Abstract
RNA sequencing (RNA-Seq) è un metodo versatile che può essere utilizzato per rilevare e caratterizzare l'espressione genica, mutazioni, fusioni geniche e RNA non codificanti. Standard RNA-Seq richiede 30-100.000.000 sequenziamento legge e può includere più prodotti di RNA, come mRNA e RNA non codificanti. Dimostriamo come mirato RNA-Seq (cattura) permette uno studio focalizzato su prodotti di RNA selezionati usando un sequencer desktop. cattura RNA-Seq può caratterizzare le trascrizioni non annotate, bassi, o transitoriamente espressi che potrebbero altrimenti essere perse con metodi tradizionali RNA-Seq. Qui si descrive l'estrazione di RNA da linee cellulari, l'esaurimento di RNA ribosomiale, la sintesi del DNA, preparazione di librerie di codice a barre, l'ibridazione e la cattura di trascrizioni mirate e sequenziamento multiplex su un sequencer desktop. Abbiamo inoltre delineare la pipeline analisi computazionale, che comprende la valutazione di controllo della qualità, l'allineamento, la rilevazione di fusione, l'espressione genica quantificazione e identificazione dei singoli NUCvarianti leotide. Questo test permette di sequenziamento mirato trascrizione per caratterizzare l'espressione genica, fusioni geniche e mutazioni.
Protocol
Nota: Questo protocollo descrive l'elaborazione e l'analisi dei quattro campioni simultaneamente. Questo metodo è compatibile con l'RNA isolato dalle cellule, tessuti congelati freschi e tessuti inclusi in paraffina fissato in formalina (FFPE). Questo protocollo inizia con 50 - 1,000 ng (250 ng raccomandato) di iniziare ingresso RNA per ogni campione.
1. rRNA Depletion e la frammentazione di procedura RNA
- rRNA Depletion
- Rimuovere eluire, primo, mix frammento, mix rimozione rRNA, rRNA tampone di legame e di buffer risospensione da -20 ° C e scongelare a temperatura ambiente. Rimuovere tampone di eluizione, rRNA perline di rimozione e RNA / cDNA perline specifico paramagnetiche da 4 ° C e portare a temperatura ambiente.
- Aggiungere 0,25 mg di RNA a tubo PCR. Diluire il RNA totale con acqua ultra-pura priva di nucleasi per un volume totale finale di 10 ml. Aggiungere 5 ml di rRNA tampone di legame a ciascuna provetta quindi aggiungere 5 ml di mix rimozione rRNA e delicatamente pipette su e giù per mescolare. Porre le provette termociclatore con coperchio preriscaldato a 100 ° C e termociclatore programma a 68 ° C per 5 minuti per denaturare il RNA.
- Dopo RNA denaturazione, rimuovere tubi dal termociclatore e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Vortex rRNA tubo tallone rimozione vigorosamente per risospendere le sfere. Aggiungere 35 ml di rRNA perline di rimozione di nuovi tubi e trasferire la reazione RNA denaturazione (20 ml) per tubi contenenti rRNA perline di rimozione.
- Regolare pipetta per 45 ml e pipetta rapidamente su e giù per 20 volte per mescolare. Incubare le provette a temperatura ambiente per 1 min. Poi posto tubi in stand magnetica a temperatura ambiente per 1 min. Trasferire il surnatante in provette per PCR recentemente etichettati e posizionare nuovamente questi tubi in stand magnetica a temperatura ambiente per 1 min. Ciò assicura che non perline vengono trasferiti. Trasferire il surnatante in provette PCR nuova etichetta.
- Vortex RNA / cDNA perline specifico paramagnetiche e aggiungere 99 ml di perline per ciascun tubo. Delicatamente pipetta interavolume su e giù 10x per mescolare. Se a partire da degradato-RNA, aggiungere 193 ml di ben miscelato RNA / cDNA specifici perline paramagnetici ad ogni provetta. Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Poi posto provette sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Aggiungere 200 ml di appena preparata etanolo 70% (EtOH). Mantenere i tubi su supporto magnetico e fare attenzione a non disturbare le perline. Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Consentire tubi riposare a temperatura ambiente per 5 - 10 min a secco.
- Centrifuga scongelato camera tampone di temperatura di eluizione a 600 g per 5 sec. Aggiungere 11 ml di tampone di eluizione a ciascuna provetta e delicatamente pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Incubare le provette a temperatura ambiente per 2 min. Posizionare tubi sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 5 min. Trasferire 8,5 ml del surnatante in provette PCR nuova etichetta.
- La frammentazione di rRNA impoverito RNA
- Aggiungere 8,5 microlitri elute, 8.5 ml primo, e 8,5 ml mix frammento ad ogni provetta. Delicatamente pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Porre le provette termociclatore con seguente programma: coperchio preriscaldato a 100 ° C, 94 ° C per 8 min, quindi a 4 ° C attesa.
NOTA: Questo passaggio è progettato per generare una dimensione media inserto di 155 bp. Se la dimensione media frammento del campione di RNA è inferiore a 200 bp, saltare questo passaggio e procedere alla First Strand cDNA Synthesis.
