Name: Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a gerar culturas primárias de melanócitos e fibroblastos de pele de camundongos recém-nascidos com este método rápido e simplificado. Ideal para estudos de biologia celular cutânea, pigmentação e cicatrização.

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Os autores agradecem à Fundação Damon Runyon (prêmio de inovação #38-16 a C.E.B.) e Pelotonia (B.M.M.) para apoio financeiro. Agradecemos a C. Haines e a C. Wormsbaecher que forneceram comentários para melhorar o texto do manuscrito. Este trabalho beneficiou do recurso compartilhado de citometria analítica do centro de câncer do estado de Ohio, que é apoiado pela NIH p30 CA016058.

Obter aprovação do seu Comitê de ética animal institucional antes de iniciar este ou qualquer outro estudo envolvendo animais. Os experimentos realizados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual de Ohio (IACUC, protocolo #2012A00000134).
1. preparação do protocolo
Nota: As seguintes instruções da preparação do reagente são apropriadas para a geração de 9 cm2 culturas do melanócito e do fibroblasto de um único rato. Consulte o guia de preparação do reagente na tabela 1 para isolamentos de maior escala.
<ol><li>Prepare 1,5 mL de solução de colágeno contendo 50 μg/mL de colágeno em 0,1 M de ácido acético glacial.</li>
	<li>Em um armário do fluxo laminar, cubra um poço de um prato da cultura da pilha de 6 poços com 8 μg/cm2 (1,44 ml) solução do colagénio. Assegure-se de que o poço esteja completamente coberto pela solução de colágeno. Incubar o prato a 37 ° c durante 3 h ou a 4 ° c durante a noite. Antes da utilização, lave o poço revestido com colágeno duas vezes com 1,35 mL de solução salina tampão fosfato estéril (PBS) (150 μL de PBS por 1 cm2).</li>
	<li>Monte o helicóptero do tecido em um armário do fluxo laminar coloc com cuidado um disco de desbastamento na plataforma do interruptor inversor do tecido e prendendo uma lâmina estéril ao braço móvel.</li>
	<li>Prepare 3 mL de 1x antibiótico/antimicótico solução diluindo 100x antibiótico/antimicóticos solução de estoque em PBS estéril.</li>
	<li>Prepare 3 mL de tampão de digestão da pele fresco contendo 10% de soro bovino fetal, 1% de solução de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 10 mg/mL de colagenase tipo I, 0,25% de tripsina suína e 0, 2 mg/mL de desoxiribonuclease I em RPMI 1640.</li>
	<li>Prepare 6 ml de meios de melanócitos frescos contendo 10% de soro bovino fetal, 7% de soro de cavalo, 1% de solução de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 0,5 mm di-butyryl amp cíclico (dbcamp), 20 nm de phorbol 13-acetato (TPA) e 200 PM Nutriente Mix F-12 Ham ' s Media. Nota: As soluções de estoque concentrado de dbcAMP, TPA e CT podem ser feitas, aliquotadas e armazenadas por > 1 ano a-80 ° c. Os suportes de dados de base que faltam estes componentes podem ser guardados até 1 mês a 4 ° c.</li>
	<li>Prepare 4 mL de fibroblastos contendo 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de L-glutamina no meio de águia modificada de Dulbecco. Esta mídia pode ser armazenada a 4 ° c por até 1 mês.</li>
	<li>Prepare 40 mL de solução de paraformaldeído a 4% diluindo o paraformaldeído a 16% em PBS. Armazene qualquer excesso a 4 ° c por 1 mês ou-20 ° c por até 1 ano.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de saponina a 1% misturando 0,5 g de saponina em 50 mL de PBS a 37 ° c até que a saponina tenha sido completamente dissolvida. Esterilize a solução para o armazenamento a longo prazo usando uma seringa de 50 mL equipada com um filtro do PES de 0,2 μm. A solução de estoque resultante de saponina pode ser mantida a 4 ° c por 1 mês.</li>
	<li>Prepare 200 μL de 0,1% de solução de saponina por rato diluindo a solução de stock de saponina a 1% em PBS contendo 3% de albumina sérica bovina (BSA).</li>
	<li>Prepare 1 mL de solução de viabilidade diluindo 1 μL de corante de viabilidade fixável em 1 mL de PBS.</li>
</ol>2. isolamento de melanócitos e fibroblastos
<ol><li>Euthanize 0 a 4 filhotes masculinos e/ou fêmeas do C57Bl/6J do dia-velho pela decapitação e removem as extremidades dos ratos eutthanized usando tesouras cirúrgicas.</li>
	<li>Em um armário do fluxo laminar, enrole momentaneamente o tronco de cada rato em um prato de Petri estéril que contem o etanol de 70%. Retire o tronco do etanol e coloque-o em um prato de Petri vazio e estéril.</li>
	<li>Usando tesouras cirúrgicas, esterilizados em etanol a 70%, faça uma incisão na pele no lado ventral do tronco a partir do pescoço até a cauda. Descasque a pele do tronco do rato usando fórceps estéril.</li>
	<li>Coloc o lado da derma da pele para baixo em um prato de 6 poços que contem 3 mL do antibiótico 1x/solução Antimycotic e incubar na temperatura ambiente por 2-3 minutos.</li>
	<li>Gire sobre o interruptor inversor do tecido com as seguintes configurações no lugar: espessura da fatia: 1 μm; Força da lâmina: ~ 60% do máximo; Velocidade: ~ 50% do máximo.</li>
