Summary
Denne protokollen beskriver implantasjon av menneskelige koronar stenter i abdominal aorta av rotter med en apoE-/- bakgrunn ved hjelp av en trans-femoral tilgang. Sammenlignet med andre dyremodeller bærer murine modeller fordelene med høy gjennomstrømning, reproduserbarhet, enkel håndtering og boliger, og en bred tilgjengelighet av molekylære markører.
Abstract
Perkutan koronarintervensjon (PCI), kombinert med utplassering av en koronarstent, representerer gullstandarden i intervensjonsbehandling av koronararteriesykdom. In-stent restenosis (ISR) bestemmes av en overdreven spredning av neointimalt vev i stenten og begrenser den langsiktige suksessen til stenter. En rekke dyremodeller har blitt brukt til å belyse patofysiologiske prosesser som ligger til grunn for in-stent restenosis (ISR), med porcin koronary og kanin iliac arterie modeller som den mest brukte. Murine modeller gir fordelene med høy gjennomstrømning, enkel håndtering og boliger, reproduserbarhet og en bred tilgjengelighet av molekylære markører. Den apolipoprotein E mangelfull (apoE-/- ) musemodell har blitt mye brukt til å studere kardiovaskulære sykdommer. Stenter må imidlertid miniatyriseres for å implanteres i mus, som involverer viktige endringer i deres mekaniske og (potensielt) biologiske egenskaper. Bruken av apoE-/- rotter kan overvinne disse manglene som apoE-/- rotter tillater evaluering av humane koronarstenter samtidig som de gir en aterogen fenotype. Dette gjør dem til en utmerket og pålitelig modell for å undersøke ISR etter stentimplantasjon. Her beskriver vi i detalj implantasjonen av kommersielt tilgjengelige menneskelige koronarstenter i abdominal aorta av rotter med apoE- / - bakgrunn ved hjelp av en trans-femoral tilgang.
Introduction
Perkutan koronarintervensjon (PCI), kombinert med utplassering av en koronarstent, representerer gullstandarden i intervensjonsbehandling av koronararteriesykdom1. Den langsiktige suksessen til stenter kan imidlertid begrenses av forekomsten av in-stent restenosis (ISR) som bestemmes av en overdreven spredning av neointimalt vev i stent2,3. ISR kan kreve en re-intervensjon enten med koronar arterie bypass eller re-PCI. En rekke dyremodeller har blitt foreslått for studiet av ISR, hver av dem med fordeler og mangler. De største ulempene ved de mest brukte porcine koronar- og kanin iliac arteriemodellene, om enn å utvikle lesjoner som er markert lik mennesker etter stentimplantasjon4,5, er store dyre- og boligkostnader som bringer opp logistiske vanskeligheter spesielt i langsiktige studier, samt begrensninger i håndtering og utstyr. Videre er tilgjengeligheten av antistoffer mot cellulære proteiner av svin og kaniner begrenset. På den annen side gir murine modeller de viktigste fordelene med høy gjennomstrømning og reproduserbarhet, samt enkel håndtering, boliger og derfor kostnadseffektivitet. Videre er et høyere antall antistoffer tilgjengelig. Men mens apolipoprotein E-deficient (apoE-/-) mus har blitt bredt brukt til studiet av aterosklerose6,7,8, er de uegnet til studiet av ISR, da stenter må miniatyriseres for å bli implantert i mus, og potensielt endre stentenes mekaniske egenskaper. Videre måler aortaveggen til mus mellom 50 μm hos unge mus og 85 μm i gamle mus9, og stenter må utplasseres ved hjelp av trykknivåer så lave som 2 atm, noe som kan føre til misbilleggelse av stent10. Rotter tillater imidlertid implantasjon av kommersielt tilgjengelige menneskelige koronarstenter, og demonstrerer et vaskulært helbredelseskurs som ligner større dyr etter aortastenlantlantasjon, først rapportert av Langeveld et al.11. Denne teknikken krevde opprinnelig en trans-abdominal tilgang, noe som nødvendiggjorde en fysisk innsnevring av aorta for å oppnå et midlertidig avbrudd i blodstrømmen. For å unngå potensielt assosiert karskade og inflammatoriske reaksjoner, ble teknikken senere raffinert ved innføring av en trans-iliac tilgang, noe som i tillegg resulterte i en høyere overlevelsesrate for dyrene12.