- Aggiungere 8,5 microlitri elute, 8.5 ml primo, e 8,5 ml mix frammento ad ogni provetta. Delicatamente pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Porre le provette termociclatore con seguente programma: coperchio preriscaldato a 100 ° C, 94 ° C per 8 min, quindi a 4 ° C attesa.
2. cDNA Synthesis
- Sintetizzare First Strand cDNA
- Rimuovere prima mescola sintesi del filamento da -20 ° C e scongelare a temperatura ambiente.
- Pre-programmare il termociclatore con le seguenti impostazioni: Opzione coperchio preriscaldamento e impostato a 100 ° C, quindi 25 ° C per 10 min, 42 ° C per 15 min, 70 ° C per 15 min e mantenere a 4 ° C . Salva l'applicazione come "Sintetizzare 1 st Strand".
- Centrifuga tubo scongelati-prima sintesi mix Strand a 600 & #215; g per 5 sec. Mescolare 1 ml trascrittasi inversa con 9 ml di primo mix sintesi filamento.
- Aggiungere 8 ml di sintesi primo filone e invertire mix trascrittasi ad ogni provetta, delicatamente pipetta su e giù 6x per mescolare. Tubi di centrifugazione per 4 secondi utilizzando un mini tavolo centrifuga a velocità fissa a 6,0 xg per portare il liquido verso il basso. Mettere i tubi nel termociclatore e selezionare Synthesize 1 st Strand. Quando il termociclatore raggiunge i 4 ° C, rimuovere i tubi e procedere immediatamente a sintetizzare Secondo Strand cDNA.
- Sintetizzare Secondo Strand cDNA
- Pre-heat termociclatore a 16 ° C con coperchio pre-riscaldata a 30 ° C. Scongelare secondo master mix filo e buffer di risospensione sul ghiaccio. In anticipo, rimuovere la bottiglia di perline paramagnetiche tra 4 ° C e lasciare riposare per almeno 30 minuti per portarli a temperatura ambiente.
- Aggiungere 5 ml di tampone risospensione a ciascuna provetta PCR. Centrifuga secondo master mix Strand a 600G per 5 secondi e aggiungere 20 ml ad ogni provetta PCR. Porre le provette in pre-riscaldato termociclatore a 16 ° C per 1 ora. Quando l'incubazione è stata completata, togliere dal termociclatore e permettono tubi di venire a temperatura ambiente.
- Vortex le perline paramagnetici fino a quando non sono ben distribuiti. Aggiungere 90 ml di perline paramagnetici ben misti ad ogni provetta. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare. Incubare le provette a temperatura ambiente per 15 min. Porre le provette sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 5 min.
- Rimuovere ed eliminare 135 ml di surnatante poi lasciare tubi sul supporto magnetico per eseguire lavaggio EtOH. Aggiungere 200 microlitri preparati al 80% EtOH ad ogni provetta senza disturbare le perline, incubare a temperatura ambiente per 30 sec. Rimuovere e gettare tutto il surnatante da ciascuno. Ripetere per un totale di due lavaggi 80% EtOH.
- Lasciare tubi a temperatura ambiente per 5 - 10 minuti ad asciugare su supporto magnetico. Centrifugare La Temperatura stanza scongelatibuffer di risospensione e a 600 g per 5 sec. Rimuovere provette PCR da supporto magnetico. Aggiungere 17,5 buffer di risospensione microlitri a ciascuna provetta PCR e delicatamente pipetta l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente. Incubare le provette per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare tubi sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 5 min, quindi trasferire 15 microlitri surnatante (cDNA a doppio filamento) a 0,2 ml provette strip PCR.
NOTA: Questo è un punto di arresto sicuro come cDNA può essere conservato a -20 ° C per un massimo di 7 giorni.
3. Preparazione Biblioteca
- Ends Adenylate 3 '
- Rimuovere A-tailing mix tra -20 ° C e scongelare a temperatura ambiente. Pre-programmare il termociclatore con le seguenti impostazioni: scegliere l'opzione coperchio preriscaldamento e impostato a 100 ° C, poi a 37 ° C per 30 min, 70 ° C per 5 min e mantenere a 4 ° C. Salva l'applicazione come "ATAIL70."
- Aggiungere 2,5 ml di risospensionetampone ad ogni provetta. Quindi aggiungere 12,5 ml di miscela A-tailing scongelati. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente. Posizionare i tubi nel termociclatore e selezionare ATAIL70. Quando la temperatura termociclatore è a 4 ° C, togliere le provette PCR dal termociclatore e procedere immediatamente a legare gli adattatori.
- Adattatori legare
- Rimuovere appropriate tubi adattatori RNA, smettere di buffer di legatura e buffer di risospensione da -20 ° C e scongelare a temperatura ambiente. Non rimuovere il tubo miscela di legamento da -20 ° C fino a quando non così nel protocollo. Rimuovere la bottiglia di perline paramagnetiche tra 4 ° C e lasciare riposare per almeno 30 minuti per portare a temperatura ambiente.
