Summary
Este protocolo describe la implantación de stents coronarios humanos en la aorta abdominal de ratas con un apoE-/- fondo usando un acceso transporte-femoral. En comparación con otros modelos animales, los modelos murinos tienen las ventajas de un alto rendimiento, reproducibilidad, facilidad de manejo y alojamiento, y una amplia disponibilidad de marcadores moleculares.
Abstract
La intervención coronaria percutánea (ICP), combinada con el despliegue de un stent coronario, representa el patrón oro en el tratamiento intervencionista de la enfermedad arterial coronaria. La reestenosis en stent (ISR) está determinada por una proliferación excesiva de tejido neointimal dentro del stent y limita el éxito a largo plazo de los stents. Una variedad de modelos animales se han utilizado para aclarar los procesos fisiopatológicos subyacentes a la reestenosis en stent (ISR), siendo los modelos porcinos coronarios y de la arteria ilíaca del conejo los más frecuentemente utilizados. Los modelos murinos proporcionan las ventajas de un alto rendimiento, facilidad de manejo y alojamiento, reproducibilidad y una amplia disponibilidad de marcadores moleculares. El modelo de ratón deficiente en apolipoproteína E (apoE-/-) ha sido ampliamente utilizado para estudiar enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, los stents deben ser miniaturizados para ser implantados en ratones, lo que implica cambios importantes de sus propiedades mecánicas y (potencialmente) biológicas. El uso de apoE-/- las ratas pueden superar estas deficiencias como apoE-/- las ratas permiten la evaluación de stents coronarios de tamaño humano mientras que al mismo tiempo proporcionan un fenotipo atherogenic. Esto los convierte en un modelo excelente y confiable para investigar la ISR después de la implantación del stent. Aquí, describimos, detalladamente, la implantación de stents coronarios humanos disponibles en el comercio en la aorta abdominal de ratas con un apoE-/- fondo usando un acceso transporte-femoral.
Introduction
La intervención coronaria percutánea (ICP), combinada con el despliegue de un stent coronario, representa el patrón oro en el tratamiento intervencionista de la enfermedad arterial coronaria1. El éxito a largo plazo de los stents, sin embargo, puede verse limitado por la aparición de reestenosis en stent (ISR) que está determinada por una proliferación excesiva de tejido neointimal dentro del stent2,3. La ISR puede requerir una reintervención con revascularización coronaria o re-ICP. Se han sugerido una variedad de modelos animales para el estudio de la ISR, cada uno de ellos con ventajas y deficiencias. Los principales inconvenientes de los modelos de arterias ilíacas coronarias y conejos más comúnmente utilizados, aunque desarrollando lesiones marcadamente similares a las de los humanos después de la implantación del stent4,5,son los grandes costos de animales y alojamiento que traen consigo dificultades logísticas, especialmente en estudios a largo plazo, así como limitaciones en el manejo y el equipo. Además, la disponibilidad de anticuerpos contra las proteínas celulares de cerdos y conejos es limitada. Por otro lado, los modelos murinos proporcionan las principales ventajas de un alto rendimiento y reproducibilidad, así como facilidad de manejo, alojamiento y, por lo tanto, rentabilidad. Además, un mayor número de anticuerpos están disponibles. Sin embargo, mientras que los ratones con deficiencia de Apolipoproteína E (apoE-/-)han sido ampliamente utilizados para el estudio de la aterosclerosis6,7,8,no son adecuados para el estudio de la ISR, ya que los stents tienen que ser miniaturizados para ser implantados en ratones, lo que potencialmente cambia las propiedades mecánicas de los stents. Por otra parte, la pared aórtica de los ratones mide entre 50 μm en ratones jóvenes y 85 μm en ratones viejos9,y los stents tienen que ser desplegados utilizando niveles de presión tan bajos como 2 atm, lo que podría conducir a la malaposición del stent10. Las ratas, sin embargo, permiten la implantación de stents coronarios humanos disponibles en el mercado, y demuestran un curso de curación vascular similar a los animales más grandes después de la implantación del stent aórtico, reportado por primera vez por Langeveld et al.11. Esta técnica requirió originalmente un acceso transporte-abdominal, que hizo necesario una constricción física de la aorta para alcanzar una interrupción temporal del flujo de sangre. Para evitar la lesión potencialmente asociada a los vasos y las reacciones inflamatorias, la técnica se perfeccionó posteriormente mediante la introducción de un acceso trans ilíaco, lo que además resultó en una mayor tasa de supervivencia de los animales12.
