Summary
Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.
Abstract
Angehende Hefe hat als Modell bei der Untersuchung von Proteinen verbunden mit menschlicher Krankheiten verbreitet. Genomweite genetisches Screening ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig in Hefe Studien verwendet. Der Ausdruck einer Reihe von neurodegenerativen Krankheit-assoziierte Proteine in Hefe verursacht Zytotoxizität und Aggregatbildung, Rekapitulation Befunde bei Patienten mit diesen Erkrankungen gesehen. Hier beschreiben wir eine Methode für das screening ein Hefe-Modell des Amyotrophic Lateral Sclerosis-assoziierten Proteins FUS für Modifikatoren von seiner Giftigkeit. Anstelle von Transformation, setzt diese neue Screening-Plattform auf die Paarung von Hefe eine angeordneten Bibliothek von Plasmiden in der Hefe-Modell einführen. Die Paarung Methode hat zwei Vorteile: Erstens ist es sehr effizient; Zweitens kann die bereits transformierte angeordneten Bibliothek der Plasmide für langfristig als ein Glycerin-Lager, und schnell auf andere Bildschirme ohne den arbeitsintensiven Schritt der Transformation in das Hefe-Modell angewendet jedes Mal gespeichert werden. Wir zeigen, wie erfolgreich diese Methode verwendet werden kann zum Bildschirm für Gene, die die Toxizität von FUS zu ändern.
Introduction
Die angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae hat in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung1 verbreitet, um zelluläre Prozesse, die direkt im Zusammenhang mit Krankheiten des Menschen zu verstehen. Darüber hinaus hat es als Modellorganismus verwendet worden für Studium menschlichen krankheitsassoziierten Proteine, wie diejenigen, die am häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und Amyotrophe verbunden Lateralsklerose (ALS)2. Ein Vorteil der Hefe-Modells ist die Leichtigkeit, mit der ein genomweite Bildschirm ausgeführt werden kann, um zelluläre Signalwege, die im Zusammenhang mit der Toxizität von krankheitsbezogenen Proteine, wodurch Einblicke in den Mechanismus der Toxizität zu identifizieren. Ein solcher Bildschirm nennt einen Überexpression Bibliothek Bildschirm, in dem jedes 5.500 Hefe-Gene in einer angeordneten Bibliothek umgewandelt ist ein Hefe-Modell zu identifizieren, welche Gene Toxizität bei überexprimiert ändern können. Dieses Screening-Methode wurde erfolgreich in den Hefe-Modellen der mehrere Neurodegenerative Krankheit-verbundenen Proteine, einschließlich Huntingtin für Chorea Huntington3, α-Synuclein für Parkinson-Krankheit4,5 angewendet , Aβ für Alzheimer-Krankheit6, und FUS und TDP-43 ALS7,8,9. Während es in der Regel in einer Weise Hochdurchsatz-10erfolgt, ist die aufwändigste Schritt des Bildschirms individuell 5.500 Hefe-Gene aus einer angeordneten Bibliothek verändern. Dieser Schritt muss jedes Mal, wenn das Screening wiederholt durchgeführt werden, und wenn ein neu gegründeten Hefe-Modell untersucht werden muss. Es ist wichtig, einen effizienteren Weg, um diese Aufgabe zu finden.
