Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Os vetores virais podem ser usados para expressar proteínas fluorescentes em subconjuntos específicos de células no tecido. Aqui, um vírus que expressa proteínas modificadas é introduzido no córtex visual primário do cérebro, realizando primeiro uma pequena craniotomia sobre essa área. Em seguida, uma micropipeta de vidro é baixada para o cérebro e um vetor viral associado ao dente é injetado no cérebro e o local da cirurgia é fechado.

Uma vez que o animal tenha se recuperado, a imagem pode ser realizada para acompanhar o destino das células marcadas com fluorescência in vivo ou em seções cerebrais. As principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como marcação de corante fluorescente e linhagens de camundongos transgênicos, são que ela pode atingir tipos de células individuais e é mais barata e demorada do que estabelecer uma linha transgênica. O uso de vetores virais adeno-associados é aprovado para o nível de biossegurança um ou BSL um.

Aqui, um jaleco e luvas serão usados de acordo com os procedimentos para lidar com os agentes BSL um, começando preparando um gabinete de biossegurança Classe dois para o vírus de citação de Ali. Isso preservará a atividade do vírus, evitando repetições, congelamento e descongelamento. Limpe o gabinete de biossegurança de quaisquer objetos desnecessários e esterilize a superfície com etanol 70%.

Coloque um copo contendo uma solução de alvejante a 10% na cabine de biossegurança para coletar um resíduo contaminado com vírus associado ao dental. Também colocados tubos estéreis de 0,5 mililitro e um recipiente de gelo seco. Descongele o estoque viral no gelo fora do gabinete de biossegurança.

Vortex o vírus e abra o tubo dentro do capô. Pipete o volume desejado em um tubo de 0,5 mililitro. Feche o tubo e coloque-o no gelo seco.

Para piscar, congele o vírus quando todo o vírus tiver sido alíquota. Descarte o tubo vazio e as pontas da pipeta no recipiente de resíduos de alvejante a 10%. Remova o recipiente de resíduos do exaustor.

Adicione mais 10% de alvejante. Espere de cinco a 10 minutos e despeje o alvejante na pia. Descarte todos os resíduos plásticos em um recipiente de risco biológico.

De acordo com os protocolos institucionais, limpe qualquer equipamento ou superfície que tenha entrado em contato com o vírus com alvejante a 10%. Remova e descarte as luvas. Armazene as alíquotas em um freezer de 80 graus Celsius negativos.

Cubra a área cirúrgica com papel absorvente de bancada de laboratório. A ferramenta cirúrgica deve ser estéril e a cirurgia deve ser realizada em condições assépticas. Cubra a área adjacente à área cirúrgica com papel de bancada absorvente.

Esta área será dedicada ao carregamento das micropipetas com vírus. Coloque uma alíquota do vírus em um recipiente com gelo e deixe-o descongelar no gelo enquanto a cirurgia está sendo realizada, coloque um recipiente de resíduos com alvejante a 10% na área dedicada ao manuseio do vírus para descartar quaisquer pontas de pipeta ou outros itens que entrem em contato com o vírus. Puxe uma micropipeta de rolo de fio de vidro para um diâmetro de ponta de aproximadamente 20 mícrons.

Coloque uma pequena gota de óleo mineral na extremidade cega da micropipeta e insira o êmbolo de arame fornecido com as micropipetas. Prenda a micropipeta no clamp do braço da microbomba. Usando tesoura cirúrgica.

Remova o cabelo do topo da cabeça de um rato anestesiado. Em seguida, prenda o mouse em um estéreo ataca. Banhe a cabeça em etanol e Betadine para esterilizar a área.

Coloque uma gota de pomada para os olhos tobradex em cada olho para manter os olhos úmidos durante a cirurgia. Faça uma incisão na linha média da cabeça e puxe a pele para trás para expor o crânio usando uma pinça de ponta fina. Remova cuidadosamente o painel do crânio.