Debido a que las ratas de tipo salvaje no desarrollan lesiones ateroscleróticas13,las ratas apoE-/- se han generado ratas utilizando técnicas de nucleasa como la Ncleasa Efectora Activadora de Transcripción (TALEN)14,las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR/Cas9)15,y zinc finger (ZF)16. ApoE-/- las ratas han estado disponibles comercialmente desde 2011. Proporcionando un fondo atherogenic, las ratas del apoE-/- permiten una evaluación más realista de stents coronarios de tamaño humano, especialmente con respecto a ISR.
Adjunto, describimos el método vía la ruta de acceso transfemoral y usando un stent droga-que eluting del fino-puntal del fino-cromo disponible en el comercio (DES), sin embargo, puede también ser aplicado para el estudio de otros tipos stents, tales como stents del metal desnudo (BMS) o stents biodegradables.
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Protocol
Los experimentos se realizaron de conformidad con la ley alemana de bienestar animal (TSchG) y la Directiva 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados con fines científicos. La aprobación oficial para este estudio fue otorgada por el Comité Gubernamental de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo No.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemania). El protocolo de estudio cumplió con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El tratamiento del dolor postoperatorio se basa en las recomendaciones de la Sociedad Alemana para la Ciencia de Animales de Laboratorio (GV-SOLAS), así como en la Iniciativa de Terapia Veterinaria del Dolor.
1. Técnicas básicas y procedimientos comunes
- Use apoE homocigótico-/- Ratas Sprague-Dawley. Identificar el genotipo de cada animal mediante métodos estándar17.
- Mantener a los animales en condiciones idénticas (21 °C ± 2 °C, 60% ± 5% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h) y garantizar el libre acceso al agua y a los alimentos.
- Lleve a cabo todos los procedimientos en condiciones limpias pero no esteriles.
- Una vez que la rata es anestesiada, realice todos los procedimientos bajo un microscopio quirúrgico a un aumento de 16x.
- Use hisopos de algodón para la hemostasia de compresión. Los hisopos de gasa (5 cm x 5 cm) empapados con solución de ringer lactato son útiles para mantener la ingle húmeda.
- Siga las regulaciones de eliminación de residuos para eliminar los materiales usados.
2. Preparaciones antes de la cirugía
- Prepare los medicamentos veterinarios antes de comenzar la operación. Mantenga todas las soluciones a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
- Treinta minutos antes del procedimiento, administre 0.03-0.05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea.
- Anestesiar a la rata con una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de peso corporal (BW) (S)-ketamina y 8 mg/kg de BW xilazina.
- Evalúe el peso de la rata usando una báscula de pesaje.
- Coloque la rata en una almohadilla térmica y fije las extremidades superiores e inferiores con cinta adhesiva médica. Coloque a la rata con su miembro trasero izquierdo completamente extendido y lo más en línea con su columna vertebral como sea posible para crear una línea recta entre la arteria femoral y la aorta. Esto facilitará el avance del stent montado en un balón a través de la bifurcación aórtica.
- Mantener la anestesia con inhalación de isoflurano al 1,5% vol. en oxígeno al 97,5% a un caudal de 2 L/min.
NOTA: Permita que la rata respire espontáneamente, sin intubación. - Aplique ungüento para los ojos para prevenir el daño ocular durante la inconsciencia.
- Afeitar el pelaje de la ingle y el área inferior del abdomen de la rata y esterilizar la piel correspondiente con una solución de povidona-yodo.
- Antes de comenzar la cirugía, verifique la profundidad adecuada de la anestesia pellizcando la punta de la cola y el tejido interdigital.