Hefezellen können stabil in haploide und diploide Formen existieren. Es gibt zwei gegenüberliegende Paarung Arten von haploiden Zellen, Paarung Typ ein und α. haploiden Zellen von jeder Paarung produzieren und sezernieren ihre eigenen spezifischen Paarung Pheromon, auf die nur die entgegengesetzte Paarung Typ Zellen reagieren. Dies ermöglicht die Paarung zwischen ein und α Zellen, stabile diploide Zellen, a/α zu produzieren. Dieser Prozess ist spontan und hocheffiziente11. Wir profitieren von dieser einzigartigen Lebenszyklus von S. Cerevisiae , Plasmid-Bibliothek einzuführen. Genauer gesagt, wird jedes Gen in der angeordneten Plasmid-Bibliothek in haploiden Zellen eine Paarung Art, d. h., α Zellen umgewandelt werden. Diese Zellen mit den Genen der Bibliothek werden dann auf Glycerin Lager in einem angeordneten 96-Well-Format gespeichert werden. Für jedes Modell der Hefe, die untersucht werden muss, können Hefezellen mit den Bibliothek-Genen aus dem Glycerin bestand aufgetaut werden und das Screening kann erfolgen durch Paarung mit dem Hefe-Modell des Interesses an der gegenüberliegenden Paarung Typ, d.h.Paarung ein. Diese Idee der Verwendung Paarung von zwei Gene in der Hefe zusammenzubringen ist nicht neu. Es wurde erfolgreich in der Hochdurchsatz-Hefe angewendet, die zwei-Hybrid-Screening, in dem ein Köder zu konstruieren (d.h.Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionen) in einer Paarung zusammen gebracht wird, durch Paarung mit einer Beute-Konstrukt aus einer angeordneten Bibliothek 12. jedoch wurde diese Strategie nie in Überexpression Bibliothek Vorführungen, derer immer traditionelle Transformationsmethoden angewendet.
Unser Labor gegründet zuvor ein Hefe-Modell von ALS-assoziierten Protein FUS7. Durch Überexpression Bibliothek Screening mit der Transformationsmethode entdeckten wir fünf Hefe-Gene (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1und VHR1), die Toxizität von FUS bei überexprimiert zu retten. Diese Ergebnisse waren unabhängig von einer anderen Gruppe8mit einer ähnlichen Studie bestätigt. hUPF1, eine menschliche Homolog des ECM32, wurde später gezeigt, Toxizität in primären Nervenzellen13 und im Tiermodell ALS14 sowie zu unterdrücken. Mit diesen fünf Gene als Kaufnachweis Prinzip, zeigen wir, dass alle fünf Gene ebenso FUS Toxizität zu retten, wenn sie bei der Paarung in die FUS-Hefe-Modell eingeführt werden. Da Hefezellen mit den Bibliothek-Genen können dauerhaft in Glycerin Lager gespeichert und wiederbelebt, wenn nötig, wird diese Paarung basierende Methode den zeitaufwendigsten Schritt der Transformation jedes Mal entfernen braucht die Bibliothek gegen untersucht werden. Da die Paarung hocheffiziente ohne Plasmid Transformation beteiligt ist, verringert sich diese Strategie auch erheblich die Kosten für Reinigung und Transformation einer großen Plasmid-Bibliothek. Wir wenden diese Methode erfolgreich zu einer Bibliothek screening gegen Hefe Modell des FUS.
Das Verfahren für die Paarung-basierten Screening ist in Abbildung 1kurz beschrieben. Zunächst die angeordneten Plasmid-Bibliothek verwandelt sich in einen haploiden Hefe-Stamm der Paarung Typ α mit einem Hochdurchsatz-Hefe Umwandlung Protokoll, in dem jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer bestimmten Bibliothek Plasmid transformiert Hefe enthält. Diese Sammlung von transformierten Hefe wird als Glycerin Stapel gespeichert, die aufgetaut und für den Einsatz später wiederbelebt werden kann. Das Hefe-Modell von Interesse, in diesem Fall FUS Toxizität muss in einem haploiden Hefestamm mit der gegenüberliegenden Paarung Art erzeugt werden (Typ Paarung ein). In gewissem Hochdurchsatz-mit sterilen 96-poligen Replikatoren die FUS Belastung und Hefestämme mit Plasmid-Bibliothek auf 96-Well-Platten mit rich-Media übertragen und erlaubt zu Paaren. Folgende Paarung, ein kleines Volumen von jedem Brunnen der Paarung Kultur wird in 96-Well-Platten mit synthetischen ausfallende Medien in welche nur diploid Hefe enthält sowohl die FUS übertragen und Bibliothek Gene wachsen können. Eine Roboter-spotting Maschine dient dann Hefekultur von jedem Bohrloch auf Agarplatten zu übertragen, wo der Ausdruck der FUS und die Bibliothek Gene induziert wird. Darüber hinaus ist Hefekultur gesichtet, um Agarplatten zu steuern, wo FUS und die Bibliothek Gene nicht zum Ausdruck kommen. Nach einem Wachstum auf Agarplatten werden Gene, die zu retten oder verschlimmern FUS Toxizität identifiziert werden.