- Preriscaldare il termociclatore a 30 ° C e scegliere l'opzione coperchio di preriscaldamento ed impostare a 100 ° C. Centrifugare le provette adattatore RNA scongelati a 600 g per 5 sec. Immediatamente prima dell'uso, rimuovere il tubo miscela di legamento da -20 ° CConservazione.
- Aggiungere 2,5 ml di tampone risospensione ad ogni provetta. Aggiungere 2,5 ml di miscela di legamento. Riportare il tubo miscela di legamento a -20 ° C di stoccaggio immediatamente dopo l'uso. Aggiungere 2,5 ml di indice della scheda di RNA scongelati a ciascuna provetta. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente.
- Tubi di centrifugazione per 4 secondi utilizzando un mini tavolo centrifuga a velocità fissa a 6,0 x g. Porre le provette nello termociclatore pre-riscaldato. Chiudere il coperchio e incubare a 30 ° C per 10 min.
- Rimuovere i tubi dal termociclatore e aggiungere 5 ml di tampone legatura arresto per ciascun tubo per inattivare la legatura. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente.
- Ripetere il lavaggio come descritto al punto 2.2.3 - 2.2.4, utilizzando 42 ml di perline paramagnetici misti, e scartando 79,5 ml surnatante. Con i tubi sul supporto magnetico, lasciare che il campione di aria secca a temperatura ambiente per 5 - 10 min.
- Rimuovere i tubi striscia PCR dalsupporto magnetico e aggiungere buffer di risospensione 52,5 ml ad ogni provetta. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente. Incubare le provette a temperatura ambiente per 2 min. Posizionare i tubi sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 5 minuti o fino a quando il liquido è chiaro. Trasferimento 50 ml di surnatante da ogni tubo a nuovi tubi striscia 0,2 ml PCR. Fare attenzione a non disturbare le perline.
- Ripetere il lavaggio come descritto al punto 2.2.3 - 2.2.4, utilizzando 50 ml di perline paramagnetici misti, e scartando 95 surnatante ml. Con i tubi sul supporto magnetico, lasciare che il campione asciugare a temperatura ambiente per 5 - 10 minuti.
- Rimuovere i tubi striscia PCR dal supporto magnetico e aggiungere buffer di risospensione 22,5 ml ad ogni provetta. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente.
- Incubare le provette a temperatura ambiente per 2 minuti. Posizionare i tubi sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 5 minuti o fino a quando il liquido è chiaro. Trasferimento 20 microlitri supernatante da ciascuna provetta in unnuovo 0,2 ml PCR tubo striscia. Fare attenzione a non disturbare le perline. Questo è un punto di arresto sicuro e cDNA può essere conservato a -20 ° C fino a 7 giorni.
4. Biblioteca Amplificazione
- Arricchisci frammenti di DNA
- Rimuovere il mix PCR Master, PCR Primer cocktail e buffer di risospensione da -20 ° C di stoccaggio e scongelare a temperatura ambiente. Rimuovere la bottiglia di perline paramagnetiche dallo stoccaggio 4 ° C e lasciare riposare per almeno 30 minuti per portare a temperatura ambiente.
- Pre-programmare il termociclatore con le seguenti impostazioni: scegliere l'opzione coperchio preriscaldamento e impostato a 100 ° C, quindi impostare denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 sec, 15 cicli di denaturazione a 98 ° C per 10 sec, ricottura a 60 ° C per 30 sec, ed estensione a 72 ° C per 30 sec, un ciclo estensione finale a 72 ° C per 5 min e mantenere a 4 ° C. Salva l'applicazione come "PCR".
- Centrifugare il maestro PCR scongelatimescolare e primer PCR tubi a 600 g per 5 sec. Aggiungere 5 ml di primer PCR scongelati a ciascuna provetta. Aggiungere 25 ml di scongelata master mix PCR per ogni provetta. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente.
- Posizionare i tubi striscia PCR innevate nel termociclatore pre-programmato. Chiudere il coperchio ed eseguire il programma PCR. Quando PCR, rimuovere i tubi dal termociclatore e tenere in ghiaccio.
- Ripetere il lavaggio come descritto al punto 2.2.3 - 2.2.4, utilizzando 50 ml di perline paramagnetici misti, e scartando 95 surnatante ml. Con i tubi sul supporto magnetico, lasciare che il campione di aria secca a temperatura ambiente per 5 - 10 min.
- Rimuovere i tubi dal supporto magnetico e aggiungere buffer di risospensione 32,5 ml per ogni provetta. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte per mescolare completamente. Incubare a temperatura ambiente per 2 min. Collocare le provette PCR sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 5 minuti o fino a quando il liquido è chiaro. Poi il trasferimento 30 ml supernatant a 0,2 ml provette PCR freschi.
- Eseguire quantificazione di cDNA utilizzando un fluorimetro 7 e determinare la qualità cDNA utilizzando un sistema di elettroforesi capillare 8.
NOTA: Questo è un punto di sosta sicura e cDNA possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di 7 giorni. Nota: Questa libreria è considerato una libreria di RNA-Seq.