3. Cirugía
- Haga una incisión medial de ~ 0.5 \ u20121 cm en la ingle izquierda para abrir la piel y la fascia subyacente.
- Diseccione y sondee embotado embotado en las profundidades hasta que la arteria femoral izquierda que pulsa pueda ser identificada.
- Usando fórceps muy finos, prepare la arteria femoral eliminando suavemente el tejido conectivo circundante. Tenga cuidado de no dañar ni el nervio femoral ni la vena femoral, que es medial a la arteria.
- Preparar aproximadamente 1 cm de la arteria femoral. Coloque cuidadosamente la punta de las fórceps debajo del recipiente para levantarlo suavemente.
- Hilo piezas de 4-0 sutura de seda bajo las partes distales y proximales de la arteria y forman eslingas. Sujete los extremos de cada una de las dos eslingas de hilo entre las ramas de una abrazadera quirúrgica. Use las abrazaderas quirúrgicas para controlar la arteria. Estire y levante suavemente las eslingas para interrumpir temporalmente el flujo sanguíneo.
NOTA: Trabaje rápido para evitar un torniquete prolongado que pueda llevar al daño tisular. - Usando micro tijeras afiladas, realice una arteriotomía en el medio de la arteria femoral.
- Introduzca un cable guía a través de la arteriotomía. Al llegar a la eslinga del hilo proximal, suelte la tensión del hilo moviendo la abrazadera quirúrgica y avance el alambre guía más hacia la aorta abdominal.
NOTA: Corte el alambre guía con un cortador de alambre para facilitar la manipulación. - Coloque el extremo proximal del alambre guía entre el diafragma y las arterias renales.
NOTA: Avanzar demasiado el alambre guía conlleva el riesgo de lesión aórtica o cardíaca. Recomendamos abrir el abdomen para asegurar la colocación adecuada del alambre guía y del stent al menos para los primeros animales. - Introduzca un stent coronario engarzado y montado en un balón que mida 2,25 mm x 8 mm (máx. 2,5 mm x 8 mm) sobre el alambre guía en la arteria femoral y avance hacia la aorta abdominal.
- Coloque el stent justo encima de la bifurcación aórtica pero debajo de las arterias renales. Despliegue el stent inflando el catéter del globo a 12 atm por 15 s usando un sistema de la jeringuilla del inflación.
- Desinflar el catéter con balón y mantener la presión negativa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el stent en uso.
- Retire lentamente el catéter desinflado mientras deja el stent en su lugar.
- Justo antes de sacar el catéter, cree tensión en el lazo del hilo por encima de la incisión con la abrazadera quirúrgica para interrumpir el flujo sanguíneo nuevamente. Luego retire el catéter con balón y ligar directamente el vaso proximally.
- Ate los lazos próximos y distales del hilo de rosca para ligar la arteria femoral y para confirmar hemostasis adecuado de la arteriotomía. Las arterias colaterales asegurarán la perfusión adicional al miembro.
- Cierre el músculo que borda la arteria, así como la incisión de la piel mediante el uso de 10-0 suturas no reabsorbibles.
4. Cuidado de animales después de la implantación de stent
- Inmediatamente después de la operación, permita que la rata se recupere durante 60 minutos en una jaula de unidad de cuidados intensivos especial con aire calentado (30 \ u201235 ° C) y un suministro de oxígeno.
- Observe a los animales cuidadosamente hasta que se recuperen por completo. Después, mueva las ratas a una jaula normal. Proporcionar acceso ad libitum al agua y los alimentos.
- Administrar analgesia postoperatoria cada 6-12 horas con 0,03-0,05 mg/kg de buprenorfina (s.c., en 500μl de NaCl) durante un total de 72 horas bajo evaluación clínica.
- Mezcle el alimento con clopidogrel (15 mg/kg) para evitar la trombosis del stent implantado.
- Para mejorar las condiciones hipercolesterolémicas y la formación de placa, comience la alimentación con dieta occidental a las 6 semanas después del nacimiento y continúe hasta la eutanasia. Si se desea, una cohorte de animales alimentados con ratas normales puede servir como control.