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Protocol
Hinweis: Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für screening-Bibliothek Plasmide in zehn 96-Well-Platten enthalten aber kann skaliert werden oben oder unten entsprechend. Das Protokoll muss wiederholt werden, um die gesamte Bibliothek Überprüfung abzuschließen. In der Regel kann Abschirmung gegen 10 Platten Bibliothek Gene jeweils bequem durch 1 Person behandelt werden.
1. Vorbereitung für 96-Well-Hefe-Transformation
Hinweis: Dieser Schritt ist wie zuvor beschrieben7,10durchgeführt.
- Aliquoten 5 µL (ca. 50 – 100 ng) der Plasmid-DNA aus einer angeordneten Plasmid-Bibliothek in jede Vertiefung ein Rundboden-96-Well-Platte.
Hinweis: Ein Beispiel für solch eine Bibliothek wäre eine Hefe gen Überexpression Bibliothek10. - Impfen Sie 150 mL Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Medien in eine 500 mL-Flasche mit einer Kolonie (2 – 3 mm Durchmesser) von der haploiden Hefe-Stamm W303α. Brüten sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min).
- Am nächsten Morgen messen die OD600 der Übernacht-Kultur und verdünnen die Hefekultur OD600 = 0,1 (bis zu) 2 l YPD. Inkubieren sie bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min) ~ 5 h bis die Kultur OD600 erreicht = 0,4 – 0,6.
2. Hefe-Transformation
- Ernte die Hefekultur 8 sterile 250 mL Zentrifuge Flaschen füllen und Zentrifugieren sie bei Raumtemperatur bei 3.000 X g für 10 Minuten abgießen der Überstand ohne Unterbrechung das Pellet.
Hinweis: Führen Sie alle Schritte der Zentrifugation bei Raumtemperatur. - Waschen Sie die Hefe mit sterilem destilliertem H2O. 100 mL sterilen H2O hinzufügen, jede Flasche Zentrifuge und Wirbel um die Zelle Pellet aufzuwirbeln. Kombinieren Sie die gewaschenen Zellen in 2 Flaschen und Zentrifuge auf 3.000 X g für 5 min. Weg des Überstands Gießen.
- Waschen Sie die Zellen in jeder Flasche in 100 mL der 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc, 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) und Zentrifugieren sie 3.000 x g für 5 min. Gießen aus der Überstand.
- Beim Zentrifugieren, 5 mL Lachs Samenzellen DNA (10 mg/mL) bei 100 ° C mit einem Block Heizung für 3 min. Kochen und dann abkühlen auf Eis.
- Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE in jeder Flasche, kombinieren Sie die resuspendierte Zellen und übertragen Sie sie auf eine 150 mL Flasche. 5 mL der vorgekühlten Lachsen Samenzellen DNA und bei 30 ° C mit schütteln (225 u/min) für 30 min inkubieren.
- Den Teig Zelle in eine sterile Einweg-Reagenz-Reservoir und mit einer Mehrkanal-Pipette, 35 µL der Zelle Mischung in jede Vertiefung der Rundboden-96-Well-Platte, enthält die Bibliothek Plasmid DNA übertragen. Wirbel der 96-Well-Platten mit einer Platte Vortexer für 1 min bei 1.000 u/min. Inkubieren Sie die Platten für 30 min bei 30 ° C ohne schütteln.
Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht, so kann die Wärme effizienter übertragen. Wir haben festgestellt, dass aufschütteln der 96-Well-Platten bei 1.000 u/min verursacht keine Flüssigkeit, aus dem Brunnen zu verschütten, aber eine sichere Wirbel Geschwindigkeit getestet werden, sollte bevor Sie den Schritt ausführen. - Bereiten Sie in einem Kolben 200 mL des Puffers Transformation, eine Endkonzentration von 40 % PEG3350, 10 % DMSO und 0,1 M LiOAc enthält. Vorbereitung des Umwandlung Puffers unmittelbar vor der Anwendung und durch Schütteln mischen.
