 9341148 | 7566087 | 598 | 343 | 0 | ||
| LC2 | CCDC6-RET | RNAseq | 128861790 | 307566 | 0 | 97 | 0 |
| Capture | 12320692 | 10314284 | 71 | 44 | 6 | ||
| EOL1 | FIP1L1-PDGFRA | RNAseq | 135321406 | 225222 | 0 | 0 | 170 |
| Capture | 9317418 | 7680818 | 143 | 0 | 7 | ||
| RT4 | FGFR3 -TACC3 | RNAseq | 161350024 | 208741 | 0 | 131 | 469 |
| Capture | 8305950 | 6563574 | 358 | 88 | 34 | ||
Tabell 1. Fusion Detection for Capture versus RNAseq av K562, LC2, EOL1 og RT-4. Denne tabellen viser fire kreftcellelinjer og tre ulike fusion algoritmer, TopHat2, ChimeraScan og trup benyttet i denne demonstrasjonen. Denne tabellen viser evnen til å oppdage fusjoner med Capture bruker mindre enn 10 millioner totalt leser i forhold til mer enn 60 millioner leser benyttet for RNAseq. Fusion som støtter leser ble beregnet ved å dividere fusjon støtte leser av kinase leser, multiplisert med en million.
"Figur 4" src = "/ files / ftp_upload / 54090 / 54090fig4.jpg" />
Figur 4. SNV ringer for Capture versus RNAseq. Disse Venn-diagrammer viser antall enkelt nukleotid varianter (SNVs) som ble oppdaget av Capture og RNAseq for hver av de fire cellelinjer (K562, LC2, EOL1 og RT-4). Dette illustrerer høy samsvar med SNVs mellom Capture og RNAseq innen målrettet-regionen. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) og RT-4 (73,9%) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNAseq Capture er en mellomliggende strategi mellom RNAseq og microarray tilnærminger for å vurdere en valgt del av transkriptom. Fordelene med Capture inkluderer redusert pris, rask behandlingstid på en stasjonær sequencer, høy gjennomstrømning, og påvisning av genomisk endringer. Fremgangsmåten kan tilpasses for å karakterisere ikke-kodende RNA 23, detektere enkelt-nukleotid-variantene 4-6, undersøke RNA-spleising, og for å identifisere genfusjoner eller strukturelle rearrangementer 24. Videre kan denne tilnærmingen brukes til kliniske eller bearbeidet prøver som har gjennomgått fiksering med formalin og innebygd i parafinblokker 24,25.
Det er flere viktige fordeler med RNAseq fangst i forhold til microarray, real-time kvantitativ PCR, Sanger-sekvensering og DNA-sekvensering. Microarray er begrenset av høy bakgrunn på grunn av kryss-hybridiseringen og ikke-spesifikk binding av prober. Kvantifisering av gener med low uttrykk er begrenset på grunn av bakgrunnsstøy, mens høyt uttrykte gener målingene påvirkes av signal metning 1. Sammenlignet med RNAseq fangst, viser real-time PCR vanskelig å reprodusere. I tillegg RNAseq åpner for påvisning av nye transkripsjoner, krever mindre startinnsatsmateriale og kan oppdage alternativ spleising 26 .I motsetning til Sanger-sekvensering, RNAseq åpner for høyere gjennomstrømning og analyse av lav uttrykt miRNA. Sanger-sekvensering har vist seg å være et verdifullt verktøy for verifikasjon av fusjoner med kjente exon-ekson veikryss og somatiske DNA mutasjoner, men identifisering av nye fusjoner blir hindret av kravene til en priori kandidat stoppunkt. DNA-sekvensering er ikke kostnadseffektive, krever større lagringsplass for data, og er ute av stand til påvisning av post-transcriptional modifikasjoner.
Det er flere viktige skritt involvert i RNAseq Capture. Først, for å forbedre utbyttet av produkt fra bibliotekRNA / cDNA bestemt paramagnetiske perler og paramagnetiske kuler under vasker, være forsiktig så du ikke over tørke perler, som vil føre til tap av utbytte. Også, ikke under-tørke perlene, sikre alle etanol er fjernet fra prøverørene, som etanol kan redusere cDNA yield. For det andre er den hybridisering av cDNA-biblioteker med komplementære prober avhengig av jevn temperatur, vi anbefale oppvarmingen Wash Buffer I og Streng buffer til 65 ° C i minst to timer på forhånd. Videre, etter at hybridiseringen er det viktig å opprettholde 65 ° C i løpet av de bindende og vasketrinn. De prober som brukes her ble utformet for eksoner av gener av interesse for legemiddelutvikling inkludert kinaser, gener involvert i vanlige rearrangements som transkripsjonsfaktorer, og huset gener. Videre er genet innhold tilpasses og fangst panelstørrelser kan variere. Videre, til ny informasjon om genomiske regioner oppstår, ytterligere sondene kan være utformet og tilsettes til tHan eksisterende fangst panel.
Evaluering av justerings beregninger, spesielt på målet rente, gir informasjon om hvor godt den målrettede regionen ble beriket. En lav på målet rente kan skyldes en mislykket hybridisering og fangst, der ønsket målområdet ikke ble fanget og beriket. I dette tilfellet må en re-hybridisering og fangst av biblioteket settet skal utføres. En lav on-target satsen kan også være på grunn av manglende å utarme rRNA, noe som kan bekreftes ved å beregne prosentandelen av rRNA i prøvene. Høy rRNA andel i utvalget vil kreve re-forberedelse av prøven begynner med rRNA uttømming. I tillegg, hvis bibliotek konsentrasjonen faller under kravene for hybridisering og fangst, vil det være tilrådelig å optimalisere mengden av startinngang for prøven type og kvalitet (område: 50-1,000 ng).
Selv om det finnes flere fordeler for målrettede RNAseq anvendelser, er det også begrensningervurdere. Prøver med dårlig RNA kvaliteten basert på RIN eller grad av fragmentering kan ikke gi kvalitet biblioteker for sekvensering. Flere grupper har vist suksess med formalinfiksert parafin-embedded prøver, men det er prøver som ikke vil passere for sekvense 24,25,27. Videre, siden RNAseq Capture fokuserer på kjente karakterutskrifter, mister fordelene med objektiv RNAseq for roman eller Umerket transkripsjoner. I tillegg, for SNP deteksjon, RNAseq metoder kan bare påvise mutasjoner i uttrykt transkripsjoner.
Fremtidige muligheter for RNAseq Capture inkluderer forskning og kliniske applikasjoner. Nylige oppdagelsen av tusenvis av lange ikke-kodende RNA og deres rolle i biologi vil kreve fokusert karakterisering. I klinikken, kan RNAseq Capture strekke seg utover forskning testing og oversette til kliniske analyser for å karakterisere menneskelig sykdom som kreft, infeksjonssykdommer, og ikke-invasive tester. I forbindelse med genomisk sekvense approaches, kan RNAseq Capture integreres for å studere og karakterisere uttrykt genom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits (24 or 96 reactions) | Roche NimbleGen | 05634261001 or 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| Chloroform | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Dry Bath | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
- Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
- Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
- Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
- Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
- Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
- Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
- Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
- Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
- Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
- DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
- Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
- Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
- Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
- Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
- Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
- Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
- Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
- Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).