5. Recolección y procesamiento de tejidos
- Antes de comenzar la explantación de tejido en el punto de tiempo designado, eutanasiar al animal de acuerdo con las directrices de IACUC. Cosechar la aorta con stent para el análisis histológico al final del período de observación.
- Abra el abdomen mediante una incisión en la línea media y retire el segmento con stent de la aorta, así como las partes adyacentes de la aorta sin stent, que miden 0,5 cm cada una.
- Coloque el tejido en una solución de formol tamponado al 4% durante 24 h para la fijación.
- Incrustar el tejido arterial con stent en plástico y realizar tinción histológica e inmunohistoquímica de acuerdo con los protocolos estándar18,19.
6. Análisis histomorfométrico
- Realizar análisis histomorfométricos de secciones secuenciales de la parte proximal, media y distal de la aorta con stent por medio de un microscopio conectado a una computadora con un software de análisis de imágenes apropiado.
- Traza los contornos de la lámina elástica externa (EEL, entre adventitia y media), la lámina elástica interna (IEL, entre media y neointima), y la luz con una tableta de dibujo gráfico. A partir de estos valores, calcule el área EEL, el área IEL y el área de lumen con el software.
- Calcule el porcentaje de reestenosis en stent (ISR) del área transversal:
- Calcular el área neointimal total (Ai):
- Mida el grosor neointimal (NIT) sobre cada puntal de stent como la distancia entre el puntal y la luz. Mida el NIT entre los puntales del stent como la distancia entre el IEL y la luz.
Nota: Alternativamente, calcular NIT como
donde PL y PIEL son el lumen y el perímetro interno de la lámina elástica, respectivamente20. - Realizar análisis adicionales de acuerdo con los requerimientos del estudio.
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Representative Results
Este protocolo describe la implantación de stent en la aorta abdominal de ratas utilizando una vía de acceso transfemoral (Figura 1). El primer punto central de este modelo animal es que permite el despliegue de stents coronarios de tamaño humano. Un stent coronario engarzado y montado en el globo disponible en el comercio se puede colocar en la aorta abdominal de ratas. Así, además, se puede aplicar el mismo principio de despliegue de stent que en humanos. Otra ventaja del uso de ratas es la disponibilidad de cepas genéticamente modificadas, como las ratas apoE-/-, que están disponibles comercialmente.
Recientemente empleamos este método para evaluar si las ratas con deficiencia de E de apolipoproteína son más propensas a desarrollar ISR en comparación con las ratas de tipo salvaje21. De un total de 42 ratas masculinas sometidas a implantación de stent, 36 ratas completaron el protocolo del estudio después de 28 días (tasa de supervivencia = 85,71%). Dos ratas cada uno murieron de falta del encierro del recipiente, de hemorragia interna, y de trombosis stent. Los stents de tres animales no pudieron ser analizados porque el tejido fue dañado o interrumpido seriamente debido a las faltas de proceso. Lo más probable es que esto ocurriera durante el procedimiento de aserrado. Recomendamos entrenar para realizar esta técnica varias veces antes del inicio del estudio.
En las 33 ratas restantes, los stents coronarios de tamaño humano fueron desplegados con éxito sin la muestra de la malapposición o de lesión del recipiente (tabla 1). El peso corporal era similar en el apoE+/+ y el apoE del wildtype-/- ratas (530,1 ± 15,94 g contra 513,6 ± 16,45 g). ApoE homocigótico-/- las ratas desarrollaron hiperplasia neointimal marcado elevada e ISR con respecto a las ratas del apoE+/+ del wildtype (cuadro 2). Aunque un apoE-/- el fondo haga a animales más susceptibles para la ateroesclerosis, especialmente cuando está alimentado dieta occidental, no observamos ninguna placa aterosclerótica antecedente en nuestras ratas, muy probablemente porque una dieta occidental no fue comenzada hasta cirugía y el período de observación subsecuente de cuatro semanas era demasiado corto para el desarrollo aterosclerótico de la lesión.