	<li>Transfira a pele, o lado da derma para baixo, a um disco estéril do interruptor inversor do tecido e passe a pele completamente através do interruptor inversor ativado do tecido 3 vezes.</li>
	<li>Transfira a pele homogeneizada para um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 3 mL de tampão de digestão da pele. Misture a suspensão resultante pipetando para cima e para baixo 10-15 vezes com uma micropipeta P1000.</li>
	<li>Tampe o tubo cônico e incubar a amostra em um banho de água de 37 ° c por 15 min, invertendo o tubo a cada 3-5 min.</li>
	<li>Pellet as células na pele homogenear por centrifugação do tubo cônico em um rotor de balde balançando em 750 x g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando uma micropipeta P1000, lentamente e remover completamente o tampão da digestão da pele que tem cuidado para não perturbar o pellet. Nota: Uma porção da pele inteira pode ser conservada nesta fase e usada como um controle para a etapa 3: confirmação da pureza celular. Coe essas células através de um filtro de células de 70 μm e, em seguida, comece na etapa 3,5 para processamento adicional.</li>
	<li>Ressuspender completamente o pellet celular em 1 mL de melanocyte Media pipetando para cima e para baixo 15-20 vezes com uma micropipeta P1000. Adicione a solução de célula resultante gota gota a um poço não revestido de um prato de 6 poços contendo 1 ml de melanocyte Media.</li>
	<li>Coloc o homogeneizado chapeado da pele em uma incubadora da cultura do tecido ajustada em 37 ° c e em 5% co2. Permitir que as culturas para incubar por 40 min. Nota: Durante este tempo, alguns fibroblastos no homogeneate da pele aderirão ao prato não revestido quando os melanócitos e os queratinócitos permanecerem na suspensão.</li>
	<li>Transfira o sobrenadante de cultura do prato não revestido para um poço de um prato de 6 poços pré-lavado e revestido com colágeno. Adicionar G418 à mídia de tal forma que a concentração final é 100 ng/mL.</li>
	<li>Adicione 2 mL de Fibroblast Media a um poço do prato não revestido, agora contendo fibroblastos aderentes.</li>
	<li>Incubar ambas as culturas durante a noite em uma incubadora da cultura do tecido ajustada em 37 ° c e em 5% CO2.</li>
	<li>Aspirar separadamente a mídia e todos os detritos de cada cultura, 16-24 h após o chapeamento. Lave cada prato duas vezes com 1 ml de PBS estéril e, em seguida, adicione 2 ml de melanócito Media fresco mais 100 ng/ml G418 à cultura de melanócitos e 2 ml de fibroblastos frescos para a cultura de fibroblastos.</li>
	<li>Depois que as culturas do melanócito foram tratadas com o G418 para 48 h, lave as pilhas duas vezes com 1 ml do PBS estéril e adicione 2 ml de meios frescos do melanócito sem G418 à cultura. Nota: Porque os fibroblastos na cultura do melanócito continuam a morrer fora do tratamento borne-G418, lavam o prato com o PBS estéril para remover as pilhas inoperantes e adicionam meios frescos do melanócito. As culturas do melanocyte e do fibroblasto devem ser é quando alcangam 70-80% confluency.</li>
</ol>3. confirmação da pureza celular
<ol><li>Aspirar a mídia de cada cultura e Lave cuidadosamente cada prato com 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Adicionar 0,7 mL de 0,25% de tripsina a cada cultura e incubar as culturas em tripsina a 37 ° c e 5% CO2 por 1 min.</li>
	<li>Desalojar as células pipetando a tripsina contra a parte inferior do prato utilizando uma micropipeta P1000.</li>
	<li>Adicione 0,7 ml dos meios apropriados a cada cultura tripsinizadas e transfira a solução da pilha em um tubo do microcentrifugador de 1,5 ml.</li>
	<li>Pellet as células por centrifugação em 750 x g por 2 min à temperatura ambiente. Retire e elimine cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma micropipeta P1000. Nota: As etapas 3.1-3.5 podem ser usadas para passar culturas do melanócito e do fibroblasto. A pelota resultante deve ser ressuscitada na mídia apropriada e colocada em um novo, não revestido (fibroblastos) ou pré-lavado, colágeno-revestido (melanócitos) prato.</li>
	<li>Ressuscita a pelota da pilha em 0,5 mL de PBS Ice-Cold.</li>
	<li>Enumerar e transferir 500.000 células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-refrigerada.</li>
	<li>Repita o passo 3,5 e, em seguida, Ressuspender as células em 100 μL de solução de viabilidade. Incubar a suspensão celular por 30 min a 4 ° c no escuro.</li>
	<li>Repita os passos 3.5-3.6 duas vezes.</li>
	<li>Repita o passo 3,5, em seguida, fixar as células por ressuscita a pelota em 100 μL de gelo frio 4% paraformaldeído solução. Incubar a suspensão durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Repita o passo 3,5 duas vezes, cada vez ressuscitem a pelota em 0,5 mL de 3% BSA em 1X PBS.</li>