- Entfernen Sie 96-Well-Platten aus dem Inkubator 30 ° C und mischen sie für 30 s bei 1.000 u/min mit der Platte Vortexer. Hinzu kommen 125 µL des Puffers Transformation jedes gut und dann Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min.
- Die Platten bei 30 ° C für 30 min inkubieren und dann Hitze Schock die Hefe indem man die Platten in einem Inkubator 42 ° C für 15 Minuten.
Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht. - Zentrifugieren Sie die Platten für 5 min bei 3.000 X g. Entfernen des Transformation-Puffers aus den Vertiefungen durch invertieren die Platten in einem Abfallbehälter und mit Nachdruck dumping des Puffers von den Platten. Beflecken Sie schnell die invertierten Platten auf einem sauberen Papiertuch, keine Flüssigkeit auf die Oberseite der Platten zu entfernen.
- Spülen Sie die Zellen, indem Sie die Platten 200 µL des minimalen Dropout mittlere entspricht die auswählbare Markierung auf dem Plasmid Bibliothek hinzufügen.
Hinweis: Wir haben ein synthetisches Ura-Medium. - Die Platten für 5 min bei 3.000 X g Zentrifugieren und den überstand über einem Abfallbehälter wie in Schritt 2.10 entfernen.
- Fügen Sie 160 µL minimal Ura-Medium enthält 2 % Glukose. Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min und inkubieren sie bei 30 ° C für 48 h ohne schütteln. Beachten Sie nach 48 h, dass ein Pellet transformierte Hefe am unteren Rand jedes gut sichtbar ist.
- Fügen Sie mithilfe eines liquiden Dispensers 100 µL der Ura-Medien mit Glukose in jede Vertiefung einen neuen Satz von 96-Well Platten.
- Wirbel der Platten, die die transformierte Hefe (aus Schritt 2.13) bei 1.000 u/min für 30 s. mit einem sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator, legen Sie die Stifte in die Vertiefungen der transformierten hefehaltigen und dann in die entsprechenden Vertiefungen der neuen Platten zu impfen gefüllt mit Medien. Inkubieren Sie die neuen Platten bei 30 ° C für 24 h.
Hinweis: Wenn mit 10 Platten arbeiten, kann das Medium auch verzichtet werden manuell mit Mehrkanal-Pipetten. - Nach 24 Stunden sollte ein Pellet Hefe im unteren Teil jedes erfolgreich transformierten hefehaltigen gut sichtbar sein. Um diese Hefestämme Glycerin Vorrat zu speichern, fügen Sie 50 µL 50 % Glycerin in jede Vertiefung Wirbel die Platten für 30 s bei 1.000 u/min, die Platten mit Dichtungsband Abdichten und frieren sie bei-80 ° C.
Hinweis: Die oben genannten Schritte müssen nur einmal durchgeführt werden. Zukünftige Vorführungen von verschiedenen Hefe Modelle gegen die gleiche Bibliothek Einweg-Reagenz Reservoir aus Glycerin-Aktien starten und sofort aus den folgenden Schritten fortfahren.
3. Paarung zwischen Zellen, die Bibliothek Gene und Abfrage Hefe
- Um die Bibliothek Stämme aus dem Glycerin bestand wieder zu beleben, nimm die 96-Well-Platten aus dem-80 ° C Gefrierschrank, entfernen die Abdichtung Band, und lassen Sie die Hefe bei etwa 30 min bei Raumtemperatur Auftauen.
- Einmal die Hefe aufgetaut hat, können Sie einen sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator impfen zu frischen Ura-Medien mit 2 % Glukose in 96-Well Platten 160 µL Glycerin Aktien und inkubieren sie bei 30 ° C für 24 h, sofort nachdem die Bibliothek Stämme verwendet werden , die Platten mit Dichtungsband abdichten, und wieder in die-80 ° C Gefrierschrank.