Figura 1: Esquema de la implantación del stent en la aorta abdominal de ratas utilizando un acceso transfemoral.
(a)Después de la interrupción del flujo sanguíneo, se introduce un alambre guía a través de una arteriotomía medial. (b)Se introduce un stent coronario engarzado y montado en un balón sobre el alambre guía en la arteria femoral. (c)El stent montado en un balón se avanza hasta la aorta abdominal, donde se despliega por inflado con balón. El stent debe colocarse por encima de la bifurcación y por debajo de las arterias renales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Fotomicrografías representativas de la aorta abdominal teñida de Giemsa a los 28 días de la implantación del stent en alimentación de dieta occidental.
(a)Ratas wildtype apoE+/+ y(b)homocigótica apoE-/- ratas. Imágenes de alta potencia: NI = neointima, St = puntal de stent, M = túnica media, L = lumen. La figura ha sido reproducida con modificaciones de Cornelissen, A. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| número de ratas | |
| fallo en el cierre de buques | 2 |
| hemorragia interna | 2 |
| trombosis del stent | 2 |
| fallo en el procesamiento de tejidos | 3 |
| Finalización correcta del protocolo | 33 |
Tabla 1: Resultado de la implantación de stent en aorta abdominal de rata utilizando un acceso transfemoral.
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Discussion
Este protocolo describe la implantación de stents coronarios de tamaño humano en la aorta abdominal de las ratas del apoE-/-. Vale la pena destacar varios aspectos técnicos. En primer lugar, se debe evitar un desajuste entre el tamaño del stent y el tamaño de la aorta. La colocación de un stent demasiado pequeño puede llevar a la malaposición del stent, mientras que la implantación de un stent que es demasiado grande para la aorta puede causar estiramiento excesivo, desgarro y lesión del vaso. Por lo tanto, recomendamos el uso de stents entre 2,0 y 2,5 mm de diámetro, y mantener la presión de implantación dentro del rango recomendado sin sobrecargar el stent. La presión de implantación más adecuada suele ser dada por el fabricante del stent. Se debe evitar el exceso de lesiones de la vena femoral y, posteriormente, de la vena cava porque las paredes de los vasos son extremadamente delgadas y muy fáciles de lesionar, lo que resulta en un sangrado difícil de detener. La arteria femoral es distinguible de la vena femoral por la pulsación, que se debe observar cuidadosamente. Otro escollo es la posibilidad de lesión arterial y disección al introducir el cable guía y / o el catéter con balón. La disección arterial se puede minimizar controlando y estirando la arteria femoral distalmente con eslingas usando lazos de seda mientras que introduce el catéter del globo. Es imperativo dejar de avanzar inmediatamente el dispositivo cuando se encuentra resistencia. En este caso, los pequeños movimientos entre el pulgar y el dedo índice ayudarán a cambiar la dirección del dispositivo. En nuestra experiencia, éste es lo más frecuentemente el caso apenas debajo del ligamento inguinal y más arriba, cuando la arteria ilíaca común se acerca a la bifurcación, pues desciende más profundamente en el espacio retroperitoneal aquí. Sin duda habrá una curva de aprendizaje para el operador antes de que las tasas de supervivencia sean estables y con algo de experiencia, el tiempo quirúrgico promedio es de aproximadamente 20 minutos.
En seres humanos, los stents se implantan generalmente en arterias ateroscleróticas seriamente estrechadas. Aunque la deficiencia del apoE haga en general a animales más susceptibles para el desarrollo de lesiones ateroscleróticas, no observamos ninguna formación de la placa en nuestras ratas, muy probablemente porque la alimentación occidental de la dieta no fue comenzada hasta la implantación stent. Si se desea la implantación de stent en lesiones ateroscleróticas, la dieta occidental debe comenzar a las 6 semanas después del nacimiento y continuar hasta el sacrificio. Las lesiones ateroscleróticas en cepas susceptibles se desarrollarán después de 7 semanas en la dieta alta en grasas22. Hasta ahora, sólo se han publicado datos limitados sobre las ratas apoE-/-. Sin embargo, ningún estudio reportó el desarrollo espontáneo de lesiones antes de la edad de 20 semanas23. Zhao et al. observaron aterosclerosis típica en apoE-/- ratas después de al menos 24 semanas con un aumento continuo en la carga de placa y la gravedad de la lesión hasta el sacrificio a las 72 semanas15. Por lo tanto, según la literatura, es improbable que las ratas desarrollen aterosclerosis espontánea a las 14-16 semanas de edad. Por lo tanto, recomendamos usar ratas más viejas y comenzar dieta occidental tan pronto como sea posible si la implantación stent en lesiones ateroscleróticas pre-formadas se desea para el estudio.