Fordi wildtype rotter ikke utvikler aterosklerotiske lesjoner13, har apoE-/- rotter blitt generert ved hjelp av nukleaseteknikker som Transkripsjon Activator-Lignende Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15, og Zinc Finger (ZF)16. ApoE-/- rotter har vært kommersielt tilgjengelige siden 2011. Ved å gi en aterogen bakgrunn gir apoE-/- rotter en mer realistisk evaluering av koronarstenter i menneskelig størrelse, spesielt med hensyn til ISR.
Her beskriver vi metoden via den transfemorale tilgangsruten og bruker en kommersielt tilgjengelig tynnstruet kobolt-krom-eluting stent (DES), men det kan også brukes til studiet av andre stenttyper, for eksempel nakne metallstenter (BMS) eller biologisk nedbrytbare stenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene ble utført i samsvar med den tyske dyrevelferdsloven (TSchG) og direktivet 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Den offisielle godkjenningen for denne studien ble gitt av Regjeringens dyrepleie- og brukskomité (protokollnr.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Tyskland). Studieprotokollen fulgte veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr. Postoperativ smertebehandling er basert på anbefalingene fra det tyske samfunnet for laboratoriedyrvitenskap (GV-SOLAS) samt Initiative Veterinary Pain Therapy.
1. Grunnleggende teknikker og vanlige prosedyrer
- Bruk homozygot apoE-/- Sprague-Dawley rotter. Identifiser genotypen til hvert dyr ved hjelp av standardmetodene17.
- Hold dyrene under identiske forhold (21 °C ± 2 °C, 60 % ± 5 % fuktighet og en lys-/mørk syklus på 12 timer) og sørg for fri tilgang til vann og mat.
- Utfør alle prosedyrer under rene, men ikke-steroide forhold.
- Når rotten er bedøvet, utfør alle prosedyrer under et kirurgisk mikroskop med en forstørrelse på 16x.
- Bruk bomullspinne for kompresjon hemostase. Gasbindpinner (5 cm x 5 cm) gjennomvåt med laktert Ringer-løsning er nyttige for å holde lysken fuktig.
- Følg avfallshåndteringsforskriftene for å kaste brukte materialer.
2. Forberedelser før operasjonen
- Forbered veterinærmedisinene før du starter operasjonen. Hold alle løsninger ved romtemperatur, med mindre annet er angitt.
- Tretti minutter før prosedyren, administrer 0,03-0,05 mg/kg buprenorfin subkutant.
- Bedøv rotten med en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg kroppsvekt (BW) (S)-ketamin og 8 mg/kg BW xylazin.
- Vurder rottens vekt ved hjelp av en veievekt.
- Plasser rotten på en varmepute og fest øvre og nedre lemmer ved hjelp av medisinsk tape. Plasser rotten med venstre bakre lem helt utvidet og så mye i tråd med ryggraden som mulig for å skape en rett linje mellom lårarterie og aorta. Dette vil lette fremføringen av den ballongmonterte stenten gjennom den aortabifurkasjonen.
- Opprettholde anestesi med innånding av 1,5 vol% isofluran i 97,5% oksygen med en strømningshastighet på 2 l / min.
MERK: La rotten puste spontant, uten intubasjon. - Påfør øyesalve for å forhindre øyeskader under bevisstløshet.
- Barber pelsen fra rottens lyske- og underlivsområde og steriliser den tilsvarende huden med en povidon-jodoppløsning.
- Før du starter operasjonen, kontroller tilstrekkelig dybde av anestesi ved å klemme halespissen og det interdigitale vevet.
3. Kirurgi
- Lag et medial snitt på ~ 0,5 \ u20121 cm i venstre lyske for å åpne huden og den underliggende fascia.