- Am selben Tag die Bibliothek Stämme (W303α) aufgetaut, impfen die Abfrage Hefestamm (hier der FUS in W303a), 50 mL YPD und wachsen sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln bei 250 u/min.
- Am nächsten Morgen Gießen Sie den Abfrage-Hefe-Stamm zu einem sterilen Einweg-Reagenz-Reservoir und aliquoten 160 µL der Abfrage Belastung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette.
- Mit dem liquid Dispenser, 160 µL YPD Medien verzichten Sie in jede Vertiefung der zehn 96-Well-Platten. Verwenden Sie diese Platten später für die Paarung der Abfrage-Hefe-Stamm mit der Bibliothek Hefe.
- Kurz Wirbel der 96-Well-Platte mit dem Abfrage-Stamm und dann mit einem sterilen 96-poligen Replikator um die Abfrage zu übertragen, die YPD-Platten belasten.
- Wirbel der Bibliothek kurz belasten Platten und für jede Bibliothek Stamm Platte verwenden einen neue sterilen 96-poligen Replikator übertragen die Bibliothek Stämme auf die YPD-Platten, die mit dem Abfrage-Stamm geimpft worden.
Hinweis: Zellen in Glycerin verlieren ihre Keimfähigkeit nach mehreren Zyklen der Tauwetter-Freeze. Rückkehr der Bibliothek-Stämme in die Langzeitspeicherung (-80 ° C Gefrierschrank) so bald wie möglich halten Sie die Bibliothek in guter Qualität und für eine spätere Verwendung bereit. Richtig gepflegt, können Sie die Glycerin-Aktie eingefroren und wieder aufgetaut mindestens 10 mal. Wir empfehlen außerdem, eine Arbeitskopie und backup-Kopien von Glycerin-Lager zu halten. Bei der Arbeit bestand nicht funktioniert, sofort eine neue Arbeitskopie aus der Sicherungskopie. - Inkubieren Sie die YPD-Platten bei 30 ° C für 24 h. Beachten Sie, dass ein Pellet Hefe nach 24 h im unteren Teil jeder gut sichtbar sein wird.
- Füllung-96-Well-Platten mit einem minimalen Dropout-Medium mit 2 % Raffinose, entspricht die wählbaren Markierungen auf dem Plasmid in der Abfrage-Belastung sowie auf die Bibliothek Plasmid (z. B.- seine - hier Ura).
- Verwenden Sie einen sterilen 96-poligen Replikator Hefe von der YPD Paarung Kulturen zu den selektiven Medien übertragen. Die 96-Well-Platten bei 30 ° C für 48 h Inkubation; nur Hefezellen gedeckt haben und gebildeten diploiden Zellen und daher sowohl die Abfrage Plasmid enthalten und die Bibliothek Plasmid werden sich in diesem Medium wachsen. Feststellen Sie nach 2 Tagen, dass ein Pellet auf dem Boden der Näpfchen sichtbar ist.
(4) Schmierblutungen Assay
-
Nach 48 h des Wachstums in der Raffinose-haltigen selektivmedien vor Ort die Hefe auf Agarplatten.
- Bereiten Sie 2 Sets von Ura seine ausfallende Platten mit 2 % Agar mit klaren Polystyrol-Platten, eine mit 2 % Galaktose und das andere mit 2 % Glukose.
- Wirbel der 96-Well-Platten für 1 min bei 1.000 u/min, dann vor Ort die Hefe, die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Galaktose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene induziert) und die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Glukose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene unterdrückt) mit einem Roboter-spotting Maschine, durch die die Kultur in den einzelnen gut auf Agarplatten in vervierfacht fleckig ist (d. h., die Kultur in 1 gut ist gesichtet um 4 Punkte auf der Agarplatte).
- Lassen Sie nach dem Absetzen die Agarplatten trocknen, und dann legen Sie sie kopfüber in einem 30 ° C Brutschrank. Fotografieren Sie die Agarplatten alle 24 h eine schneller/mehr Hefe Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung gerettet wird, oder eine langsamer/weniger Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung noch verstärkt wird. 4 Tage inkubieren Sie die Platten.