Seis animales no sobrevivieron a la cirugía. Dos animales murieron de trombosis stent a pesar de la administración de clopidogrel. Para reducir la trombosis del stent, los animales pueden ser pre-tratados durante 48 h con aspirina o recibir una inyección intraperitoneal de enoxaparina postoperatoriamente. La introducción de clopidogrel un día antes de la cirugía también podría reducir el riesgo de trombosis, pero cualquier intensificación de la terapia antitrombótica al mismo tiempo aumenta el riesgo de hemorragia. La trombosis del stent es una complicación común de pci24,25,26 y puede tener varias razones. Potencialmente, en nuestro estudio, las muertes de la trombosis stent resultaron de la inflación escasa del globo y de la malapposición stent concurrente. En contraste con la implantación stent en seres humanos, el despliegue stent en la aorta abdominal de la rata no fue controlado por angiografía. Por lo tanto, la inflación ineficaz del globo no se puede detectar y corregir durante cirugía. Semejantemente, el despliegue stent pudo llevar a una obstrucción inintencional de un recipiente de ramificación. Teniendo en cuenta que no es factible realizar la cirugía que requiere el uso de un microscopio quirúrgico bajo control fluoroscópico, recomendamos abrir el abdomen para confirmar el despliegue preciso del stent, al menos para los primeros procedimientos. Otras causas potenciales de trombosis de stent pueden ser reacciones inflamatorias, lesiones graves o disecciones de la pared del vaso. El cirujano debe ser consciente de cualquier signo clínico que indique estas complicaciones, y los animales deben ser inspeccionados cada día durante todo el período de observación.
La aorta abdominal de rata mide entre 1,8 mm y 3,0 mm de diámetro, dependiendo del peso del animal27,28. El avance de un stent voluminoso a través de las arterias femorales e ilíacas aún más pequeñas puede causar desgarro y daño intimal a la pared del vaso. Por lo tanto, esta técnica se limita a la implantación de stents más pequeños (entre 2,0 y 2,5 mm de diámetro) para evitar el estiramiento excesivo o la lesión de la pared del vaso de la aorta.
Otra limitación es la necesidad de ligar la arteria femoral para alcanzar hemostasis después del procedimiento, llevando potencialmente el riesgo de isquemia más baja del miembro. Sin embargo, estudios previos mostraron que las arterias colaterales, así como las adaptaciones de la microvasculatura distal a la oclusión son capaces de mantener la perfusión de miembros inferiores después de la ligadura de la arteria femoral en ratas29,y ninguna de nuestras ratas exhibió signos clínicos de isquemia de miembros inferiores durante el período de observación. Aún así, los investigadores deben ser conscientes de este riesgo potencial, ya que la isquemia de las extremidades no solo representa una causa potencial de muerte postoperatoria, sino que también puede inducir potencialmente una reacción inflamatoria sistémica, lo que podría sesgar los resultados.
Mientras que las ratas en general son un modelo animal rentable, el uso de ratas apoE-/- genéticamente modificadas aumenta el costo. Otra limitación es que toma un tiempo comparativamente largo hasta que las placas ateroscleróticas se han convertido en ratas. Además, hay algunas diferencias hemodinámicas importantes entre la aorta y las arterias coronarias que merecen una atención más cercana. La tensión de cizalladura es más alta en la aorta con respecto a los coronaries, y las bifurcaciones que causan el flujo de sangre turbulento son ausentes. Esto disminuye el desarrollo de la hiperplasia intimal y el grado del restenosis.