- Disseker og sonde i dypet til den pulserende venstre lårarterien kan identifiseres.
- Bruk svært fine tang, forberede lårarterien ved å forsiktig fjerne det omkringliggende bindevevet. Vær forsiktig med å skade verken lårnerven eller lårbenet, som er medial til arterien.
- Forbered ca 1 cm av lårarterien. Legg forsiktig spissen av tangene under fartøyet for å løfte den forsiktig.
- Gjengestykker av 4-0 silke sutur under de distale og proksimale delene av arterien og danner slynger. Klem endene av hver av de to gjengestroppene mellom grenene av en kirurgisk klemme. Bruk de kirurgiske klemmene til å kontrollere arterien. Strekk forsiktig og løft slyngene for å avbryte blodstrømmen midlertidig.
MERK: Arbeid raskt for å unngå en langvarig turniquet som kan føre til vevsskade. - Bruk skarp mikrosaks, utfør en arteriotomi midt i lårarterien.
- Introduser en ledevaier gjennom arteriotomien. Når du når den proksimale gjengeslyngen, slipper du spenningen på tråden ved å flytte den kirurgiske klemmen og føre ledevaieren videre mot abdominal aorta.
MERK: Klipp ledevaieren med en trådkutter for å lette håndteringen. - Plasser den proksimale enden av ledevaieren mellom membranen og nyrearteriene.
MERK: Hvis du beveger ledevaieren for langt, risikerer du aorta- eller hjerteskade. Vi anbefaler å åpne magen for å sikre tilstrekkelig posisjonering av føringsledningen og stenten i det minste for de første dyrene. - Introduser en krympet og ballongmontert koronarstent som måler 2,25 mm x 8 mm (maks. 2,5 mm x 8 mm) over føringsledningen inn i lårarterien og før den videre til abdominal aorta.
- Plasser stenten like over aortabifurkasjonen, men under nyrearteriene. Utnytt stenten ved å blåse opp ballongkateteret til 12 atm i 15 s ved hjelp av et sprøytesystem for inflasjon.
- Tøm ballongkateteret og oppretthold negativt trykk i henhold til produsentens anbefalinger for stenten som er i bruk.
- Trekk langsomt ut det deflaterte kateteret mens stenten er på plass.
- Like før du tar ut kateteret, lag spenning på gjengeløkken over snittet med den kirurgiske klemmen for å avbryte blodstrømmen igjen. Fjern deretter ballongkateteret og ligat fartøyet direkte proksimalt.
- Bind de proksimale og distale trådløkkene for å ligate lårarterien og bekreft tilstrekkelig hemostase av arteriotomien. Collateral arterier vil sikre ytterligere perfusjon til lemmen.
- Lukk muskelen som overlegger arterien, samt hudinnsnittet ved å bruke 10-0 ikke-resorberbare suturer.
4. Dyrepleie etter stentimplantasjon
- Umiddelbart etter operasjonen, la rotten komme seg i 60 min i et spesielt intensivavdelingsbur med oppvarmet luft (30 \u201235 °C) og oksygentilførsel.
- Se dyrene nøye til de er fullstendig gjenopprettet. Etterpå flytter du rottene inn i et normalt bur. Gi ad libitum tilgang til vann og mat.
- Administrer postoperativ analgesi hver 6-12 timer med 0,03-0,05 mg/kg buprenorfin (s.c,, i 500μl NaCl) i totalt 72 timer under klinisk vurdering.
- Få maten blandet med klopidogrel (15 mg/kg) for å unngå trombose i den implanterte stenten.
- For å forbedre hyperkolesteroliske forhold og plakkdannelse, start vestlig diettfôring ved 6\u20128 uker etter fødselen og fortsett til eutanasi. Om ønskelig kan en kohort av dyr matet normal rotte chow tjene som kontroll.