	<li>Repita o passo 3,5 e, em seguida, Ressuspender o pellet de células em 100 μL de 0,1% de solução de saponina. Incubar a suspensão durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Repita o passo 3,5, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 100 μL de 0,1% solução de saponina contendo 0,5 μg de coelho anti-gp100 anticorpo, 0,5 μg de coelho anti-fibroblasto-específico proteína 1 (FSP1) anticorpo e 0, 25 μg de rato anti-Cytokeratin 14 (K14) anticorpo. Incubar a suspensão durante 1 h à temperatura ambiente no escuro. Nota: Enquanto o anticorpo K14 foi comprado pré-conjugado com Alexa fluor 647, os anticorpos gp100 e FSP1 foram conjugados para CF 555 e CF 488, respectivamente. A coloração das populações de controle também deve começar nesta etapa. As populações de células de controle devem ser isoladas da cultura e processadas conforme descrito nas etapas 3.5-3.12.</li>
	<li>Repita o passo 3,11 duas vezes, para remover qualquer anticorpo não acoplado.</li>
	<li>Repita o passo 3,5, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 200-400 μL de 3% BSA em 1X PBS.</li>
	<li>Passe a solução da pilha através de um filtro da pilha de 40 μm em um tubo redondo-inferior do poliestireno de 5 mL e analise as pilhas tensas pela citometria do fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Rittie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+skin+repair+in+humans+and+other+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communucation+and+Signal%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals.</a> Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).</li>
<li>Romanovsky, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+temperature%3A+its+role+in+thermoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Skin temperature: its role in thermoregulation.</a> Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).</li>
<li>Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+as+the+site+of+vitamin+D+synthesis+and+target+tissue+for+1%2C25-dihydroxyvitamin+D3.+Use+of+calcitriol+%281%2C25-dihydroxyvitamin+D3%29+for+treatment+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis.</a> Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+factors+that+regulate+skin+pigmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Physiological factors that regulate skin pigmentation.</a> Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes+and+their+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Melanocytes and their diseases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).</li>
<li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li>
<li>Thody, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheomelanin+as+well+as+eumelanin+is+present+in+human+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).</li>
<li>Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MC1R%3A+Front+and+Center+in+the+Bright+Side+of+Dark+Eumelanin+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).</li>
<li>Barsh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+controls+variation+in+human+skin+color%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">What controls variation in human skin color.</a> PLoS biology. 1 (1), 27(2003).</li>
<li>Abdel-Malek, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanocortin-1+receptor+is+a+key+regulator+of+human+cutaneous+pigmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation.</a> Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).</li>
<li>Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oculocutaneous+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oculocutaneous albinism.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43(2007).</li>
<li>Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+Pathology+of+Melasma+and+Its+Clinical+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).</li>
<li>D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+radiation+and+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">UV radiation and the skin.</a> International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+fibrosis%3A+novel+roles+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 123(2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Dickson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+that+express+hTERT+and+also+bypass+a+p16%28INK4a%29-enforced+mechanism+that+limits+life+span+become+immortal+yet+retain+normal+growth+and+differentiation+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A cultura in vitro de melanócitos primários e fibroblastos levou a avanços significativos na nossa compreensão da biologia da pele e da doença. Este protocolo melhora em cima dos métodos anteriores da isolação do melanócito reduzindo o tempo e o savvy técnico necessários para gerar culturas consistentes do melanócito ao permitir o isolamento simultâneo de fibroblastos da pele. Um romance, elemento de economia de tempo deste procedimento é que a derme e epiderme não precisam ser separadas. Em vez disso, as células da pele...