Hinweis: Die Kultur in jedem kann gut auf Agarplatten 1-zu-1 gesichtet werden, wie in einer vorherigen Umwandlung basierende Methode10gezeigt. Jedoch, die 1 bis 4 hier Schmierblutungen (die bequem aufgestellt werden kann der Roboter spotting maschinenbenutzung) deutlich erhöht die Robustheit des Tests durch die Reduzierung von Fehlalarmen. Positive Treffer gelten nur, wenn alle 4 Kolonien aus der gleichen nun einen ähnlichen Phänotyp zeigen.
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Representative Results
Das ALS-assoziierten Protein FUS, eine RNA/DNA-bindendes Protein, war vorher im haploiden Hefe7,8studiert. Genetisches screening mit der Umwandlung basierende Methode entdeckte mehrere Hefe-Gene, die FUS Toxizität zu unterdrücken. Das menschliche Homolog von eines der Hefe Gene zeigte später wirksam zu unterdrücken Toxizität bei einer primären neuronale Zelle und Rattenmodell ALS13sein. Hier verwenden wir das gleiche Modell der Hefe um zu zeigen, dass die Überexpression Bibliothek Screening durchgeführt werden kann, bei der Paarung so effektiv wie durch Transformation.
FUS ist giftig für die beiden haploiden und diploiden Hefezellen
Das Vorgängermodell der Hefe FUS und anschließende Überexpression Bibliothek Screening wurde im Hintergrund haploiden Zelle durchgeführt. Für die Paarung-basierte Methode funktioniert muss FUS Toxizität in der diploiden Hefe nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck gedeckt wir FUS Hefe Modell in w303a (Paarung Typ eine) mit w303α verwandelt sich ein leerer Vektor (Paarung Typ α). Wie in Abbildung 2, obwohl nicht so stark wie in haploiden Hefe, FUS Toxizität in diploiden Hefe evident.
Unterdrückung-Gene identifiziert zuvor Arbeit in diploiden Hefe
Als Nachweis der Grundsatz für die Paarung basierende Methode testeten wir die fünf Gene, die zuvor von der Transformation-basierte Methode identifiziert. Paarung wurde verwendet, um jedes der fünf Gene in den haploiden Hefe-Modell des FUS (in W303a) einzuführen und ihre Fähigkeit, die Toxizität von FUS in der anschließenden diploiden Hefe zu retten wurde getestet (W303a/α). Wie in Abbildung 3dargestellt, retten alle fünf Gene die Toxizität von FUS in diploiden Hefe, darauf hinweist, dass die Paarung Methode wirksam war.
Ein pilot Screening 940 Gene (aufgereiht auf zehn 96-Well-Platten)
Nach den oben beschriebenen Protokollen werden die Paarung basierende Methode auf eine Überexpression Bibliothek Screening von 940 Genen angewendet. Abbildung 4 zeigt ein Bild von einer repräsentativen Platte. Wie auf der rechten Seite der Figur (FUS und Bibliothek Gene) angegeben, war FUS zu diploiden Hefe giftig. Das Bibliothek-gen durch das grüne Quadrat angezeigt gerettet FUS Toxizität während den Angaben des Roten Platzes Toxizität verbessert.