5. Vevsinnsamling og behandling
- Før du starter vevets eksplantasjon på det angitte tidspunktet, avlive dyret i henhold til IACUC-retningslinjer. Høst den stentede aortaen for histologisk analyse på slutten av observasjonsperioden.
- Åpne magen ved et midtlinje snitt og fjern det stentede segmentet av aorta samt tilstøtende ikke-stentede deler av aorta, som måler 0,5 cm hver.
- Plasser vevet i en løsning på 4% bufret formalin i 24 timer for fiksering.
- Bygg inn det stentede arterielle vevet i plast og utfør histologisk og immunhiistokjemisk farging i henhold til standardprotokollene18,19.
6. Histomorfometrisk analyse
- Utfør histomorfometrisk analyse av sekvensielle deler av den proksimale, midtre og distale delen av den stentede aorta ved hjelp av et mikroskop koblet til en datamaskin med en passende bildeanalyseprogramvare.
- Spor konturene av den eksterne elastiske lamina (EEL, mellom adventitia og media), intern elastisk lamina (IEL, mellom media og neointima), og lumen med en grafisk tegnebrett. Fra disse verdiene beregner du EEL-området, IEL-området og lumenområdet med programvaren.
- Beregn prosent tverrsnittsområdet i stent restenosis (ISR):
- Beregn det totale neointimale området (Ai):
- Mål den neointimale tykkelsen (NIT) over hver stentstang som avstanden mellom stiver og lumen. Mål NIT mellom stentstengene som avstanden mellom IEL og lumen.
MERK: Alternativt kan du beregne NIT som
der PL og PIEL er lumen og innvendig elastisk lamina perimeter, henholdsvis20. - Utføre ytterligere analyser i henhold til kravene i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver stentimplantasjon i abdominal aorta hos rotter ved hjelp av en trans-femoral tilgangsrute (figur 1). Det første sentrale punktet i denne dyremodellen er at den tillater utplassering av menneskelige koronarstenter. En kommersielt tilgjengelig krympet og ballongmontert koronarstent kan plasseres i abdominal aorta av rotter. Dermed kan i tillegg det samme prinsippet om stentutplassering som hos mennesker brukes. En annen fordel med bruk av rotter er tilgjengeligheten av genetisk modifiserte stammer, for eksempel apoE-/- rotter, som er kommersielt tilgjengelige.
Vi brukte nylig denne metoden for å vurdere om apolipoprotein E-mangelfulle rotter er mer tilbøyelige til å utvikle ISR sammenlignet med wildtype rotter21. Fra totalt 42 hannrotter som gjennomgikk stentimplantasjon, fullførte 36 rotter studieprotokollen etter 28 dager (overlevelsesrate = 85,71%). To rotter døde hver av svikt i stenging av fartøy, indre blødninger og stenttrombose. Stenter fra tre dyr kunne ikke analyseres fordi vevet ble alvorlig skadet eller forstyrret på grunn av behandlingsfeil. Mest sannsynlig skjedde dette under sagingsprosedyren. Vi anbefaler trening for å utføre denne teknikken flere ganger før studiestart.
I de resterende 33 rottene ble koronarstenter i menneskelig størrelse utplassert uten tegn på misbilligelse eller karskade (tabell 1). Kroppsvekten var lik i wildtype apoE+/+ og apoE-/- rotter (530,1 ± 15,94 g versus 513,6 ± 16,45 g). Homozygot apoE-/- rotter utviklet markant forhøyet neointimal hyperplasi og ISR sammenlignet med wildtype apoE+/+ rotter (Figur 2). Selv om en apoE-/- bakgrunn gjør dyr mer utsatt for aterosklerose, spesielt når det ble matet vestlig kosthold, observerte vi ingen antecedent aterosklerotiske plakk hos våre rotter, mest sannsynlig fordi et vestlig kosthold ikke ble startet før operasjonen og den påfølgende observasjonsperioden på fire uker var for kort for aterosklerotisk lesjonsutvikling.
Figur 1: Skjema for stentimplantasjonen i abdominal aorta hos rotter ved hjelp av en trans-femoral tilgang.