A pele de mamíferos é um órgão multicamada que protege o corpo de patógenos estrangeiros e irradiação ultravioleta (UVR). A pele também desempenha um papel crítico em processos homeostáticos como cicatrização de feridas, regulação da temperatura e produção de vitamina D1,2,3. A pele de mamíferos consiste em três tipos principais da pilha: melanócitos, fibroblasto e keratinocytes. Estes tipos de células povoam diferentes camadas da pele, com queratinócitos que compõem a epiderme, fibroblastos residentes na derme e melanócitos localizando a junção epidérmica-dérmica e folículos pilosos4. Aqui, nós detalham um procedimento simples que permita a geração simultânea de culturas primárias do melanócito e do fibroblasto da pele murino.
Os melanócitos são células produtoras de pigmentos encontradas em muitos locais em todo o corpo humano, incluindo a epiderme basal, íris, cóclea, cérebro e folículos pilosos5. A função primária dos melanócitos é gerar e secretar vesículas contendo melanina,denominadas melanosomas5,6. Os melanosomas contêm duas classes principais da melanina: eumelanina marrom/preto e feomelanina amarelo/vermelho6,7. Os processos bioquímicos dentro do melanócito regulam a abundância relativa de cada espécie da melanina e ajudam a determinar a cor do cabelo, da pele e do olho8,9. A melanina também serve para absorver a UVR e proteger os tecidos expostos ao sol da mutagenese10.
A disfunção de melanócitos pode causar defeitos pigmentares e aumentar a susceptibilidade do cancro da pele. Por exemplo, os remendos da pele Hyper-pigmented característicos do melasma são o resultado da superprodução focal da melanina, visto que as mutações genéticas do germline que comprometem genes envolvidos na síntese da melanina conduzem ao albinismo11,12 . O conhecimento íntimo da biologia do melanócito é exigido para desenvolver as estratégias que corrijam tais defeitos pigmentários e melhoram finalmente o bem-estar psicossocial dos indivíduos afligidos com estas doenças. Os déficits na produção de melanina e/ou a síntese preferencial de feomelanina também estão associados ao aumento do risco de câncer de pele10. Acredita-se que esse risco resulte da redução da proteção UVR6,13. Assim, métodos para melhorar ou restaurar a produção de eumelanina em melanócitos podem reduzir a incidência de câncer de pele nessas populações.
Os fibroblastos mesenquimais estabelecem o tecido conjuntivo e o suporte estrutural para todos os órgãos do corpo, incluindo a camada dérmica da pele14. A excreção de proteínas como colágeno, elastina, laminina e fibronectina permitem que os fibroblastos formem a matriz extracelular (ECM) que é essencial para a integridade tecidual1,14. Os fibroblastos também desempenham papéis essenciais em processos como cicatrização de feridas, inflamação, angiogênese e formação/progressão do câncer1,15,16.
Similar aos melanócitos, os defeitos na ativação e na função do fibroblasto podem promover o tumorigênese e a doença. Por exemplo, a ativação inadequada do fibroblasto conduz geralmente à formação da fibrose, resultando da deposição aumentada de componentes excedentes do ECM no tecido circunvizinho. Como os fibroblastos mantêm grande parte da integridade estrutural do corpo, a fibrose promove doenças que afetam inúmeros tecidos e órgãos, incluindo fibrose pulmonar idiopática, esclerose sistêmica, cirrose hepática e Fibrose cardíaca15. Os fibroblastos também desempenham um papel crítico no câncer16. Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são as células não malignas mais abundantes no microambiente de muitos tumores. Os CAFs demonstraram promover a proliferação tumoral, a progressão e a resistência terapêutica, modulando a rigidez tecidual, a produção local de citocinas e a função imune16.
As culturas de células primárias fornecem aos pesquisadores modelos geneticamente tratável para identificar e mitigar os defeitos de melanócitos e fibroblastos que levam à doença. No entanto, os métodos atuais para estabelecer culturas de melanócitos são demorados e tecnicamente desafiadores. A necessidade de tripsinização e a separação delicada da epiderme e da derma contribuem à variabilidade no rendimento experimental e fazem difícil executar experimentos em grande escala. Além disso, os protocolos para isolar simultaneamente os melanócitos e os fibroblasto da pele inteira estão faltando atualmente no campo.
Desenvolvemos um método para reduzir as etapas de processamento, a variabilidade e o tempo necessário para estabelecer culturas de melanócitos e fibroblastos da mesma amostra de pele inteira. Usando um método mecânico da homogeneização seguido por uma digestão breve, nossa estratégia diminui significativamente a quantidade de tempo hands-on exigido para isolar melanócitos preliminares ao permitir o isolamento simultâneo do fibroblasto. O aumento da velocidade, eficiência e consistência deste protocolo, em combinação com a capacidade de isolar melanócitos de camundongos de 0-4 dias de idade, fornece aos pesquisadores a flexibilidade para realizar uma ampla gama de experimentos do que antes possível.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m PES filtro de seringa estéril</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>10 cm placa de cultura de células</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; filtro de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL de tubos de poliestireno de fundo redondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL0516</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antimicótica Antibiótica (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>CF 488A Kit de Rotulagem de Anticorpos Mix-n-Stain</td><td>Biotium</td><td>92273</td><td></td></tr><tr><td>CF 555 Kit de Rotulagem de Anticorpos Mix-n-Stain</td><td>Biotium</td><td>92274</td><td></td></tr><tr><td>Toxina da cólera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno da cauda de rato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo I</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS004156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Solução de penicilina/estreptomicina Fisher</td><td>Scientific</td><td>30-002-CL</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de citoqueratina 14 Alexa Fluor 647</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34403AF647</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS002058</td><td></td></tr><tr><td>Di-butiril AMP cíclico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermo Etanol de Fisher</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>, prova 200</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro</td><td>bovino Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>FSP1/S100A4 anticorpo</td><td>Millipore Sigma</td><td>07-2274</td><td></td></tr><tr><td>G418 Dissulfeto</td><td>P212121</td><td>LGB-418-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>VWR</td><td>VWRV0714</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>HyClone L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003402</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Melanoma gp100 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab137078</td><td></td></tr><tr><td>Mix de nutrientes F-12 Mídia de presunto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6760</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-Miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeído</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina Suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85450C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Picador de Tecidos</td><td>Ted Pella</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Disco de plástico picador de tecidos</td><td>Ted Pella</td><td>10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>VWRL0154-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de murina primária