I passi successivi portano ad una libreria di cattura.
5. Ibridazione, Cattura e Sequencing
- ibridazione multiplex
- Rimuovere le sonde idratata personalizzati, Cot-1 DNA, oligonucleotidi blocco universali, e adattatore specifico oligo blocco da -20 ° C e scongelare il ghiaccio.
- In una provetta ml bassa legano 1.5, unire 500 ng di DNA (125 ng per esempio quando multiplexing 4 campioni), 5 ml Cot-1 DNA (1 mg / mL), 1UL oligos blocco universali, 0,5 ml p7 (6 nucleotide) adattatore specifico bloccando oligonucleotidi (tale importo può essere necessario un aggiustamento a seconda conditi multiplexons) e 0,5 ml p7 (8 nucleotide) Adattatore specifici oligonucleotidi di blocco (tale importo può essere necessario modificare a seconda delle condizioni multiplex).
- Posizionare la provetta in un concentratore a vuoto con tappo aperto rivolto verso il senso di rotazione opposto. contenuto secco a 45 ° C per 20 minuti o fino a completa evaporazione del liquido.
- Risospendere contenuti secca con 8,5 microlitri 2x tampone di ibridazione, 3,4 ml componente ibridazione A e acqua priva di 1,1 microlitri di nucleasi. Lasciare 10 minuti per la risospensione e vortex ogni 2,5 minuti. Trasferire risospese materiale in una provetta 0,2 ml PCR e incubare a 95 ° C per 10 min in un termociclatore.
- Rimuovere provetta ibridazione dal termociclatore e aggiungere 2 ml di sonde personalizzate risospese ad una concentrazione di 1,5 pmol / ml. In alternativa, aggiungere 4 ml di sonde personalizzate risospese ad una concentrazione di 0,75 pmol / ml. Incubare reazione di ibridazione durante la notte (16-24 ore) a 65 ° C.
NOTA: Sondas acquistati dai vari fornitori possono essere utilizzati e le istruzioni del produttore devono essere seguite. La durata della fase di ibridazione può anche variare.
- Bead Preparazione e Capture
- Rimuovere bottiglia di perline paramagnetici streptavidina accoppiata da 4 ° C ed equilibrare a temperatura ambiente per 30 min. Diluire 10x Wash Buffer (I, II, III, e stringenti) e 2.5x Bead tampone di lavaggio per creare soluzioni di lavoro 1x.
- Aliquota 140 ml di tampone di lavaggio 1x I in in una nuova provetta da 1,5 ml. Calore intera quantità di 1x tampone rigorose e aliquota di tampone di lavaggio 1x I a 65 ° C in un blocco di calore per almeno 2 ore.
- Aliquota 100 ml di perline paramagnetici streptavidina accoppiata per acquisizione in una provetta da 1,5 ml. Posizionare il magnete e scartare il surnatante. Aggiungere 200 ml di lavaggio tallone tampone per 100 perline microlitri e vortex per 10 secondi. Posizionare il magnete per 2-5 minuti o fino a quando il surnatante è chiaro. Una volta che il surnatante è chiaro, scartarla e ritorba ancora per un totale di due lavaggi.
- Dopo la rimozione del tampone di lavaggio perla, aggiunge un volume uguale di tampone di lavaggio tallone come il volume iniziale di partenza (ad esempio, 100 ml per una acquisizione). Risospendere e trasferire in una provetta da 0,2 ml PCR. Posizionare il tubo in cremagliera magnetica per 2-5 minuti o fino a quando il surnatante è chiaro. surnatante degli scarti.
- Con sia il campione ibridazione e perline nel termociclatore a 65 ° C, il trasferimento della miscela di ibridazione al tubo tallone e pipettare su e giù 10x per miscelare. Incubare a 65 ° C per 45 minuti, vortice e spin down campione per 4 secondi con una velocità fissa (6,0 xg) da tavolo mini centrifuga.
- Bead Wash
- Rimuovere il tubo cattura da termociclatore e aggiungere 100 ml di pre-riscaldato 1x tampone di lavaggio I della provetta e vortex per 10 secondi per mescolare. Trasferire il composto in una bassa tubo ml fresca legano 1.5. Posizionare il tubo in un rack di separazione magnetica e consentire 2-5 minuti per la separazione o fino a quando il surnatante è chiaro. Dsurnatante iscard.
- Aggiungere 200 microlitri preriscaldato tampone di lavaggio stringente 1x e pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Incubare a 65 ° C per 5 min. Posizionare la provetta nel rack di separazione magnetica e consentire 2 - 3 minuti per la separazione o fino surnatante è chiaro. surnatante degli scarti. Ripetere lavaggio stringente ancora per un totale di due lavaggi.
- Aggiungere 200 microlitri 1x temperatura ambiente tampone di lavaggio I e vortex per 2 minuti per mescolare. Posizionare il tubo nel rack di separazione magnetica e permettendo 2-5 minuti per la separazione o fino a quando il surnatante è chiaro. surnatante degli scarti.