(a) Etter avbrudd i blodstrømmen innføres en ledevaier gjennom en arteriell arteriotomi. (b) En krympet og ballongmontert koronarstent innføres over ledevaieren i lårarterien. (c) Den ballongmonterte stenten er avansert til abdominal aorta, hvor den er utplassert av ballonginflasjon. Stenten skal plasseres over bifurkasjonen og under nyrearteriene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative fotomikrografer av Giemsa-farget abdominal aorta på 28 dager etter stentimplantasjon i vestlig diett-matet.
(a) Wildtype apoE+/+ rotter og (b) Homozygot apoE-/- rotter. Bilder med høy effekt: NI = neointima, St = stentstang, M = tunikamedier, L = lumen. Figuren er gjengitt med modifikasjoner fra Cornelissen, A. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| antall rotter | |
| Svikt ved lukking av fartøy | 2 |
| indre blødning | 2 |
| stenttrombose | 2 |
| svikt i vevsbehandling | 3 |
| vellykket fullføring av protokollen | 33 |
Tabell 1: Utfall av stentimplantasjon i rotte abdominal aorta ved hjelp av en trans-femoral tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver implantasjon av humane koronar stenter i abdominal aorta av apoE-/- rotter. Flere tekniske punkter er verdt å understreke. For det første bør en uoverensstemmelse mellom stentstørrelsen og størrelsen på aorta unngås. Å plassere for liten en stent kan føre til stent malapposition, mens implantasjon av en stent som er for stor for aorta kan forårsake overstretch, rive og skade på fartøyet. Derfor anbefaler vi å bruke stenter mellom 2,0 og 2,5 mm i diameter, og å holde implantasjonstrykket innenfor det anbefalte området uten å overstrekke stenten. Det mest passende implantasjonstrykket er vanligvis gitt av stentprodusenten. Overflødig skade på lårbenet og deretter vena cava bør unngås fordi karveggene er ekstremt tynne og veldig enkle å skade, noe som resulterer i blødning som er vanskelig å stoppe. Lårarterien skiller seg fra lårbenet ved pulsering, som bør observeres nøye. En annen fallgruve er muligheten for arteriell skade og disseksjon når du introduserer ledetråden og / eller ballongkateteret. Arteriell disseksjon kan minimeres ved å kontrollere og strekke lårarterien distalt med slynger ved hjelp av silkebånd mens ballongkateteret introduseres. Det er viktig å umiddelbart slutte å fremme enheten når motstand oppstår. I dette tilfellet vil små bevegelser mellom tommel og pekefinger bidra til å endre retningen på enheten. Etter vår erfaring er dette oftest tilfelle like under inguinal ligament og lenger opp, når den vanlige iliac arterien nærmer seg bifurkasjonen, da den går dypere ned i retroperitonealrommet her. Det vil sikkert være en læringskurve for operatøren før overlevelsesraten er stabil, og med litt erfaring er gjennomsnittlig kirurgisk tid ca 20 min.
Hos mennesker blir stenter vanligvis implantert i alvorlig innsnevrede aterosklerotiske arterier. Selv om apoE-mangel generelt gjør dyr mer utsatt for utvikling av aterosklerotiske lesjoner, observerte vi ingen plakkdannelse hos våre rotter, mest sannsynlig fordi vestlig diettfôring ikke ble startet før stentimplantasjon. Hvis stentimplantasjon i aterosklerotiske lesjoner er ønsket, bør vestlig diett starte på 6\u20128 uker etter fødselen og fortsette til offer. Aterosklerotiske lesjoner i mottakelige stammer vil utvikle seg etter 7\u201214 uker på fettfattig diett22. Så langt er bare begrensede data om apoE-/- rotter publisert. Imidlertid rapporterte ingen studie spontan lesjonsutvikling før en alder av 20 uker23. Zhao et al. observert typisk aterosklerose i apoE-/- rotter etter minst 24 uker med en kontinuerlig økning i plakkbyrde og lesjonsgrad til offer ved 72 uker15. Således, ifølge litteraturen, er det usannsynlig at rotter ville utvikle spontan aterosklerose ved 14-16 ukers alder. Derfor anbefaler vi å bruke eldre rotter og starte vestlig diett så tidlig som mulig hvis stentimplantasjon i pre-dannede aterosklerotiske lesjoner er ønsket for studien.
