Cultivos primarios neuronales

Neuroscience

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Summary

La complejidad del cerebro a menudo requiere neurocientíficos utilizar un sistema más sencillo para las observaciones y manipulaciones experimentales. Un enfoque potente es para generar una cultura primaria por disección de tejido del sistema nervioso, disociar en las células y las crecen células en vitro. Cultivos primarios hacen las neuronas y glia de fácil acceso a las herramientas experimentales necesarias para técnicas como la manipulación genética y la proyección de imagen de Time-lapse. Además, estas culturas representan un entorno altamente controlable estudiar fenómenos complejos como las interacciones célula-célula.

Este vídeo ofrece que un resumen de los principales pasos en la producción de cultivos neuronales primarios, que incluyen selección y disecar el tejido de interés, mecánicamente y químicamente rompiendo el tejido para producir una suspensión unicelular, las células de la galjanoplastia y mantenimiento de las culturas en los medios adecuados. También se presentan varios experimentos de ejemplo para mostrar cómo cultivos de células se puede utilizar para investigar tráfico de proteínas, cambios morfológicos y electrofisiología en neuronas vivas.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la Neurociencia. Cultivos primarios neuronales. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

El cerebro es uno de los órganos más complejos en el cuerpo, por lo que los neurólogos a menudo necesitan un sistema más sencillo para las observaciones y manipulaciones experimentales. Cultivo de células es un tal sistema que permite el fácil acceso a las neuronas vivas. En general, cultivo de las células implica crecimiento en soluciones especiales llamadas medio de cultivo dentro de un ambiente estéril, controlable – generalmente una incubadora caliente. Un cultivo primario es aquel que es producido a partir de tejido disecado de un organismo. Diferentes tipos de cultivos neuronales primarios se pueden hacer de una variedad de animales, etapas de desarrollo y los tejidos del sistema nervioso.

Este video le proporcionará una introducción al método de producción de cultivos neuronales primarios y algunos de los experimentos, que suelen utilizan estas células.

Muchos de los modelos animales importantes a la investigación de la neurociencia pueden usarse para preparar cultivos neuronales primarios. Con ratones y ratas, dos de los más utilizan en mamíferos en investigación biomédica – tejido neuronal de embriones, cachorros recién nacidos, y adultos pueden ser disecados para el cultivo. Embriones y crías perinatales son típicamente recomendado: puesto que las células del cerebro son inmaduros y menos susceptibles al daño.

Diversos tejidos del sistema nervioso pueden ser aislados y utilizados para producir diferentes tipos de cultivos neuronales primarios. Por ejemplo, partes específicas del cerebro pueden ser disectadas, como el cerebelo, la corteza y el hipocampo. La médula espinal o componentes del sistema nervioso periférico, como los ganglios de raíz dorsal, pueden ser disecados y cultivados para producir tipos específicos de neuronas.

Independientemente de la fuente de tejido, el método general para la producción de cultivos neuronales primarios puede resumirse en unos pocos pasos importantes: disección, la disociación, la galjanoplastia y el mantenimiento.

Vamos a comenzar una revisión en profundidad de estos pasos con el primero: disección. En la preparación para la disección y cultivo de pasos, la esterilidad es crítica para impedir la contaminación de las culturas. Herramientas deben ser esterilizadas con alcohol, y una campana de flujo laminar se utiliza a menudo para eliminar contaminantes en el aire.

Para el cultivo de roedores neuronas, tejido debe retirarse recién sacrificaron animales en una solución salina tamponada, frío. Usando un microscopio de disección, partes más pequeñas del tejido – como los hipocampos – pueden ser cuidadosamente aisladas para su posterior procesamiento.

A continuación, es necesario dividir la muestra en sus componentes celulares en un proceso conocido como disociación. El tejido disecado primero es picado con un bisturí o tijeras. Las piezas de tejido que luego se transfieren a un nuevo contenedor. Luego se agrega una enzima proteolítica como la papaína o la tripsina para digerir las proteínas de matriz extracelular que unen las células. Después de una corta incubación incubadora caliente o baño de agua, los pedazos de tejido se lavan suavemente con el tampón para eliminar las enzimas.