La reestenosis es uno de los principales factores que limitan el éxito a largo plazo de los stents coronarios. Una variedad de modelos animales se han utilizado para estudiar la patofisiología del restenosis, cada uno con sus propias ventajas y defectos. En comparación con otros modelos animales, las ratas tienen la ventaja de un alto rendimiento, una facilidad de manejo y alojamiento, reproducibilidad, así como rentabilidad, mientras que al mismo tiempo permiten la implantación de stents coronarios de tamaño humano. El primer protocolo de colocación de stents en aorta abdominal en ratas fue relatado por Langeveld et al.11. Este modelo, sin embargo, requiere un acceso transabdominal para introducir el stent, que se asocia con una constricción física de la aorta para lograr una interrupción temporal del flujo sanguíneo. La manipulación resultante y lesión del recipiente pudieron potencialmente causar reacciones inflamatorias, que pudieron no sólo llevar a las complicaciones, pero también al ISR pronunciado12. Posteriormente, Oyamada et al. modificaron el protocolo introduciendo el stent a través de la arteria ilíaca común12. Compararon la tasa de supervivencia entre los dos enfoques diferentes (trans-aorta versus arteria trans-ilíaca) y encontraron una tasa de mortalidad significativamente mayor en animales con stents transabdominalmente desplegados (57% versus 11%, p < 0,05). Las ratas más comúnmente murieron de trombosis en el sitio de la incisión / sutura, que es catastrófica cuando ocurre en la aorta abdominal12. Además reduciendo el trauma e imitando la técnica de implantación en humanos más de cerca, utilizamos un acceso transfemoral para introducir el stent y reportamos una tasa de mortalidad del 14%. Dos ratas cada uno murieron de falta del encierro del recipiente, de hemorragia interna, y de trombosis stent. Estudios más recientes, sin embargo, relatan tasas de mortalidad tan bajas como el 6% después de la implantación del stent en la aorta abdominal de rata, incluso con el acceso transaórtico30,31. Aún así, la tasa combinada de morbilidad y mortalidad fue de 13,4%, en un estudio realizado por Nevzati et al. después de la implantación de stents de magnesio en la aorta de rata30. Mientras que ni la falta del cierre del recipiente ni la hemorragia interna fueron divulgadas en su serie, la trombosis stent era evidente en 10,5% de ratas30. Por otro lado, Aquarius et al. no relataron trombosis de stent después del tratamiento de aneurismas de pared lateral con desviadores de flujo, sin embargo, este estudio utilizó dispositivos de puntal de stent más delgados, y se administró terapia antiplaquetaria dual a las ratas31. Intentamos encontrar un equilibrio entre el riesgo de trombosis stent y el riesgo de la sangría y administramos clopidogrel y heparin en nuestro estudio. Mientras que esto pudo haber reducido el riesgo de trombosis stent, que ocurrió en 4,76% de ratas, también pudo haber sido la razón del riesgo comparativamente más alto de sangrar (9,52% de ratas), debido a hemorragia interna o falta del cierre del recipiente.
Aquí, demostramos la implantación de un stent droga-que eluting en la aorta abdominal de la rata, pero asimismo este método se puede utilizar para la evaluación de otros, dispositivos stents de tamaño similar, por ejemplo stents del metal pelado o andamios vasculares bioresorbables.
En resumen, la colocación de stents en aorta abdominal de ratas con deficiencia de Apolipoproteína E es un modelo fiable y reproducible para investigar la ISR después de la implantación de stent. El modelo se puede extender al uso de ratas más viejas, que son más probables desarrollar lesiones ateroscleróticas espontáneamente, y probando otros dispositivos usados para la intervención coronaria humana.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a la Sra. Angela Freund por su inestimable asistencia técnica con la incrustación y la producción de diapositivas. También nos gustaría agradecer al Sr. Tadeusz Stopinski en el Instituto de Ciencia de Animales de Laboratorio y Cirugía Experimental por su perspicaz ayuda con el trabajo veterinario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
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