- Aggiungere 200 microlitri 1x temperatura ambiente tampone di lavaggio II e vortex per 1 minuto per mescolare. Posizionare il tubo nel rack di separazione magnetica e permettendo 2-5 minuti per la separazione o fino a quando il surnatante è chiaro. surnatante degli scarti.
- Aggiungere 200 microlitri 1x temperatura ambiente tampone di lavaggio III e vortex per 30 secondi per mescolare. Posizionare il tubo nel rack di separazione magnetica che permette 2-5 minuti per la separazione o fino a quando il surnatanteè chiaro. surnatante degli scarti.
- Rimuovere il tubo dal rack di separazione magnetica e aggiungere acqua priva di nucleasi 20 microlitri per risospendere le sfere. Mescolare accuratamente pipettando su e giù per 10 volte.
- Messaggio Capture PCR Amplificazione
- Rimuovere perline paramagnetiche da 4 ° C ed equilibrare a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere il hot start PCR Ready Mix (2x) e PCR Primer Mix da -20 ° C e scongelare a temperatura ambiente e poi posto sul ghiaccio. Preparare biblioteca amplificazione Mix Master combinando 27,5 ml di 2x hot start PCR Ready Mix con 2,75 ml di PCR Primer 1 e 2,75 ml di PCR Primer 2 (questi volumi sono per 1 biblioteca ibridazione più il 10% in eccesso).
- Imposta la reazione in provetta PCR con l'aggiunta di 20 ml di perline più DNA catturato con 30 ml di amplificazione biblioteca master mix per un volume totale di 50 ml. Cap tubo correttamente e vortex per miscelare. Tubi di centrifugazione per 4 secondi utilizzando una mini scheda velocità fissale-top centrifugare a 6,0 x g.
- Impostare il seguente programma PCR: selezionare l'opzione coperchio preriscaldamento e impostato a 100 ° C, quindi impostare denaturazione iniziale a 98 ° C per 45 sec, 10 - 12 cicli di denaturazione a 98 ° C per 15 sec, ricottura a 65 ° C per 30 sec e estensione a 72 ° C per 60 sec, un ciclo estensione finale a 72 ° C per 60 sec e mantenere a 4 ° C.
- Rimuovere campione dal termociclatore e aggiungere 75 microlitri perline paramagnetici. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Posizionare tubi sul magnete a temperatura ambiente per 2 - 3 min e quindi rimuovere surnatante. Lavare perline su magnete con l'aggiunta di 200 ml 80% di etanolo, incubando per 30 secondi quindi rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi 80%.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 - 10 minuti per consentire perline ad asciugare. Non più asciutto per cracking. perline Risospendere in 22 ml di Tris-EDTA pH 8.0 (1x TE Solution) e consentire 3 min per eluizione. Collocare il campione sulla calamita per 3 - 5 min °en trasferimento 20 ml di prodotto eluito ad un nuovo basso-bind 1,5 ml di tubo, garantendo che non perline vengono riportati.
- Eseguire la quantificazione di cDNA catturati utilizzando fluorimetro 7 e determinare la qualità cDNA catturato utilizzando un sistema di elettroforesi capillare 8.
- Sequencer Desktop Caricamento Procedura 9
- Diluire libreria di cDNA catturata ad una concentrazione finale di 4 nM utilizzando 10 mM Tris-Cl pH 8,5 con 0,1% Tween 20. Scongelare 10 N NaOH e tampone di ibridizzazione su ghiaccio. Circa 30 minuti prima dell'uso, del desktop sequencer v2 reagente scatola del kit 1 in acqua RT disgelo. Non superare Linea di riempimento massimo 10. Si prega di notare che questo è una procedura specifica piattaforma di sequenziamento e possono variare secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare 1 ml di 0,2 N NaOH mediante la combinazione di 20 l 10 N NaOH con acqua priva di 980 microlitri di nucleasi in una provetta (preparare sempre fresco). Diluire la libreria Phix (controllo della libreria) a 4 nmcombinando 2 ml di 10 di controllo della libreria nM con 3 ml 10mM Tris-Cl pH 8,5 con 0,1% di Tween 20.
- Denaturare biblioteca finale e controllo della libreria, combinando 5 ml di biblioteca 4Nm con 5 ml di 0,2 N NaOH e vortex brevemente per miscelare. Tubi di centrifugazione per 4 secondi utilizzando un mini tavolo centrifuga a velocità fissa a 6,0 x g. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per denaturare le librerie.
- Aggiungere 990 ml di tampone di ibridazione pre-raffreddata alle provette contenenti 10 ml di librerie denaturati. Ciò si traduce in una libreria di 20 pM. Mark biblioteca ore 20 denaturato con la data e può essere conservato per un massimo di 3 settimane a -20 ° C.
- Mescolare 375 ml di 20 pM di controllo della libreria con 225 ml di buffer di ibridazione pre-refrigerata e controllo della libreria diluito comportare un controllo della libreria 12:05. Capovolgere più volte per miscelare la soluzione.
