Overview
המורכבות של המוח דורשת לעתים קרובות מדעני מוח להשתמש במערכת פשוטה יותר עבור מניפולציות ניסיוניות ותצפיות. גישה חזקה אחת היא ליצור תרבית ראשונית על ידי ניתוח רקמת מערכת העצבים, ניתוקה לתאים בודדים, וגידול תאים אלה במבחנה. תרבויות ראשוניות הופכות נוירונים וגליה לנגישים בקלות לכלים הניסיוניים הנדרשים לטכניקות כמו מניפולציה גנטית והדמיה של זמן. יתר על כן, תרבויות אלה מייצגות סביבה בעלת שליטה רבה שבה ניתן לחקור תופעות מורכבות כגון אינטראקציות בין תאים.
וידאו זה מספק סקירה של השלבים העיקריים בייצור תרביות עצביות ראשוניות, הכוללות בחירה וניתוח של רקמת העניין, פירוק מכני וכימי של הרקמה כדי לייצר השעיה של תא אחד, ציפוי התאים ושמירה על תרביות באמצעי התקשורת המתאימים. מספר ניסויים לדוגמה מוצגים גם כדי להראות כיצד תאים בתרבית יכולים לשמש כדי לחקור סחר בחלבון, שינויים מורפולוגיים, ואלקטרופיזיולוגיה בנוירונים חיים.
Procedure
המוח הוא אחד האיברים המורכבים ביותר בגוף, ולכן מדעני מוח לעתים קרובות צריכים מערכת פשוטה יותר עבור מניפולציות ניסיוניות ותצפיות. פולחן תאים הוא מערכת אחת כזו המאפשרת גישה קלה לנוירונים חיים. באופן כללי, תאים פולחניים כרוכים בגידולם בפתרונות מיוחדים הנקראים מדיה תרבותית בתוך סביבה סטרילית וניתנת לשליטה – בדרך כלל אינקובטור חם. תרבית ראשונית היא כזו המיוצרת מרקמה שנותחתה מאורגניזם. סוגים שונים של תרביות עצביות ראשוניות יכולים להתבצע ממגוון בעלי חיים, שלבים התפתחותיים ורקמות מערכת העצבים.
וידאו זה יספק מבוא לשיטה של ייצור תרביות עצביות ראשוניות וחלק מהניסויים, אשר בדרך כלל משתמשים בתאים אלה.
רבים מהמודלים החייתיים החשובים למחקר מדעי המוח יכולים לשמש להכנת תרביות עצביות ראשוניות. עם עכברים וחולדות – שניים מהיונקים הנפוצים ביותר במחקר ביו-רפואי – ניתן לנתח רקמה עצבית מעוברים, גורים שזה עתה נולדו ומבוגרים לצורך פולחן. עוברים וגורים פרינטליים מועדפים בדרך כלל מכיוון שתאי המוח אינם בוגרים ופחות רגישים לנזק.
רקמות שונות של מערכת העצבים ניתן לבודד ולהשתמש כדי לייצר סוגים שונים של תרביות עצביות ראשוניות. לדוגמה, ניתן לנתח חלקים מסוימים של המוח, כגון המוח הקטן, קליפת המוח וההיפוקמפוס. חוט השדרה או מרכיבים של מערכת העצבים ההיקפית, כגון הגרעינים שורש גדש, יכול גם להיות ניתח ותרבית כדי לגדל סוגים ספציפיים של נוירונים.
ללא קשר למקור הרקמה, ניתן לסכם את השיטה הכללית לייצור תרביות עצביות ראשוניות בכמה שלבים עיקריים: דיסקציה, דיסוציאציה, ציפוי ותחזוקה.
בואו נתחיל סקירה מעמיקה של שלבים אלה עם הראשון: ניתוח. בהכנות לצעדי הניתח והפולחן, סטריליות היא קריטית כדי למנוע מתרבויות להיות מזוהמות. כלים חייבים להיות מעוקרים עם אלכוהול, ומכסה זרימה למינאר משמש לעתים קרובות כדי להסיר מזהמים נישאים באוויר.
עבור נוירונים מכרסמים culturing, רקמות צריך להיות מוסר מבעלי חיים המתת חסד טרי לתוך פתרון מלח קר, חוצץ. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, ניתן לבודד בזהירות חלקים קטנים יותר של הרקמה – כגון ההיפוקמפי – לעיבוד נוסף.
לאחר מכן, יש צורך לפרק את המדגם לתוך הרכיבים התאיים שלה בתהליך המכונה דיסוציאציה. הרקמה נותחת מושחתת תחילה באמצעות אזמל או מספריים. חלקי הרקמה המתקבלים מועברים לאחר מכן למיכל חדש. אנזים פרוטאוליטי כגון טריפסין או פפאין מתווסף לאחר מכן לעכל את חלבוני המטריצה החוץ תאיים הקושרים את התאים יחד. לאחר דגירה קצרה באינקובטור חם או אמבט מים, חתיכות הרקמה נשטפות בעדינות עם חוצץ כדי להסיר את האנזימים.