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Os defeitos na função do fibroblasto ou do melanócito são associados com as doenças de pele, incluindo a função pobre da barreira, a cura defeituosa da ferida, defeitos da pigmentação e cancro. Vital para a compreensão e melhora dessas doenças são experimentos em fibroblastos primários e culturas de melanócitos. Não obstante, os protocolos atuais para a isolação do melanócito exigem que as camadas epidérmicas e dérmicas da pele estejam tripsinizadas e desassociaram manualmente. Este processo é demorado, tecnicamente desafiador e contribui para rendimentos inconsistentes. Além disso, os métodos para gerar simultaneamente culturas puras do fibroblasto da mesma amostra do tecido não estão prontamente-disponíveis. Aqui, nós descrevemos um protocolo melhorado para isolando melanócitos e fibroblastos da pele dos ratos em dias pós-natal 0-4. Neste protocolo, a pele inteira é homogeneizada mecanicamente usando um interruptor inversor do tecido e então digerido momentaneamente com o colagenase e o Trypsin. As populações da pilha são isoladas então com o chapeamento seletivo seguido pelo tratamento G418. Este procedimento resulta em rendimentos consistentes de melanócitos e fibroblastos de um único rato em menos de 90 min. Este protocolo também é facilmente escalável, permitindo que os pesquisadores processem grandes coortes de animais sem um aumento significativo no tempo hands-on. Nós mostramos através das avaliações cytometric do do fluxo que as culturas estabelecidas usando este protocolo são enriquecidas altamente para melanócitos ou fibroblasto.