- Unire 594 ml di biblioteca finale denaturato con 6 ml di 12:05 di controllo della libreria denaturato e vortex per miscelare. Impostare la SAMP combinatoLe biblioteca e controllo della libreria da parte su ghiaccio fino campioni sono pronti a caricare nella cartuccia del reagente del desktop sequencer.
Analisi 6. Dati
- Valutazione della qualità Sequenza
- Calcolare la qualità dei dati di sequenza grezzi (file FASTQ) utilizzando la sequenza di valutazione della qualità 11.
NOTA: Questo passaggio consente di valutare i dati prima di essere ulteriormente sottoposto ad analisi a valle. Il software funziona con i parametri in-built e produce una serie di metriche per ogni file FASTQ.
- Calcolare la qualità dei dati di sequenza grezzi (file FASTQ) utilizzando la sequenza di valutazione della qualità 11.
- Allineamento
- Allineare sequenza di legge (file FASTQ) al genoma hg19 di riferimento umano e del trascrittoma con Tophat2 12 (versione 2.0.10), fornendo le trascrizioni conosciute come file GTF. L'uscita è sotto forma di un formato di allineamento binario chiamato il file BAM.
- Eseguire i passaggi post-elaborazione, tra cui l'ordinamento e l'indicizzazione utilizzando Samtools 13 (versione 0.1.19) Sul file BAM. Eseguire duplicato marcatura, riordino SAM, inserire calcolo delle dimensioni e aggiungere o sostituire i gruppi di lettura utilizzando strumenti Picard 14 (versione 1.84).
- Valutazione della qualità RNA-Seq
- Calcolare una serie di parametri di controllo di qualità per i dati di RNA-Seq utilizzando valutazione della qualità RNA-Seq. L'ingresso a questo software è un file di BAM 15 dall'allineamento Tophat2. L'uscita è un file HTML che elenca conteggio letto totale, duplicati, mappata leggere la percentuale e la percentuale rRNA, ecc, tra gli altri.
- Calling variante
- Utilizzare STAR (versione 2.4.0) 16 per l'allineamento e quindi chiamare singolo nucleotide varianti usando di GATK (versione 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM fasi di post-elaborazione e criteri di filtro per la bandiera ed eliminare i falsi positivi dall'output.
- Espressione genica
- Calcola l'espressione genica USIsoftware ng gemelli (versione 2.1.1) da suite di Tuxedo 18.
NOTA: l'ingresso è un file di BAM da strumento di allineamento Tophat2. L'uscita è prodotta a livello isoforma, geni e trascrizione, in cui l'espressione è calcolato come FPKM (Frammenti per kilobase per milione mappato letture).
- Calcola l'espressione genica USIsoftware ng gemelli (versione 2.1.1) da suite di Tuxedo 18.
- Fusion Calling
- Chiama fusioni di ogni campione usando ChimeraScan 19 (versione 0.4.5), Tophat Fusion 20 costume e TRUP 21. Annotare le fusioni per i domini che utilizzano Oncofuse 22 (versione 1.0.9b2).
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Representative Results
A evidenziando schematica passaggi chiave nel RNA-Seq Capture è mostrato in Figura 1. Quattro linee di cellule di cancro con mutazioni note sono stati usati per dimostrare l'efficacia della tecnica RNA-Seq Capture (K562 con ABL1 fusione, LC2 con la fusione RET, EOL1 con PDGFRalpha fusion e RT 4 con la fusione FGFR3). I quattro campioni sono stati raggruppati insieme e sequenziato con 2x 100 bp si legge su un sequencer desktop, che genera file FASTQ. file FASTQ sono stati eseguiti attraverso un'analisi condotta RNA-Seq, che comprende cinque componenti principali: 1) la valutazione di controllo della qualità, 2) l'allineamento di trascrittoma umano, 3) quantificazione dell'espressione genica, 4) chiamata fusione, e 5) la variante di chiamata. Il file di allineamento (BAM) viene utilizzato per chiamare le varianti a singolo nucleotide e calcolare l'espressione genica. Fusioni sono chiamate utilizzando i chiamanti di fusione, come TopHat Fusion (che svolgono il proprio allineamento) e l'uscita è annotati using software di rilevamento di fusione.
Confronto di espressione genica da RNA-Seq e la cattura dimostra l'arricchimento delle trascrizioni mirati da 10 a 1.000 volte utilizzando il metodo di cattura (Figura 2A). Inoltre, la figura 2B mostra un aumento della percentuale di letture mappatura alle regioni trascrizione mirati utilizzando cattura rispetto al RNA-Seq. La valutazione delle misure di controllo di qualità è rappresentata in figura 3. Cattura e RNA-Seq eseguire in modo uguale in termini di allineamento per il trascrittoma (3A, 94% contro 93%) e la dimensione media inserto (3B, 174 bp rispetto a 162 bp). Utilizzando il metodo di acquisizione, una percentuale maggiore di regioni exonic sono sequenziato (3C, 77% vs. 60%), e viceversa una percentuale inferiore di regioni introniche sono sequenziato (3D, 4% vs. 20%). Totale conteggi di lettura per campione sono rappresentati in 3E (3F, 4% vs. 15%).