Abbildung 1 : Diagramm für das screening von Hefe Modelle der Protein-Toxizität mit Paarung. Eine Plasmid-Bibliothek (unter Kontrolle des Veranstalters GAL1 die hoch, in Anwesenheit von Galaktose induziert wird) wandelt sich in einen haploiden Hefe-Stamm (MATα) mit einem Hochdurchsatz-Transformation-Protokoll. Diese Sammlung von Hefe, mit der Bibliothek Plasmiden transformiert ist als Glycerin Stock bei-80 ° C gelagert und wiederbelebt wird, bei Bedarf mit dem haploiden Hefe-Modell der Protein-Toxizität (in unserem Fall, eine Kopie des FUS integriert HIS3 Locus, GAL1 Projektträger zu Paaren MATa). Diploiden Hefe, enthält die Bibliothek Plasmid und giftige Protein (FUS) ausgewählt und in Glucose (FUS und Bibliothek-gen 'off') und Galaktose (FUS und Bibliothek-gen 'on') Agarplatten entdeckt. Das Wachstum der Hefe wurde gefolgt, um Gene zu identifizieren, die zu retten oder verschärfen die Toxizität des FUS. Das grüne Quadrat zeigt ein Beispiel für ein Tumorsuppressor-Gen, das FUS Toxizität rettet und das rote Quadrat zeigt ein Beispiel für eine Enhancer-gen, das die FUS Toxizität bei überexprimiert verschärft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : FUS ist giftig für die beiden haploiden und diploiden Hefezellen. Haploiden Hefe (w303 MATa) mit pRS303Gal1-FUS transformiert wurden entweder mit einer leeren Plasmid transformiert oder gepaart mit Hefe vom gegenüberliegenden Paarung Typ (w303 MATα) verwandelt sich die gleichen leeren Plasmid diploiden Hefestamm generieren. Diese Hefestämme zusammen mit einer Kontrolle Belastung wurden dann 5 x seriell verdünnt (von links nach rechts) und Gefleckte, Ura-His-Glucose (Links, FUS Ausdruck unterdrückt) und Ura-His-Galactose Medium (rechts, FUS Ausdruck induziert). Das Bild entstand nach 2 Tagen des Wachstums bei 30 ° C. Nahezu identische Wachstum der haploide und diploide Kontrolle Belastung wurde beobachtet, so dass nur die haploiden Kontrolle Belastung gezeigt wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Fünf Hefe-Gene(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1und VHR1) retten FUS Toxizität durch die Paarung basierende Methode. Plasmide, zuvor identifizierten Hefe-Gene, die FUS Toxizität unterdrücken wurden in einem haploiden Hefe-Stamm (w303 MATα) umgewandelt. Diese Hefe wurden dann gepaart mit haploiden Hefe vom gegenüberliegenden Paarung Typ (w303 MATa) mit einem FUS Ausdruck Plasmid transformiert. Diploiden Hefe mit FUS und ein leerer Vektor oder eins der fünf Unterdrückung Gene wurde ausgewählt und Gefleckte in Wiederholungen auf Agarplatten mit Glukose (Gene 'off') und Galaktose (Gene "on"). (1) zeigt eine Kontrolle Hefestamm mit zwei leere Vektoren umgewandelt. (2) zeigt die diploiden FUS-Hefe-Stamm mit ein leerer Vektor, wo der Ausdruck der FUS sehr giftig ist. (3 – 7) zeigen diploiden Hefe mit dem Ausdruck FUS sowie eine Unterdrückung-gen, das FUS Toxizität retten kann. Jede Zahl (1 – 7) zeigt zwei Reihen von zwölf identisch repliziert. Das Bild, aus drei unabhängigen Experimenten wurde nach 3 Tagen des Wachstums bei 30 ° c aufgenommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Bibliothek Screening nach Genen, die zu retten oder verschlimmern FUS Toxizität. Haploiden Hefe mit FUS wurde mit haploiden Hefe mit den Bibliothek-Genen gedeckt. Nach der Paarung wurden diploide Zellen mit FUS und ein Bibliothek-gen ausgewählt und dann in Glucose (FUS und Bibliothek Gene 'off') und Galaktose Agarplatten (FUS und Bibliothek Gene 'on') in vierfachbestimmungen entdeckt. Auf der Galaktose-Platte, in der FUS und das Bibliothek-gen ausgedrückt wurden, konnten die meisten der Hefe gut wachsen. Dies bedeutet, dass FUS giftig ist und die meisten Bibliothek Gene konnten Toxizität zu retten. Das grüne Quadrat zeigt ein Beispiel für ein Bibliothek-gen, das unterdrückt