カラム ・ クロマトグラフィで総脂質抽出物の精製

Earth Science

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Overview

ソース: ジェフ Salacup - マサチューセッツ大学アマースト校講座

有機溶媒抽出、総脂質抽出物 (TLE) の製品が多いが、さまざまな化合物の何千人もいない場合、何百もの複雑な混合物。研究者は頻繁にただ化合物の一握りに興味があります。関心の化合物は、アルカン、ケトン、アルコール、酸 (図 1) などの化合物のいくつかのクラスのいずれかに属する場合があります、それは、それが興味のある化合物の明確なビューを得るために属していない化合物クラスを削除する役に立つかもしれません。TLE が U が 1,000 の化合物を含めることができますたとえば、k'37海表面温度プロキシは 2 つだけの化合物 (アルケノンフラックス) に基づいており、TEX86海表面温度プロキシに基づいてのみ 4 (グリセロール ジアルキル グリセロール tetraethers)。研究者としての興味がない化合物の多くを削除するベきだと。これは他の無関係な化合物によって複雑になる可能性が低く関心 (アルケノンフラックスまたは GDGTs) の化合物の機器分析になります。

他のケースで上流浄化技術が今、私たちの前のビデオで鹸化中のカルボン酸の生産など、サンプルから削除したい化合物を作り出したことがあります。上記のケースの両方でカラム ・ クロマトグラフィと呼ばれる精製技術は非常に便利です。

Figure 1
図 1。認められる重要な官能。Killops と Killops1

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 地球科学の本質. カラム ・ クロマトグラフィで総脂質抽出物の精製. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

シリカゲル カラムクロマトグラフィーは、ゲルと呼ばれる微粉末シリカの固相の異なる個別の化合物クラス会を利用して浄化手法です。小ピペットには、ゲル (図 2) で約半分が読み込まれます。この列は、極冠の溶媒であり、しばしばヘキサン飽和します。サンプルは列で、ゲルの上に読み込まれ、溶媒の極性の増加のシリーズは順番に別の化合物のクラスに分けるためにサンプルを通過しました。分離は、固相または溶媒相の異なる化合物クラスの親和性に基づいています。極性化合物は、シリカをより強く結合し、したがって列から洗浄されるべきより多くの極性溶媒を取る。したがって、1 つの列と 1 つのサンプルを使って、そのサンプルに分割でき、分数のいくつか;たとえば、apolars (炭化水素)、半ば天体 (ケトン、アルコール) と天体 (酸とその他の機能性化合物)。

Figure 2

図 2。一度に最大 12 サンプルの精製ができるオーダーメイド ラックのイメージ。

カラムクロマトグラフィーは、土砂で見つかった化合物の複雑な混合物を浄化するための柔軟な手法です。彼らは列を移動し、各化合物の異なった化学クラスを含む分数に集められ、混合物を分離します。したがって、カラム ・ クロマトグラフィは多くの場合、目的の化合物の最初の分離の後追加精製ステップとして使用されます。有機は、総脂質抽出可能性があります多くの化合物の複雑な混合物などを抽出します。鹸化などのいくつかの浄化技術は、化合物分析機器に損傷を与えることができます、ので、解析の前に削除する必要がありますをご紹介します。このビデオは、脂質の抽出・精製・分析堆積物からのシリーズの一部です。総脂質抽出物を堆積サンプルから収集した後、目的の解析によってアルケノン、GDGTs の浄化にカラム ・ クロマトグラフィを使用します。

カラム ・ クロマトグラフィで化合物の混合物はシリカゲルなどの固体固定相に読み込まれます。有機溶剤などの移動相は、溶出、または削除、列からの化合物に使用されます。化合物が溶出されます順序はシリカゲルと溶離液の化合物の相互作用の強さに依存します。

溶出液は、分数、混合物から別の化合物を含むそれぞれに収集されます。化合物の特性に応じて単一溶剤が十分に分離を提供し、すべて興味の化合物の溶出します。それ以外の場合、複数の溶剤は、関心の各化合物の溶出が順番に使用されます。

極性化合物、電荷の分布が不均一であるは、極冠の化合物は吸着弱に対し極シリカゲルに強く吸着します。極性溶媒シリカゲルの高い親和性がある、したがって極冠溶剤よりもより強力な溶離液です。したがって、極性溶媒溶出極冠と極性化合物に対し、極冠溶剤は唯一極冠化合物を溶出します。

目的の化合物が極緩やか、極冠化合物洗浄しで極冠溶媒極性の溶媒を使用する前に。極性溶離液には酸など不要な高極性化合物の溶出を避けるため、最も極目的化合物のために必要以上に溶出力はなりません。