חלקי הרקמה המרוככים יכולים כעת להתנתק על ידי טריטורציה, הכוללת העברת הרקמה דרך צינור מספר פעמים, כך שהתאים משוחררים להשעיית תא בודד. בשלב זה, התאים ניתן לספור לריכוז ובדקו את הכדאיות באמצעות כתמים כמו כחול טריפן, אשר מסייע לקבוע כמה ההשעיה צריך להיות מדולל לצמיחה מוצלחת.
סוף סוף, הנוירונים מוכנים לתרבות! בואו נסקור כמה צעדים חשובים שיש לנקוט כדי לשמור אותם בחיים ובריאים. הרכב המדיה התרבותית המשמשת לגידול הנוירונים חשוב מאוד. תוספי מזון מיוחדים התומכים הישרדות עצבית וצמיחה מתווספים בדרך כלל לתקשורת. תוספים אחרים יכולים לכלול תרופות המעכבות את החלוקה של תאים שאינם עצביים כגון תאי גליה.
לאחר השעיית התא העצבי מעורבב עם התקשורת, התאים מוכנים להיות מצופים במיכלים הרצויים. אלה יכולים לכלול מנות תרבות וצלחות או כיסויי זכוכית להציב בתוך מיכלים אלה. מאז נוירונים לא יכולים לגדול ישירות על זכוכית, כיסויים מטופלים מראש כדי ליצור משטחים טובים יותר עבור חיבור התא וצמיחה. טיפולים אלה יכולים לכלול ציפוי עם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים סינתטיים; לדוגמה, פולי-ליסין ולמינין; או חריטת חומצה כדי להחוסך את פני השטח.
לאחר הציפוי, הנוירונים גדלים בתוך אינקובטור חם ולח. הצמיחה של תהליכים עצביים ניתן לראות בתוך שעות עד ימים. כדי לשמור על התרבויות, חלק מהתקשורת התרבותית מוחלפת בתקשורת טרייה בערך פעם בשבוע. בדרך כלל, תרבויות עצביות ראשוניות משמשות לניסויים בכל מקום בין כמה ימים לכמה שבועות לאחר ציפוי.
עכשיו שיש לך נוירונים הגדלים בתרביות, מה אתה יכול לעשות עם התאים האלה?
שיטה בסיסית אחת המיושמת בדרך כלל על תרביות עצביות היא מניפולציה גנטית על ידי טרנספקטציה או טרנסדוקציה ויראלית. קידוד חומר גנטי, למשל, חלבון מוטנטי, יכול להיות הציג לתוך הנוירונים בתרבית כדי לשנות את התפקוד העצבי. לחלופין, טרנספקטיון עם RNA כפול נטוש הוא טכניקה יעילה לחסימת ביטוי חלבון. הזמינות של שיטות מרובות ריאגנטים למניפולציה גנטית הופכת את זה ליישום בעל ערך מיוחד עבור מגוון רחב של שאלות מחקר.
שאלה לדוגמה שניתן לטפל בה עם טרנספקטים בתרבויות עצביות היא: כיצד והיכן חלבונים מסוימים או מתחמי חלבון מסוימים נסחרים למבנים המורפולוגיים השונים של הנוירון? כדי לקבל את התשובה, נוירונים מועברים עם DNA קידוד חלבון של עניין, אשר ניתן להתמזג עם חלבון פלואורסצנטי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP. דפוסי התנועה ולוקליזציה של חלבון מתויג פלואורסצנטית לאחר מכן ניתן לפקח עם הדמיה חיה. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד, למשל, את הסחר של קולטני נוירוטרנסמיטר אל פני השטח של התא.
תרביות עצביות ראשוניות שימושיות מאוד גם למחקרי אלקטרופיזיולוגיה, שבהם ניתן למדוד את הפעילות החשמלית של תאים בודדים באמצעות מיקרו-ectrodes. השכבה היחידה של נוירונים בתרבית פירושה שתאים בודדים קלים למיקוד, ומניפולציות כגון טיפולים תרופתיים מיושמות במהירות ובאופן שווה. לדוגמה, ההשפעה של תרכובת בדיקה על פעילות של נוירון יחיד ניתן למדוד עם טכניקת מהדק תיקון נוירונים מתורבתים.
הרגע צפית בהקדמה של JoVE לתרבויות עצביות ראשוניות. בסרטון זה הדגמנו כיצד תרבויות אלה מוכנות וסוגי הניסויים שעבורם הן נפוצות. תרביות עצביות ראשוניות יכולות להיעשות ממגוון רחב של מקורות רקמות, בדרך כלל באמצעות שיטה הכוללת ניתוח, ניתוק לתוך השעיית תא, וגדל במדיה תרבותית באינקובטורים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