FUS Toxizität und die Hefe zu Kolonien bilden kann. Das rote Quadrat zeigt ein Beispiel eines Bibliothek-Gens, die FUS Toxizität verschärft. Die hier gezeigten Platten sind repräsentativ für 10 Teller der Bibliothek-Gene, die gegen gezeigt wurden. Das Bild entstand nach 3 Tagen des Wachstums bei 30 ° C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll um ein Plasmid Überexpression Bildschirm in der Hefe, die zur Einführung der Plasmid-Bibliothek in der Hefe-Modell mit Paarung durchzuführen. Mithilfe dieses Ansatzes können mehrere Hefe-Modelle der Neurodegenerative Krankheit Protein Toxizität gezeigt mit der gleichen Sammlung von Hefe mit einem Plasmid-Bibliothek umgewandelt. Der mühsame Prozess der Transformation muss nur durchgeführt werden, sobald nach dem hocheffizienten Hefe Paarung verwendet wird, um der Plasmid-Bibliothek in der Abfrage-Stamm einzuführen. Dieses Protokoll verlässt sich auf die Verwendung von Roboter-Anlagen, Medien und vor Ort Hefekulturen auf Agarplatten zu verzichten. Während das Protokoll ohne die Verwendung von Roboter-Geräten ausgeführt werden kann, wird es mehr Zeit in Anspruch. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um Bildschirm für Gene, die die Toxizität von FUS ändern können.
Wir beobachteten, dass FUS in diploiden Hefe Hintergrund etwas weniger giftig ist. Dies liegt höchstwahrscheinlich an gen Exemplarzahl und Unterschiede in der Wachstumsrate der diploiden Hefe. Es sei denn, der Phänotyp, der untersucht wird Typ Paarung ist oder Diploidie-abhängigen, der Wachstum Phänotyp der Toxizität diploid und haploid Hefe konsequent ist. Aus diesem Grund soll die Paarung basierende Methode weit verbreitet in vielen Hefe-Modellen der verschiedenen Phänotypen Wachstum arbeiten. Dennoch sollte der Phänotyp des Modells Hefe überprüft werden, um sicherzustellen, dass es ist noch heute in der diploiden Hintergrund, bevor dieser Screening-Methode durchgeführt wird. Diese Methode kann verwendet werden, um viele unterschiedliche Phänotypen in der Hefe zu studieren und beschränkt sich nicht auf das Studium der neurodegenerativen Protein Toxizität. Darüber hinaus können jede Plasmid Bibliothek enthält Hefe Expressionsvektoren verwendet werden.
Nach dem Ausführen des Bildschirms, gibt es wenige Überprüfung Assays, die hilft sicherzustellen, dass die identifizierten Hits sind spezifisch für die Hefe-Modell gezeigt. Enhancer der Toxizität sollte ohne Co Ausdruck der Krankheit Protein des Interesses in der Hefe getestet werden. Enhancer verursacht Toxizität unabhängig von der Krankheit Protein des Interesses sollten weitere Studie beseitigt werden. Es ist wichtig zu prüfen, ob die Unterdrücker der Toxizität Expression des Proteins Krankheit betroffen sind, durch Einwirkung auf die Gal1 Promotor. Alle Unterdrücker Ausdruck aus dem Gal1 Promotor beeinflussen sollten weitere Studie beseitigt werden.
Hefestämme, enthält die Bibliothek Plasmid sind dauerhaft gespeichert Glycerin vorrätig und können schnell wiederbelebt werden, wenn erforderlich, damit die Paarung-basierte Methode leicht zu anderen Hefe-Modellen angewendet werden kann, in denen die gleichen Bibliothek-Gene gegen untersucht werden müssen. Die Effizienz der Paarung-basierte Methode wird deutlich, wenn die gleiche Art von Screening verwendet wird, um Fehlalarme zu entfernen oder wenn mehrere verschiedene Hefe Modelle untersucht werden müssen. Wir haben diese Methode erfolgreich eingesetzt, um ein Hefe-Modell der TDP-43, Bildschirm ein weiteres Protein an ALS verbunden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die nachdenkliche Gespräche mit Mitgliedern der Ju-Labor und Zhong Labor und die finanzielle Unterstützung von der Wright State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
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