カラムクロマトグラフィーの原理を理解することは、シリカゲル カラムクロマトグラフィーによる脂質バイオ マーカー全脂質抽出物からの精製の手順を行ってみましょう。

有機汚染物質、燃焼ホウケイ酸ガラス ピペット、ホウケイ酸ガラスの瓶、550 ° C で 6 h のグラスウールを削除するにはガラスは使用の準備ができて、ピペットとバイアルを保持するラックを設定します。ピペットの球根を入手、ピンセット、ヘラ研究室、シリカゲル、ヘキサン、ジクロロ メタンおよびメタノールを清掃してください。清潔なピンセットでピペットの口の中にグラスウールの小さな房を配置します。緩やかなプラグを形成する別のピペットの幹とピペットの下にグラスウールを軽く押します。慎重に半分までピペットにシリカゲルをロードします。ラックのピペット アップライトを保護します。廃棄物収集用ピペットの先端の下 4 mL ホウケイ酸ガラスの瓶を固定します。別のホウケイ酸ガラス瓶でヘキサンの鹸化処理から乾燥試料の 10 mg までを中断します。サンプルは、バイアルの壁にくっついて場合、超音波照射 5 分バイアルクロマトグラフィーの手順を開始できます。

クロマトグラフィーを開始するには、気泡や不純物を削除するヘキサンの 3 巻でシリカゲルカラムを洗浄します。その後、廃棄物のバイアルを極冠分数の空バイアルに置き換えます。ガラス ピペットで列にサンプルをロードし、シリカゲルに吸収するサスペンションを許可します。作業列はプロシージャの間に乾燥しないように、早く。少量のヘキサンで 2 回サンプル瓶を洗浄し、各リンスを列に転送します。コレクションのバイアルがほぼいっぱいになるまで列にヘキサンを追加していきます。シリカゲルの入力が完了するヘキサンのすべてを許可します。その後、半ば極性成分の空バイアルで塗りつぶされたバイアルを交換します。次に、DCM のサンプル瓶を洗浄し、3 回列にそれを追加します。コレクションのバイアルがほぼいっぱいになるまで列に DCM を追加していきます。シリカゲルに浸漬終了する DCM を許可し、極一部の空バイアルで塗りつぶされたバイアルを交換します。メタノールと、このプロセスを繰り返します。

バイアルがほぼいっぱいになったら、バイアルに滴下を終了し、すべてのバイアルのキャップにメタノールを許可します。半ば極性成分には極一部で、GDGTs が目的のアルケノンには含まれています。特に汚れや複雑なアルケノンのサンプル、尿素の内転、解析の前との半ば極性成分を更に精製する必要があります。

カラム ・ クロマトグラフィは化学分析と精製法として使用されています。

単層カーボンナノ チューブまたは Cnt、ますます多くの産業で使用されるが、人間の健康への影響の懸念が高まっています。水と土で Cnt の変更のプロパティを変化させます。砂や土のような多孔質が Cnt を保持する方法も調べるため、列は固定相として多孔質土壌と準備されました。まず、分数は土壌によるカーボンナノ チューブの輸送を分析する列に CNT のソリューションの読み込み中に収集されました。まだ土に吸着 Cnt が溶出し、分数が土壌に残っていた Cnt 量分析します。結果は、CNT 表面の機能化と環境でトランスポート メカニズム間の関係に洞察力を貸します。

大小両方のスケールのカラム ・ クロマトグラフィを操作できるし、はこのために使用されるとき設計工業用合成。くもの絹は優れた引張強さ、靭性が産業規模で収穫することはできません。次の絹タンパク質合成、組換え絹蛋白質はアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、静止した段階の目的の分子だけをトラップはデザインされてにより精製しました。徹底的に洗浄し、溶出は、大きなスケールでクモの糸を回転させる純粋な蛋白を付与します。

カラム ・ クロマトグラフィの多くの固定相があります。1 つの固定相は、この iodoaziridine の合成などの広い置換範囲と合成のすべての潜在的な製品が適さない場合があります。粗生成物は様々 な固定相とプロトン NMR による評価分解混合されます。プロトン NMR は非常に敏感なため、多くの固定相が原油製品の少量を使用して製品の分解のため上映できます。カラム ・ クロマトグラフィ、小説および高反応性化合物の精製を許可する最適な固定相で実行されます。