Localize a área a ser injetada usando coordenadas estereotáxicas e marque o crânio com uma caneta cirúrgica. Usando uma broca dentária com uma broca de 1,4 milímetro, afine uma área do crânio, de aproximadamente dois milímetros de diâmetro, até que o crânio rache. Dividindo a área desbastada em vários segmentos ao longo deste procedimento.

Aplique solução salina estéril para manter o crânio úmido. Realize uma craniotomia removendo suavemente os segmentos finos do crânio usando uma pinça de ponta extra fina. Coloque um lenço Kim sobre a tampa do tubo de vírus.

Em seguida, abra o tubo para uma injeção de um microlitro. Pipete 1,5 microlitros em um pequeno pedaço de paraforme. Em seguida, coloque a ponta da micropipeta no estoque viral e retire manualmente o êmbolo.

Se houver dificuldade em colocar estoque viral na micropipeta, a ponta pode ser ligeiramente aumentada perfurando um lenço kim com a micropipeta para quebrar uma pequena porção do vidro, abaixe o braço da microbomba no êmbolo até que uma pequena quantidade de vírus seja dissipada da ponta da micropipeta. Remova esta gota com um aplicador de ponta de algodão e descarte o aplicador em um recipiente de lixo. Aplique uma gota de óleo mineral na ponta da micropipeta para evitar entupimentos à medida que a micropipeta é abaixada para o cérebro, as coordenadas estereotáxicas X e Y usando posicionam a micropipeta sobre a área a ser injetada.

Neste experimento, as coordenadas estereotáxicas usadas para localizar o córtex visual primário são 2,7 milímetros de torema posterior e 2,5 milímetros laterais à linha média. Abaixe muito lentamente a micropipeta a uma taxa aproximada de um milímetro a cada minuto. Para a profundidade desejada, insira os parâmetros de injeção desejados na caixa do controlador da micro bomba CYS micro four.

Para este experimento, um microlitro ao longo de 10 minutos será usado como taxa de injeção. Inicie a injeção. Quando a injeção terminar.

Deixe a pipeta descansar por um a dois minutos para evitar o influxo de vírus durante a remoção. Após esse período, muito lentamente, remova a micropipeta do cérebro, suture o couro cabeludo e sele-o com cola de tecido. Deixe o animal se recuperar sob uma lâmpada de calor até que esteja deambulando.

Em seguida, devolva-o à sua gaiola. Experimentos de imagem podem ser realizados dias a semanas após a injeção viral. Após a cirurgia e a injeção, enxágue a micropipeta com alvejante a 10% e descarte-a em um recipiente para objetos cortantes.

Adicione mais 10% de alvejante ao recipiente de resíduos. Espere de cinco a 10 minutos e despeje o alvejante na pia. Descarte os resíduos em um recipiente de risco biológico de acordo com as diretrizes institucionais.

Descarte o papel de bancada do laboratório em uma lixeira de risco biológico. Limpe todas as superfícies e instrumentos que possam ter entrado em contato com o vírus. Com 10% de alvejante, o vírus não utilizado pode ser congelado.

Novamente, tendo em mente que os ciclos repetidos de congelamento causam degradação do vírus. Esta imagem mostra neurônios transduzidos após a injeção de sorotipo de vírus duplo, encalhado e adeno-associado. Um. O corpo celular e os dendritos proximais e distais são claramente visíveis em seções fixas.

Aqui, a rotulagem típica de uma injeção viral intracraniana no córtex visual primário é mostrada. Observe a extensão da disseminação viral, bem como neurônios, glia e processos marcados. A injeção de vetor viral no hipocampo também resulta em células marcadas claramente visíveis, como mostrado nesta imagem, uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter muito cuidado ao abaixar e aumentar o microFIT no cérebro. Não se esqueça de que trabalhar com vetores virais pode ser extremamente perigoso. Sempre siga os procedimentos adequados para o manuseio de agentes de risco biológico definidos pelos Centros de Controle de Doenças.

Consulte o escritório de segurança da sua instituição para obter aprovação e orientação antes de realizar experimentos usando vírus.