Uscita di rilevamento di fusione indicato nella tabella 1 è generato con la fusione normalizzata sostenere legge. Capture RNA-Seq ha avuto successo nella rilevazione fusioni per tutti e quattro linee di cellule. Confronto di varianti di singoli nucleotidi chiamati in sovrapposizione regioni di cattura e RNA-Seq viene visualizzato nella Figura 4. Ciò dimostra un'elevata concordanza di varianti tra Capture e RNA-Seq all'interno della regione bersaglio.
Figura 1. Schema di RNA-Seq cattura passaggi. In questa dimostrazione sperimentale, l'RNA è il primo depleted di RNA ribosomiale, seguita dalla frammentazione chimica e sintesi di DNA complementare (cDNA) mediante trascrittasi inversa. Successivamente, il cDNA è poliadenilato e legatura su entrambe le estremità agli adattatori specifici della piattaforma per generare una libreria. Solo librerie di cDNA con appositi adattatori sono poi amplificati con la PCR. Le biblioteche sono poi ibridati a sonde oligonucleotidiche personalizzati e acquisite utilizzando sfere magnetiche. Questa piccola quantità di biblioteca catturato deve essere amplificato una seconda volta per avere abbastanza per la prossima generazione sequenziamento. librerie multiple possono poi essere sequenziato in parallelo. Dati di sequenziamento vengono analizzati per gli eventi di RNA di interesse come fusioni geniche, espressione o mutazioni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. CONFRONTO dei geni mirati nella cattura contro RNA-Seq. A, confronto Espressione genica tra la cattura e RNA-Seq in quattro linee di cellule tumorali K562, LC2, EOL1 e RT-4 misurati da legge per kilobase per milione mappato legge (FPKM) (Log scala). Geni mirati di interesse sono arricchiti (blu) rispetto ai geni non mirati (in grigio). B, Percentuale di letture mappatura per regione di destinazione è aumentata in Capture contro biblioteche RNA-Seq in quattro linee di cellule tumorali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. sequenziamento metriche di cattura contro RNA-Seq in quattro Rappresentante Cancer Cell Lines. A, Percentuale di legge mappatura del trascrittoma,
| Linea cellulare | Fusione | Type library | Total Reads | Sull'obiettivo Legge | Fusion normalizzato Sostenere Legge (NFSR) | ||
| TophatFusion | ChimeraScan | TRSU | |||||
| K562 | BCR-ABL | RNA-Seq | 150.300.482 | 279.438 | 0 | 438 | 0 |
| Catturare | 9.341.148 | 7.566.087 | 598 | 343 | 0 | ||
| LC2 | CCDC6-RET | RNA-Seq | 128.861.790 | 307.566 | 0 | 97 | 0 |
| Catturare | 12.320.692 | 10.314.284 | 71 | 44 | 6 | ||
| EOL1 | FIP1L1-PDGFRA | RNA-Seq | 135.321.406 | 225.222 | 0 | 0 | 170 |
| Catturare | 9.317.418 | 7.680.818 | 143 | 0 | 7 | ||
| RT4 | FGFR3 -TACC3 | RNA-Seq | 161.350.024 | 208.741 | 0 | 131 | 469 |
| Catturare | 8.305.950 | 6.563.574 | 358 | 88 | 34 | ||
Tabella 1. Individuazione Fusion per Capture contro RNA-Seq di K562, LC2, EOL1 e RT-4. Questa tabella mostra quattro linee di cellule tumorali e tre diversi algoritmi di rilevamento di fusione, TopHat2, ChimeraScan, e TRUP utilizzate in questa dimostrazione. Questa tabella dimostra la capacità di rilevare fusioni con la cattura utilizzando meno di 10 milioni di totale letture rispetto a più di 60 milioni di letture utilizzate per RNA-Seq. Fusion che supporta letture sono stati calcolati dividendo la fusione sostenendo legge da chinasi legge, moltiplicato per un milione.
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Figura 4. SNV chiedendo cattura contro RNA-Seq. Questi diagrammi di Venn visualizza il numero di Single Nucleotide varianti (SNVs) che sono stati rilevati da Capture e RNA-Seq per ciascuna delle quattro linee di cellule (K562, LC2, EOL1 e RT-4). Questo illustra alta concordanza di SNVs tra la cattura e RNA-Seq all'interno mirata-regione:. K562 (81,3%), LC2 (78,3%), EOL1 (89,5%) e RT-4 (73,9%) Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.
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Discussion
RNA-Seq Capture è una strategia intermedia tra RNA-Seq e microarray approcci per la valutazione di una parte selezionata del trascrittoma. I vantaggi di cattura comprendono la riduzione dei costi, tempi di consegna rapidi su un sequencer desktop, throughput elevato, e la rilevazione di alterazioni genomiche. Il metodo può essere adattato per caratterizzare non codificanti RNAs 23, rilevare singolo nucleotide varianti 4-6, esaminare RNA splicing, e per identificare fusioni geniche o riarrangiamenti strutturali 24. Inoltre, questo approccio può essere applicato a campioni clinici o trasformati sottoposti fissazione con formalina ed inclusi in paraffina blocchi 24,25.