Seks dyr overlevde ikke operasjonen. To dyr døde av stenttrombose til tross for administrering av klopidogrel. For å redusere stenttrombose kan dyr forhåndsbehandles i 48 timer med aspirin eller få en intraperitoneal injeksjon av enoksaparin postoperativt. Innføring av klopidogrel en dag før operasjonen kan også redusere risikoen for trombose, men enhver intensivering av anti-trombotisk terapi samtidig øker risikoen for blødning. Stenttrombose er en vanlig komplikasjon av PCI24,25,26 og kan ha flere grunner. Potensielt, i vår studie, stent trombose dødsfall som følge av utilstrekkelig ballong inflasjon og samtidig stent misbillighet. I motsetning til stentimplantasjon hos mennesker, ble stentutplassering i rotte abdominal aorta ikke kontrollert av angiografi. Derfor kan ineffektiv ballonginflasjon ikke oppdages og korrigeres under operasjonen. På samme måte kan stentutplassering føre til utilsiktet okklusjon av et forgreningsfartøy. Tatt i betraktning at det ikke er praktisk mulig å utføre operasjonen som krever bruk av et kirurgisk mikroskop under fluoroskopisk kontroll, anbefaler vi å åpne magen for å bekrefte den nøyaktige utplasseringen av stenten, i det minste for de første prosedyrene. Andre potensielle årsaker til stenttrombose kan være inflammatoriske reaksjoner, alvorlig skade eller disseksjoner av karveggen. Kirurgen må være oppmerksom på eventuelle kliniske tegn som indikerer disse komplikasjonene, og dyrene må inspiseres hver dag gjennom observasjonsperioden.
Rotte abdominal aorta måler mellom 1,8 mm og 3,0 mm i diameter, avhengig av dyrets vekt27,28. Fremrykking av en stor stent gjennom de enda mindre lår- og iliacarteriene kan forårsake intim tåre og skade på karveggen. Derfor er denne teknikken begrenset til implantasjon av mindre stenter (mellom 2,0 og 2,5 mm i diameter) for å unngå overstrekking eller skade på karveggen på aorta.
En annen begrensning er nødvendigheten av å ligating lårarterien for å oppnå hemostase etter prosedyren, potensielt bærer risikoen for lavere lem iskemi. Tidligere studier viste imidlertid at sikkerhetsarterier samt tilpasninger av mikrovaskulaturen distal til okklusjonen er i stand til å opprettholde perfusjon i underekstremiteten etter ligasjon av lårarterien hos rotter29, og ingen av våre rotter viste kliniske tegn på nedre lem iskemi i observasjonsperioden. Likevel bør etterforskerne være klar over denne potensielle risikoen, da lem iskemi ikke bare representerer en potensiell årsak til postoperativ død, men kan også potensielt indusere en systemisk inflammatorisk reaksjon, potensielt partisk resultatene.
Mens rotter generelt er en kostnadseffektiv dyremodell, øker bruken av genetisk modifisert apoE- / - rotter kostnadene. En annen begrensning er at det tar relativt lang tid før aterosklerotiske plakk har utviklet seg hos rotter. Videre er det noen viktige hemodynamiske forskjeller mellom aorta og koronararteriene som fortjener nærmere oppmerksomhet. Skjærstress er høyere i aorta sammenlignet med koronarene, og bifurkasjoner som forårsaker turbulent blodstrøm er fraværende. Dette reduserer utviklingen av intimal hyperplasi og omfanget av restenose.
