Name: Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a injeção intracraniana de vetores virais adeno-associados para marcação fluorescente de neurônios e glia no córtex visual. Esta técnica permite o estudo dinâmico de células específicas in vivo.

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Este trabalho só foi possível por concessões do NIH (EY012977), um Prémio Carreira na de Ciências Biomédicas da Burroughs Wellcome Fund, a Fundação Whitehall, e da Fundação Sloan (AKM).

1. Manuseio e Armazenamento de vírus <ol><li> Uma protecção adequada e técnicas de manejo devem ser escolhidos com base no nível de biossegurança do vírus para ser usado. Estas práticas podem ser encontrados em Biossegurança em Microbiologia e Biomédica ª edição Laboratories 5, disponível no site do CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). O uso de vetores AAV é aprovado para o Nível de Biossegurança 1 (NB-1). Para o experimento mostrado aqui, um jaleco e luvas vai ser usado durante o manuseamento do vírus, de acordo com os procedimentos para a manipulação de NBS-1 agentes. </li><li> Para preservar a atividade do vírus é melhor dividi-lo em pequenas alíquotas para evitar o congelamento e descongelamento repetidos. </li><li> Prepare um Gabinete de Biossegurança (BSC) Classe II de alíquotas de vírus por limpar o BSC de quaisquer objetos desnecessários e esterilizar a superfície com EtOH 70%. Coloque um copo contendo solução de água sanitária a 10% no capô para a recolha de resíduos contaminados AAV. Também colocado no BSC são estéreis tubos de 0,5 ml e um recipiente de gelo seco. </li><li> Descongelar estoque viral no gelo fora do BSC. </li><li> Vortex vírus e abrir o tubo dentro do BSC. </li><li> Pipetar volume da alíquota desejada (por exemplo, 5 mL) em um tubo de 0,5 ml, fechar o tubo e colocá-lo no gelo seco para flash-freeze o vírus. </li><li> Quando todos os vírus foi aliquotado, alienar o tubo de vírus e ponteiras no contentor de resíduos contendo lixívia a 10%. </li><li> Remova o recipiente de resíduos da capa e adicionar água sanitária a 10% adicionais, em seguida, despeje a lixívia na pia. Descarte de resíduos plásticos em um recipiente biohazard conforme instruído pelo oficial de seu instituto de biossegurança. </li><li> Limpar qualquer equipamento ou superfícies que entraram em contato com o vírus com água sanitária a 10%. Descarte as luvas. </li><li> Alíquotas armazenar em freezer -80 C °. </li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Cobrir a área cirúrgica com papel absorvente laboratório banco. Instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados e cirurgia feita sob condições assépticas, de acordo com a biossegurança de sua instituição e as diretrizes de uso animal. </li><li> Escolha uma área adjacente à área cirúrgica, que será dedicado a carregar o micropipetas com o vírus, e cobri-lo com papel absorvente laboratório banco. Transferir uma parte alíquota do vírus em um recipiente de gelo nesta área e permitir que o vírus para descongelar em gelo como a cirurgia está sendo realizada. </li><li> Configuração de um recipiente de resíduos de lixívia a 10% na área dedicada vírus manuseio para a eliminação de pontas de pipeta, etc, que entram em contato com o vírus. </li><li> Puxe uma micropipeta de vidro Wiretrol a um diâmetro da ponta de aproximadamente 20 microns. Coloque uma pequena gota de óleo mineral na extremidade sem corte da micropipeta e inserir o êmbolo de arame fornecido com o micropipetas. </li><li> Assegurar a micropipeta no grampo do braço micropump. </li><li> Injetar um rato por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,5 mg / kg. Anestesiar o rato com Avertin via intraperitoneal com uma dose de 200 mg / kg e remover o cabelo do topo da cabeça com uma tesoura cirúrgica, certificando-se de deixar margens grande o suficiente para impedir que o cabelo de entrar na incisão. </li><li> Anexar uma manta de aquecimento à base de um stereotax para manter uma temperatura corporal de 37 ° C durante toda a cirurgia e segura o mouse na stereotax. </li><li> Banhar a cabeça com três esfrega alternadas de etanol e betadine para esterilizar a área. </li><li> Coloque uma gota de TOBRADEX pomada em cada olho para manter os olhos úmidos durante a cirurgia. </li><li> Faça uma incisão abaixo da linha média da cabeça e puxe a pele de volta para expor o crânio. </li><li> Remova cuidadosamente a fáscia do crânio usando uma pinça de ponta fina. </li><li> Localizar a área a ser injetado usando coordenadas estereotáxica e marcar o crânio com uma caneta cirúrgica. </li><li> Usando uma broca de dentista com um 1,4 milímetros rebarba, uma área fina do crânio de aproximadamente dois milímetros de diâmetro, até as rachaduras do crânio, dividindo a área diluído em vários segmentos. </li><li> Todo esse procedimento, manter o crânio úmido com aplicações de soro fisiológico estéril. </li><li> Realizar uma craniotomia delicadamente removendo os segmentos crânio diluído com extra-fina com ponta fórceps. </li></ol> 3. Preparação de injeção <ol><li> Com um KimWipe colocado sobre a tampa, abra o tubo de vírus e de pipeta 1.5uL (para uma injeção 1uL) do vírus em um pequeno pedaço de parafilme. </li><li> Coloque a ponta da micropipeta para o estoque viral e retirar manualmente o êmbolo. Se a dificuldade é experimentada desenho estoque viral para a micropipeta, a ponta pode ser ligeiramente aumentada ser uma perfuração KimWipe com a micropipeta para quebrar uma pequena parte do vidro. </li><li> Braço inferior micropump em êmbolo até uma pequena quantidade de vírus é dissipada a partir da ponta da micropipeta. Remover esta pequena gota com um cotonete e aplicador de descarte em erascontainer e. </li><li> Aplique uma gota de óleo mineral para a ponta da micropipeta para evitar o entupimento como a micropipeta é abaixado no cérebro. </li></ol> 4. Injeção de vírus <ol><li> Usando o X e Y estereotáxica coordenadas, a posição da micropipeta sobre a área a ser injetada. Neste experimento, os estereotáxica coordenadas utilizadas para localizar córtex visual primário é posterior ao bregma 2,7 milímetro e 2,5 mm lateral à linha média. Muito lentamente o micropipeta (a uma taxa aproximada de 1mm/1minute) para a posição Z adequada. </li><li> Digite os parâmetros de injeção desejada na caixa de controlador de SYS MICRO4 micropump e iniciar a injeção. Para esta experiência, 1 microlitro mais de 10 minutos será usado como uma taxa de injeção. </li><li> Quando a injeção é terminar, deixe a pipeta para descansar por 1-2 minutos para evitar o efluxo do vírus durante a remoção. Após este período, muito lentamente remover a micropipeta do cérebro (mesma taxa acima). </li><li> Sutura no couro cabeludo e selá-lo com cola de tecido. Injetar o animal por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,1 mg / kg a cada 8-12 horas nas próximas 72 horas, ou enquanto o animal está exibindo sinais de dor. Permitir que o animal se recuperar sob uma lâmpada de calor até que esteja deambulando e pronto para ser devolvido à sua gaiola. Experimentos com imagens pode ser iniciada após o tempo de incubação desejado (dias a semanas após a injeção viral). </li></ol> 5. Limpeza <ol><li> Lavar a micropipeta com lixívia a 10% e descartá-lo em um recipiente adequado. </li><li> Dispor de recipiente de resíduos da mesma maneira como Seção 1. </li><li> Descarte o papel bancada do laboratório em bin de risco biológico e limpar todas as superfícies e instrumentos que possam ter estado em contacto com o vírus com água sanitária a 10%. </li><li> Vírus não utilizados podem ser congelados novamente, tendo em mente que repetidos de congelamento / descongelamento causar degradação do vírus. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Transduzidas neurônio após a injeção de double-stranded adeno-associated virus sorotipo 1 (dsAAV S1) carregando proteína verde fluorescente (GFP) sob controle do promotor CMV. O corpo da célula, bem como dendritos proximais e distais são claramente visíveis nas seções fixas fotografada usando um microscópio de epifluorescência. Barra de escala = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Labeling típico de uma injeção do vírus intracraniana em córtex visual primário usando S1 dsAAV mostrando a extensão da disseminação viral, assim como neurônios rotuladas, glia e processos. Barra de escala = 250 mM. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Rotulagem de células no hipocampo usando S1 dsAAV. Barra de escala = 250 mM. Estes números são adaptados de Lowery et al. 2009 1