Ci sono diversi vantaggi significativi di cattura RNA-Seq rispetto ai microarray, real-time PCR quantitativa, sequenziamento Sanger e il sequenziamento del DNA. Microarray è limitato dal fondo elevato a causa di cross-ibridazione e legame di sonde non specifico. Quantificazione dei geni con lespressione ow è limitato a causa del rumore di fondo, mentre le misure di geni altamente espressi sono influenzati da saturazione del segnale 1. Rispetto alla cattura RNA-Seq, real-time PCR si rivela difficile da riprodurre. Inoltre, RNA-Seq permette di individuare nuove trascrizioni, richiede meno materiale in entrata di partenza e in grado di rilevare alternativa splicing 26 .In contrasto con sequenziamento Sanger, RNA-Seq consente un throughput più elevato e l'analisi di basso espresso miRNA. Sanger sequenziamento ha dimostrato di essere un valido strumento per la verifica delle fusioni con note giunzioni esone-esone e mutazioni del DNA somatiche, tuttavia identificazione di nuove fusioni è ostacolato da esigenze di un punto di interruzione candidato priori. sequenziamento del DNA non è costo efficiente, richiede più spazio di archiviazione per i dati, ed è incapace di rilevazione di modificazioni post-trascrizionali.
Ci sono diversi passaggi critici coinvolti nel RNA-Seq Capture. In primo luogo, per migliorare la resa dei prodotti di libreria dalRNA / cDNA perline specifico paramagnetiche e perline paramagnetici durante i lavaggi, stare attenti a non più di asciugare le perline, che porterà alla perdita di resa. Inoltre, non sotto-asciugare le perline, assicurano tutto l'etanolo viene rimosso dalle provette dei campioni, come etanolo può ridurre la resa cDNA. In secondo luogo, l'ibridazione di librerie di cDNA con sonde complementari dipende dalla temperatura costante, si consiglia riscaldamento Wash Buffer I e rigorosi tampone a 65 ° C per almeno due ore di anticipo. Inoltre, dopo l'ibridazione è essenziale per mantenere 65 ° C durante le fasi di legame e lavare. Le sonde usate qui sono stati progettati per gli esoni dei geni di interesse per lo sviluppo di farmaci tra cui chinasi, geni coinvolti in riarrangiamenti comuni come fattori di trascrizione e geni house keeping. Inoltre, i contenuti del gene è personalizzabile e dimensioni dei pannelli cattura può variare. Inoltre, come nuove informazioni sulle regioni genomiche pone, sonde aggiuntive possono essere progettati e aggiunti tpannello Acquisizione ha esistente.
Valutazione delle metriche di allineamento, in particolare dei tassi on-target, fornisce informazioni sul modo in cui la regione di destinazione è stata arricchita. Un basso tasso di on-target può essere dovuto a una ibridazione e la cattura fallito, per cui la regione di destinazione desiderato non è stato catturato e arricchito. In questo caso, una ri-ibridazione e la cattura del set libreria devono essere eseguite. Un basso tasso di on-bersaglio può anche essere dovuto a una mancata deplezione rRNA, che può essere confermata calcolando la percentuale di rRNA nei campioni. alta percentuale di rRNA all'interno del campione richiede ri-preparazione del campione che inizia con l'esaurimento rRNA. Inoltre, se la concentrazione biblioteca scende sotto i requisiti per l'ibridazione e la cattura, sarebbe opportuno ottimizzare la quantità di input di inizio del tipo e qualità del campione (range: 50-1,000 ng).
Mentre ci sono molti vantaggi per le applicazioni di RNA-Seq mirate, ci sono anche limitazioniprendere in considerazione. I campioni con scarsa qualità RNA sulla base di RIN o grado di frammentazione, non possono produrre librerie di qualità per il sequenziamento. Diversi gruppi hanno dimostrato il successo con i campioni inclusi in paraffina fissati in formalina, tuttavia ci sono campioni che non passerà per il sequenziamento 24,25,27. Inoltre, dal momento che RNA-Seq Capture si concentra sulle trascrizioni noti, perde i benefici di RNA-Seq imparziale per il romanzo o trascrizioni non annotate. Inoltre, per il rilevamento SNP, i metodi di RNA-Seq possono rilevare solo mutazioni in trascritti espressi.
Future opportunità di RNA-Seq Capture sono la ricerca e applicazioni cliniche. Recente scoperta di migliaia di lungo RNA non codificante e il loro ruolo nella biologia richiederà caratterizzazione concentrata. Nella clinica, RNA-Seq Capture può estendersi oltre la ricerca di test e tradurre in test clinici per caratterizzare malattie umane come il cancro, malattie infettive, e il test non invasivo. In concomitanza con genomico avvicinamen sequenziamentoChes, RNA-Seq Capture può essere integrato per studiare e caratterizzare il genoma espresso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits (24 or 96 reactions) | Roche NimbleGen | 05634261001 or 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Nuclease Free Water | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 SIDE EACH | Life Technologies | 12331D | |
| Chloroform | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Dry Bath | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
References
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