Camundongos machos e fêmeas C57Bl/6J foram eutanasiados em dias pós-natal 0-4 e a pele truncal foi submetida à dissociação mecânica como descrito acima. Após o corte, a pele formou uma lama viscosa sem qualquer sinal de tecido estrutural. A centrifugação deste chorume conduziu à formação de uma grande pelota da pilha na parte inferior do tubo cônico e de uma camada de adiposo que flutua sobre o sobrenadante. Esta camada adiposa foi descartada com o sobrenadante, enquanto a pelota restante da célula foi ressuscipended e t...

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Este protocolo descreve um método rápido e simples para gerar culturas primárias de melanócitos e fibroblastos a partir de camundongos. Como essa técnica não exige que a epiderme e a derme sejam separadas, ela pode ser realizada de forma rápida e consistente com treinamento mínimo. Este método pode ser usado para estudar a melanócito cutâneo e a biologia do fibroblasto.Experimentos nessas culturas podem fornecer insights relevantes para os defeitos de câncer, cicatrização de feridas e pigmentação. Antes de começar, certifique-se de preparar todos os reagentes necessários e verificar a temperatura do banho de água. Se você planeja processar várias amostras, consulte o guia de dimensionamento do reagente na Tabela Um.Demonstrando este procedimento será Brandon Murphy, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Em um gabinete de fluxo laminar, role brevemente o tronco de cada rato eutanizado em uma placa de Petri estéril contendo 70% de etanol. Retire o rato do etanol e coloque-o em uma placa de Petri vazia estéril.Em seguida, esterilizar a tesoura cirúrgica em 70% de etanol. Use estas tesouras para fazer uma incisão na pele no lado ventral do tronco, começando pelo pescoço e c

rapid-generation-of-primary-murine-melanocyte-and-fibroblast-cultures

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

Neste protocolo, w e identificou um novo população de células de melanócito-like (também conhecido como melanócitos cardíacos) nos corações de ratos e humanos que contribuem para a arritmia atrial dispara em camundongos.

Isolar células de melanócito-like primárias do coração mouse

Este vídeo descreve o método rápido para isolar e cultivar os melanócitos e fibroblastos simultaneamente da pele do filhote de camundongo pós-natal. Essas células podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar a biologia celular da pele, cicatrização de feridas e melanoma.

Cultura Rápida de Melanócitos Murinos Primários e Fibroblastos: Isolamento de Melanócitos e Fibroblastos de Amostra de Pele Murina Inteira

Descrevemos a dissecção e ex vivo cultura de rato pele embrionária. O sistema mantém uma cultura de interface ar-líquido através da superfície do tecido e permite imagens em um microscópio invertido. Melanoblastos, um componente da pele em desenvolvimento, são marcadas por fluorescência, permitindo o seu comportamento a ser observada por meio de microscopia confocal.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Este trabalho descreve um protocolo in vitro de diferenciação para produzir pigmentadas, melanócitos maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas através de uma crista neural e melanoblasto estágio intermediário usando um protocolo sem alimentador de 25 dias.

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Um novo modelo esferoide tridimensional baseado na interação heteroplípica das células tumorais e fibroblastos estrômios é estabelecido. Aqui, apresentamos cocultura de células tumorais e fibroblastos estrômicos, imagens de lapso de tempo e microscopia confocal para visualizar a formação de esferoides. Este modelo tridimensional oferece uma plataforma pertinente para estudar interações tumor-stroma e testar a terapêutica do câncer.

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Este artigo relata que a adição de Y-27632 ao meio TIVA pode aumentar significativamente o rendimento de melanócitos de tecidos de pele adultos.

Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

Aprenda a gerar culturas primárias de melanócitos e fibroblastos de pele de camundongos recém-nascidos com este método rápido e simplificado. Ideal para estudos de biologia celular cutânea, pigmentação e cicatrização.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

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