<ol><li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li>
<li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model%2C+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li>
<li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain%3A+duration+and+modulation+of+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li>
<li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li>
</ol>

Os protocolos experimentais animais e foram aprovados pela Universidade de Rochester University Comissão de Recursos Animais (UCAR), em conformidade com o PHS Política de Assistência Humanitária e Uso de Animais de Laboratório.

Virally mediada entrega do gene tem um grande potencial para o estudo de processos neurológicos e tratamento de distúrbios cerebrais 1,2,3. A grande versatilidade desta técnica também pode ser explorada para fluorescente rótulo células para geração de imagens tanto in vitro como in vivo 4. Aqui demonstramos um procedimento detalhado para a transdução de neurônios e células gliais no córtex visual do rato usando um double-stranded do vírus adeno-associação expressando a proteína ve...

<table><tbody><tr><td>Adaptador para Camundongo e Rato Neonatal St&amp;#8211;lting</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Pode-se substituir por um estereotáxico comum para fixação de animais durante cirurgia</td></tr><tr><td>Tesoura Bonn Extrafina, 8,5 cm, ponta reta, borda de corte de 13 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinça para Curativo Ocular, 10 cm, largura da ponta 0,5 mm, curva</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 5/45 - Ponta Padrão Dumoxel, 11 cm, angulada</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Pinça de ponta extrafina para realização de craniotomia</td></tr><tr><td>Pinça de Padrão Regular, reta, ponta 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de Controle Microtorque e Empunhadura Tech2000</td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>Broca dentária</td></tr><tr><td>Fresas de Aço Inoxidável para Microbroca, diâmetro da ponta de 1,4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-14</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas Wiretrol, para aplicar 1–5 µL</td><td>VWR international</td><td>5-000-1001 ou 53480-287</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>VWR international</td><td>29447-338</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador Manual e Base Basculante (destro)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301-M3-R</td><td>Utilizado para determinar as coordenadas estereotáxicas</td></tr><tr><td>UltraMicroBomba (UMP3) (uma unidade) com Controlador SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>VWR international</td><td>95056-952</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de Micropipetas P-97 Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Tobradex</td><td></td><td></td><td>Disponível nos serviços veterinários da sua instituição&amp;rsquo;s</td></tr></tbody></table>

injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Injeção intracraniana de vetores virais projetadas para expressar uma proteína fluorescente é uma técnica de rotulagem versátil para visualização de subgrupos específicos de células em diferentes regiões do cérebro in vivo e em secções do cérebro. Ao contrário da injeção de corantes fluorescentes, rotulagem viral oferece segmentação de tipos de células individuais e é menos caro e demorado do que estabelecer linhas de ratinhos transgénicos. Nesta técnica, um vetor adeno-associado (AAV) viral é injetado intracraniana usando coordenadas estereotáxica, uma micropipeta e uma bomba automatizada para entrega preciso de AAV para a área desejada com o mínimo dano ao tecido circundante. Parâmetros de injeção pode ser adaptado para experimentos individuais, ajustando a idade do animal em injeção, injeção de localização, volume de injeção, a taxa de injeção, sorotipo AAV eo promotor dirigindo a expressão do gene. Dependendo das condições de escolhido, virally induzida a expressão do transgene pode permitir a visualização de grupos de células, as células individuais ou multa processos celulares, até o nível das espinhas dendríticas. O experimento mostrado aqui representa uma injeção de double-stranded AAV expressando a proteína fluorescente verde para a rotulagem de neurônios e células gliais no córtex visual primário do mouse.

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

A injeção intracraniana de vetores virais projetados para expressar uma proteína fluorescente é uma técnica de marcação versátil para a visualização de específicos...

Vetores virais podem ser utilizados para expressar proteínas fluorescentes em subconjuntos específicos de células em tecidos. Aqui, um vírus que expressa proteínas modificadas é introduzido no córtex visual primário do cérebro mediante a realização inicial de uma pequena craniotomia sobre essa região. Em seguida, uma micropipeta de vidro é inserida no cérebro e um vetor viral associado a dentes é injetado no tecido encefálico, após o que o local cirúrgico é fechado.Uma vez que o animal tenha se recuperado, pode-se realizar a imagem para acompanhar os destinos de células marcadas com fluorescência in vivo ou em cortes cerebrais. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como marcação com corantes fluorescentes e linhagens de camundongos transgênicos, são a possibilidade de direcionar tipos celulares individuais e o fato de ser menos onerosa e demorada do que o estabelecimento de uma linhagem transgênica. O uso de vetores virais adeno-associados é aprovado para o nível de biossegurança um ou BSL um.Aqui, será usado jaleco de laboratório e luvas, de acordo com os procedimentos para manipulação de agentes BSL 1, iniciando pelo preparo de uma cabine de seg

intracranial-injection-of-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Pereira, M. et. al., Reprogramação direta in vivo de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vírus adeno-associado no córtex cerebral de um camundongo transgênico para fornecer reprogramação neuronal dependente de Cre e genes repórteres fluorescentes em células gliais.

Injeção estereotáxica de vetores virais para reprogramação de células gliais em modelo de camundongo

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Fonte: Grames, M. S., et al. Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus adeno-associado a ratos e avaliação da transdução do sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a injeção na veia da cauda do vírus adeno-associado recombinante (AAV) em ratos. Após a injeção na veia lateral da cauda, o vírus entra na corrente sanguínea, circula pelo coração e chega ao cérebro, onde entra nos neurônios e facilita a produção de proteínas-alvo para aplicações...

 Administração intravenosa de vetores virais adeno-associados recombinantes em modelo de rato 

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal.  Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

O cérebro é um local único, com qualidades que não são bem representados por análises in vitro ou ectópicas. Ortotópico modelos de mouse com localização e características de crescimento reprodutíveis podem ser criados de forma confiável com injeções intracranianas utilizando um instrumento de fixação estereotáxica e uma bomba de seringa de baixa pressão.

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.

Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Aqui, detalhamos um protocolo otimizado para injeção de veia da cauda lateral de camundongo para administrar sistemicamente o vírus adeno-associado (AAV) em camundongos adultos. Além disso, descrevemos protocolos de ensaios comumente usados para avaliar a transdução de AAV.

Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Uma nova técnica para entrega generalizada de vírus adeno-associado que usa infusão de vírus subaracnóideo é descrita. Este método não apenas garante a transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos em camadas superficiais, mas também resulta na expressão seletiva do transgene em neurônios piramidais da camada cinco, mesmo quando se usa um promotor não seletivo.

Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2

Aprenda a injeção intracraniana de vetores virais adeno-associados para marcação fluorescente de neurônios e glia no córtex visual. Esta técnica permite o estudo dinâmico de células específicas in vivo.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

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