Restenose er en av de viktigste faktorene som begrenser den langsiktige suksessen til koronarstenter. En rekke dyremodeller har blitt brukt til å studere patofysiologien til restenose, hver med sine egne fordeler og mangler. Sammenlignet med andre dyremodeller har rotter fordelen av høy gjennomstrømning, enkel håndtering og boliger, reproduserbarhet, samt kostnadseffektivitet, samtidig som de tillater implantering av menneskelige koronarstenter. Den første protokollen av abdominal aorta stenting hos rotter ble rapportert av Langeveld et al.11. Denne modellen krever imidlertid en trans-abdominal tilgang for å introdusere stenten, som er forbundet med en fysisk innsnevring av aorta for å oppnå et midlertidig avbrudd i blodstrømmen. Den resulterende manipulasjonen og karskaden kan potensielt forårsake inflammatoriske reaksjoner, noe som kanskje ikke bare fører til komplikasjoner, men også til uttalt ISR12. Senere endret Oyamada et al. protokollen ved å introdusere stenten gjennom den vanlige iliac arterien12. De sammenlignet overlevelsesraten mellom de to forskjellige tilnærmingene (trans-aorta versus trans-iliac arterie) og fant en betydelig høyere dødelighet hos dyr med trans-abdominale utplasserte stenter (57% versus 11%, p < 0,05). Rotter døde oftest av trombose på snittet / suturstedet, noe som er katastrofalt når det forekommer i buka aorta12. Ytterligere reduksjon av traumer og etterligning av implantasjonsteknikken hos mennesker nærmere, brukte vi en trans-femoral tilgang for å introdusere stenten og rapporterte en dødelighet på 14%. To rotter døde hver av svikt i stenging av fartøy, indre blødninger og stenttrombose. Nyere studier rapporterte imidlertid dødelighet så lavt som 6% etter stentimplantasjon i rotte abdominal aorta selv med trans-aorta tilgang30,31. Likevel var den kombinerte sykeligheten og dødeligheten 13,4%, i en studie av Nevzati et al. etter implantasjon av magnesiumstenter i rotte aorta30. Mens verken fartøyslukkingssvikt eller intern blødning ble rapportert i serien, var stenttrombose tydelig hos 10,5% av rotter30. På den annen side rapporterte Aquarius et al. ikke noen stenttrombose etter behandling av sidevegganeurisme med strømningsavledere, men denne studien brukte tynnere stentstivenheter, og dobbel antiplateletbehandling ble administrert til rotter31. Vi prøvde å finne en balanse mellom risikoen for stenttrombose og blødningsrisiko og administrert klopidogrel og heparin i studien vår. Selv om dette kan ha redusert risikoen for stenttrombose, som skjedde hos 4,76% av rotter, kan det også ha vært årsaken til den relativt høyere risikoen for blødning (9,52% av rotter), enten på grunn av intern blødning eller svikt i lukking av fartøy.
Her demonstrerte vi implantasjonen av en stoff-eluting stent i rotte abdominal aorta, men på samme måte kan denne metoden brukes til evaluering av andre, tilsvarende store stentenheter, for eksempel nakne metallstenter eller bioresorbable vaskulære stillaser.
Oppsummert er abdominal aorta stenting av apolipoprotein E-mangelfulle rotter en pålitelig og reproduserbar modell for å undersøke ISR etter stentimplantasjon. Modellen kan utvides til bruk av eldre rotter, som er mer sannsynlig å utvikle aterosklerotiske lesjoner spontant, og ved å teste andre enheter som brukes til menneskelig koronarintervensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke fru Angela Freund for hennes uvurderlige tekniske assistanse med innebygging og lysbildeproduksjon. Vi vil også takke Mr. Tadeusz Stopinski ved Institute for Laboratory Animal Science &Experimental Surgery for hans innsiktsfulle hjelp med veterinærarbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
- Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
- Virmani, R., Farb, A.
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
- Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
- Knowles, J. W., Maeda, N.
- Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744 (2015).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
- Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9 (2011).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
- Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
- Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13 (2014).
- Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950 (2019).
- Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
- Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18 (2004).
- Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541 (2019).
- Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
- Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835 (2018).
- Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
- Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
- Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
- Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
- Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359 (2017).
- Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).