総脂質抽出物の精製用のカラム ・ クロマトグラフィのゼウスの概要を見てきただけ。次のビデオは、アルケノンの複雑な混合をさらに浄化する方法を実演します。

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Procedure

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1. セットアップと材料の準備

  1. 総脂質抽出物 (TLE) を溶媒抽出法 (超音波、ソックスレー、または加速溶媒抽出 (ASE)) を使用してを取得します。
  2. 次の収集: 燃焼ホウケイ酸ガラス ピペットと球根、シリカゲル、ヘキサン、ジクロロ メタン (DCM) メタノール。
    1. これらの材料は、任意の化学の小売店から購入できます。試薬は、純粋で炭化水素から自由にする必要があります。
  3. また燃焼グラスウールと 4 mL ホウケイ酸ガラスの瓶を取得します。
  4. プロシージャの間に列とコレクション バイアルをサポートする手段を持っていることを確認します。たとえば、クランプと下劣なラック スタンド。多くのラボでは、いくつかの列とコレクション バイアル (図 2) を保持するカスタムメイドのラックを設計しました。これは多くの列を同時に実行することができます。

2. 方法

  1. 4 mL バイアルで乾燥のサンプルを開始します。サンプルの重量を量る場合以上 〜 10 mg の乾燥時、シリカゲルだけ有機物の有限質量反応できるよう、次の手順を実行する前に分割する必要があります。
  2. ヘキサンを少量のサンプルを中断します。これは、最初、この実験で少なくとも 3 つの溶媒の極性使用します。
  3. 超音波照射 5 分サンプルをサンプルのバイアルの中に立ち往生している場合、
  4. グラスウールの少量を清潔なピンセットのセットを使用してピペットの上部に読み込みます。プラグを形成する別のピペットを使用して、ピペットの底部にガラスウールを軽く押します。
  5. それが約半分がいっぱいになるまで慎重に、ピペットにシリカゲルを転送します。
  6. 4 mL 廃棄物収集バイアル] 列の下に配置します。
  7. ヘキサンの 3 巻でピペットでケイ酸ゲルを浸します。これは、列を条件空気の泡を削除し、シリカゲルを不純物をリンスします。
  8. 最終的な洗浄が終わったら、廃棄物収集バイアルを取り外して極冠割合を収集するバイアルを置き換えます。
  9. 慎重にピペットを使用して列にヘキサンでのサンプル全体を転送します。少量のヘキサンでサンプルバイアル 2 回以上を洗い、列に転送。シリカゲルに完全に浸るサンプルで移ったヘキサンを許可します。手順中に時間がない時をシリカゲルを乾燥する必要があります。
  10. 列の下コレクション バイアルがほぼいっぱいまでサンプルの上部にヘキサンを追加 (〜 4 mL)。
    1. 次の溶剤から始まる前にケイ酸ゲルを入力するヘキサンのすべてを許可します。
  11. 列の下中間極性コレクション バイアルを配置します。
  12. コレクション バイアルがほぼいっぱいになるまで、列の上部に DCM を追加します。もう一度、次の溶剤を開始する前にコレクションのバイアルを入力する DCM のすべてを許可します。
  13. 列の下極コレクション バイアルを配置します。
  14. 下劣なコレクションがほぼいっぱいになるまで、列の上部にメタノールを追加します。

Results

この浄化方法には、それぞれ異なる化合物クラスまたは化合物クラスのグループを含む 3 つの異なるバイアルが生成されます。計測器で分析するサンプルの複雑さは大幅に減少しています。このプロセスはまた、鹸化、その確度を低下、彼らの低揮発性のため、楽器の部品を実際に貼ることができます中に産生する酸などの化合物を削除します、精度と有効期間です。

Applications and Summary

アルケノン isoprenoidal GDGTs 堆積物の両方の非常に共通の成分であるし、世界の海を渡って見つけることができます。アルケノン検出されているますます湖堆積物中の生物の生産担当が海とこのように U の関係で異なるk'海からと別の湖の間でさえ37比と水温 (キャリブレーション) が違います。Isoprenoidal GDGTs が見つかったいくつかの大きい湖のアルケノン同様、ローカル校正を必要があります。

アルケノンと GDGTs に興味があるに出てケトン、極小数、それぞれ。海洋堆積物中の我々 はしばしば 1 つのサンプルから両方の海表面温度 (SST) のプロキシを分析します。これにより、時間によってコアのサイトで水温の進化を見る 2 つの独立した SST レコード、建設。複数プロキシ アプローチと呼ばれる、この比較はしばしば回 2 つのプロキシが同意するときのハイライトし、そうではない場合します。本契約または不一致自体の情報が含まれています。2 つのプロキシが同意する場合生産の生物が同じ深さの生息地を占領する多分または多分彼らは別々 の深さに住んでいたが十分に混合された水柱が温度の垂直方向の均質化につながった (水は通常の深さと冷却)。2 つのプロキシの反対、それは別の深さで 2 つの集団が住んでいたことかもしれない暖かく、浅い海に住んでいるとクーラーより深い水の中の 1 つ。またはそれは、年の異なる時間帯の間に化合物が生成されたことをことができるし、四季の温度を反映するようにします。これらの質問は、同じサイトで 2 つの異なる SST プロキシの分析によって作成された、彼らはケアの有機地球化学を強調表示し、古気候学者は、そのデータを解釈するときに取る必要があります。