Las piezas de tejido reblandecido ahora pueden ser disociadas por trituración, que consiste en pasar el tejido por medio de una pipeta varias veces para que las células se liberan en una suspensión unicelular. En este punto, las células pueden contadas por concentración y comprueba la viabilidad con manchas como el Trypan azul, que ayuda a determinar cuánto la suspensión debe ser diluida para crecimiento exitoso.

¡Por último, las neuronas están listas para la cultura! Vamos a revisar algunas medidas importantes que deben tenerse para mantenerlos vivos y sanos. La composición de los medios de cultivo que se utiliza para crecer las neuronas es muy importante. Suplementos especiales que apoyan el crecimiento y la supervivencia neuronal generalmente se añaden a los medios de comunicación. Otros aditivos pueden incluir fármacos que inhiben la división de las células no neuronales como las células gliales.

Después de la suspensión de la célula neuronal se mezcla con los medios de comunicación, las células están listas para ser plateado en los envases deseados. Estos pueden incluir cultura platos y placas o vidrio cubreobjetos colocado dentro de estos contenedores. Puesto que las neuronas no pueden crecer directamente sobre el vidrio, los cubreobjetos son tratados previamente para crear superficies mejor para accesorio de celular y el crecimiento. Estos tratamientos pueden incluir capa con proteínas de matriz extracelular sintético; por ejemplo, poli-lisina y laminina; o grabado para desbastar la superficie.

Una vez plateado, las neuronas crecen dentro de una incubadora cálida, humidificada. Se observa el crecimiento de los procesos neuronales de horas a días. Para mantener los cultivos, una porción de los medios de cultivo se sustituye por medios frescos sobre una vez por semana. Normalmente, se utilizan cultivos primarios neuronales para experimentos en cualquier lugar desde unos pocos días a algunas semanas después de la galjanoplastia.

Ahora que tienes las neuronas crecen en las culturas, ¿qué puede hacer con estas células?

Un método básico que comúnmente se aplican a cultivos neuronales es manipulación genética por transfección o transducción viral. Material genético de codificación, por ejemplo, una proteína mutante, puede introducirse en las neuronas cultivadas para alterar la función neuronal. Por otra parte, transfección con ARN trenzado doble es una técnica eficaz para bloquear la expresión de la proteína. La disponibilidad de múltiples métodos y reactivos para manipulación genética hacen de esta una aplicación particularmente valiosa para una amplia variedad de preguntas de investigación.

¿Es una pregunta de ejemplo que puede ser abordada con transfecciones en cultivos neuronales: Cómo y dónde son ciertas proteínas o complejos proteicos traficados a distintas estructuras morfológicas de la neurona? Para obtener la respuesta, las neuronas son transfectadas con DNA codificando la proteína de interés, que se pueden fusionar con una proteína fluorescente como la proteína verde fluorescente o GFP. Los patrones de movimiento y localización de la proteína fluorescente etiquetado se pueden monitorizar con la proyección de imagen vivo. Este método puede utilizarse para estudiar, por ejemplo, el tráfico de receptores de neurotransmisores en la superficie celular.

Cultivos primarios neuronales son también muy útiles para los estudios de electrofisiología, en la que se puede medir la actividad eléctrica de las células utilizando microelectrodos. La sola capa de neuronas en una cultura significa que las células individuales son fáciles de destino, y manipulaciones como tratamientos farmacológicos se aplican rápidamente y uniformemente. Por ejemplo, el efecto de una sustancia de ensayo en la actividad de una neurona individual puede medirse con la técnica de patch clamp en neuronas cultivadas.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a cultivos neuronales primarios. En este video, hemos demostrado cómo se preparan estas culturas y los tipos de experimentos para los que se utilizan comúnmente. Cultivos primarios neuronales pueden hacerse de una gran variedad de fuentes de tejido, normalmente utilizando un método que consiste en la disección, disociación en una suspensión, y crecen en medios de cultivo en las incubadoras.

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