極冠の炭化水素の高の相対的な安定性のためは、極冠分数には多くの興味深い有機化合物が含まれています。アルカン リーフの外側のワックス層の重要な成分である、彼らは多くの理由のため堆積物の記録に使用されます。彼らの平均鎖長 (炭素原子の数) には、水生・陸生植物, 温度、沈殿物の優位性に関する情報が含まれています。アルカン中の炭素の同位体比は、C3 と C4 植物のそれを生産する植物のタイプに関連し、水素の同位体比が地球の気温と降水量をローカルに関連。Steranes とホパンは極冠の一部でもあります。これらのバイオ マーカーは、hopanoids と、それぞれ原核生物と真核生物に重要な生化学的役割を果たすステロイドのような生理活性化合物の geostable バージョンです。

中極性画分には、私たちのアルケノンが含まれています。アルケノン、ケトン、U を介して古代の表面温度の重要なレコーダーk'37海表面温度プロキシ。はるかに少ない一般的には、いくつかのケトンはアルカンを行う、同じ葉のワックスから来る。

極一部には、別の重要なは、わずかにより少なく特定し困難アルカン (低揮発性) よりも使用するが、それにもかかわらずいくつかの同じ情報を関連付けることができます葉のワックスで構成、カルボン酸が含まれています。グリセロール ジアルキル グリセロール tetraethers (GDGTs) 極一部で、古代の水と空気の温度の別の重要なレコーダーです。

References

Killops, S. and Killops, V. Introduction to Organic Geochemistry. Blackwell Publishing, Malden, MA (2005).

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1. セットアップと材料の準備

  1. 総脂質抽出物 (TLE) を溶媒抽出法 (超音波、ソックスレー、または加速溶媒抽出 (ASE)) を使用してを取得します。
  2. 次の収集: 燃焼ホウケイ酸ガラス ピペットと球根、シリカゲル、ヘキサン、ジクロロ メタン (DCM) メタノール。
    1. これらの材料は、任意の化学の小売店から購入できます。試薬は、純粋で炭化水素から自由にする必要があります。
  3. また燃焼グラスウールと 4 mL ホウケイ酸ガラスの瓶を取得します。
  4. プロシージャの間に列とコレクション バイアルをサポートする手段を持っていることを確認します。たとえば、クランプと下劣なラック スタンド。多くのラボでは、いくつかの列とコレクション バイアル (図 2) を保持するカスタムメイドのラックを設計しました。これは多くの列を同時に実行することができます。

2. 方法

  1. 4 mL バイアルで乾燥のサンプルを開始します。サンプルの重量を量る場合以上 〜 10 mg の乾燥時、シリカゲルだけ有機物の有限質量反応できるよう、次の手順を実行する前に分割する必要があります。
  2. ヘキサンを少量のサンプルを中断します。これは、最初、この実験で少なくとも 3 つの溶媒の極性使用します。
  3. 超音波照射 5 分サンプルをサンプルのバイアルの中に立ち往生している場合、
  4. グラスウールの少量を清潔なピンセットのセットを使用してピペットの上部に読み込みます。プラグを形成する別のピペットを使用して、ピペットの底部にガラスウールを軽く押します。
  5. それが約半分がいっぱいになるまで慎重に、ピペットにシリカゲルを転送します。
  6. 4 mL 廃棄物収集バイアル] 列の下に配置します。
  7. ヘキサンの 3 巻でピペットでケイ酸ゲルを浸します。これは、列を条件空気の泡を削除し、シリカゲルを不純物をリンスします。
  8. 最終的な洗浄が終わったら、廃棄物収集バイアルを取り外して極冠割合を収集するバイアルを置き換えます。
  9. 慎重にピペットを使用して列にヘキサンでのサンプル全体を転送します。少量のヘキサンでサンプルバイアル 2 回以上を洗い、列に転送。シリカゲルに完全に浸るサンプルで移ったヘキサンを許可します。手順中に時間がない時をシリカゲルを乾燥する必要があります。
  10. 列の下コレクション バイアルがほぼいっぱいまでサンプルの上部にヘキサンを追加 (〜 4 mL)。
    1. 次の溶剤から始まる前にケイ酸ゲルを入力するヘキサンのすべてを許可します。
  11. 列の下中間極性コレクション バイアルを配置します。
  12. コレクション バイアルがほぼいっぱいになるまで、列の上部に DCM を追加します。もう一度、次の溶剤を開始する前にコレクションのバイアルを入力する DCM のすべてを許可します。
  13. 列の下極コレクション バイアルを配置します。
  14. 下劣なコレクションがほぼいっぱいになるまで、列の上部にメタノールを追加します。

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