Pluripotencia inducida

Developmental Biology
 

Summary

Células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son las células somáticas que han sido genéticamente reprogramadas para formar células madre no diferenciadas. Como células madre embrionarias, iPSCs puede cultivarse en condiciones de cultivo que promueven la diferenciación en tipos celulares diferentes. Así, iPSCs pueden proporcionar una fuente potencialmente ilimitada de cualquier tipo de célula humana, que es un gran avance en el campo de la medicina regenerativa. Sin embargo, más investigación en la derivación y diferenciación de iPSCs todavía es necesario para realmente usar estas células en la práctica clínica.

Este video primero introduce los principios fundamentales detrás de reprogramación celular y luego muestra un protocolo para la generación de iPSCs de fibroblastos embrionarios de ratón distinguido. Finalmente, discutirán varios experimentos en los que los científicos son mejorar o aplicando técnicas de generación de iPSC.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología del desarrollo. Pluripotencia inducida. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Células madre pluripotentes inducidas, como células madre embrionarias humanas, pueden diferenciarse en casi cualquier célula en el cuerpo y por lo tanto sostienen la gran promesa en el campo de la medicina regenerativa.

Se obtienen células madre embrionarias humanas, o hESCs, desde antes de la implantación embriones, mientras que completamente diferenciado de las células somáticas se utilizan para generar células madre pluripotentes inducidas, que también se denominan iPSCs.

En este video vas a aprender acerca de los principios básicos detrás de generar iPSCs, un protocolo paso a paso para inducir la pluripotencialidad en células diferenciadas y algunas de las muchas aplicaciones downstream y modificaciones del presente Protocolo.

Vamos a empezar por discutir los principios de generación de iPSCs de tipos de células somáticas.

Las células diferenciadas como células de la piel o las neuronas, son las que cuya suerte se decide. Se han comprometido a realizar una función determinada. Por otro lado, células madre pluripotentes son las cuyo destino está decidido, y pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula.

El proceso de cambiar la identidad de una célula ya diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular. Se trata de cambiar el patrón de expresión génica en la célula, ya que el número y tipo de proteínas producidas por un juego de celular un papel importante en la definición de identidad de la célula.

Una de las formas para inducir la reprogramación celular es mediante la inducción de la expresión de ciertos factores de transcripción. Factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias reguladoras dentro de un gene. Algunas de estas secuencias se llaman "promotores" y por lo tanto promoción la transcripción de un gen. Algunos factores de transcripción pueden influir en la expresión de numerosos genes, que tiene un gran impacto en la identidad de la célula.

Los cuatro factores de transcripción clásica que se han demostrado para inducir pluripotencia son Oct4, Sox2, cMyc y Klf4. Estos factores también son conocidos como factores de Yamanaka, después el investigador que descubrió los efectos de la reprogramación.

Pueden utilizarse varios métodos para inducir la expresión de estos factores de transcripción. El método más común y eficiente es el uso de un virus modificado para entregar genes factor de la transcripción en el núcleo, donde integrará en el genoma.

En este método, los genes que codifican los cuatro factores de Yamanaka son individualmente empacados en diferentes retrovirus y añadidos a distinguir las células. Cuando las células se exponen a modificado el virus, una pequeña fracción de las células diferenciadas se infectan con todos cuatro transcripción factor-llevar virus. Empiezan a dedifferentiate hasta que se forman grandes grupos esféricos de células madre pluripotentes. La formación de cluster ayuda a iPSCs crear un microambiente que es similar a en vivo las células madre, y por lo tanto ayudarles a mantener su pluripotencia.

Ya que ahora entiendes los principios básicos detrás de la generación de iPSCs, Let ' s go mediante un protocolo general para la inducción de pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs, utilizando un sistema de transducción viral.

Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar a las células en su cuerpo, por lo que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.

Para iniciar el proceso de transfección, se elimina el medio de cultivo de una placa que contiene una alta densidad de MEFs, y las células se lavan con solución tampón. A continuación, se agrega una solución que contiene una enzima de degradación de proteínas, como tripsina, para levantar las células de la parte inferior del plato. Medio de cultivo se agrega luego a la placa, y las células separadas se transfieren a un tubo de centrífuga.

Tras la centrifugación, el sedimento se suspende de nuevo en el medio de cultivo. A continuación, se cuentan las células y la concentración se ajusta de modo que un número óptimo de células puede ser infectado con el virus al día siguiente. Incube las células durante la noche.

Después de que las células se han asentado en su nuevo plato, media vieja se sustituye por medios frescos y virus modificados que contienen los factores de transcripción deseada se agregan a la placa. Entonces se incuban las células con el virus por tiempo suficiente permitir la infección tendrá lugar. Después de la incubación, el medio que contiene virus gratis es eliminado y reemplazado con células madre embrionarias frescas medio.

Para 2-3 semanas siguientes a la transformación, las células deben ser cultivadas a 37 º en una incubadora, y los medios de cultivo deben cambiarse diariamente.

Después de este período de tiempo, colonias de iPSC que se parecen a las colonias de células madre embrionarias deberían ser lo suficientemente grandes como para ser recogidos. Las colonias pueden ser transferidas a una placa fresca que contiene medio con factores de crecimiento apropiados y permitió que creciera más. Para confirmar la pluripotencia, una porción de la población de células se tiñe con marcadores de pluripotencia.

Ahora que has visto cómo generar iPSCs de células diferenciadas, echemos un vistazo a algunas aplicaciones posteriores y modificaciones de este método altamente útil.

Una característica importante de iPSCs es que puede ser utilizados para generar casi cualquier célula en el cuerpo. Este ejemplo muestra la generación de células del músculo del corazón, llamado cardiomiocitos, de iPSCs. Para ello, el iPSCs se transfieren a las placas no adherente que les permiten a cuerpos embryoid forma, que son agregados de células madre pluripotentes. Los cuerpos de embryoid son cultivados en suero que contiene medio especializado y ácido ascórbico, que aumenta la diferenciación cardiaca. La diferenciación exitosa se puede observar fácilmente cuando algunas células comienzan a vencer.

Desde iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de células, también pueden formar un organismo entero, como un ratón. Esto puede hacerse usando un análisis llamado complementación tetraploide. En primer lugar, un embrión tetraploide, un embrión que contiene cuatro juegos de cromosomas, se forma mediante la fusión de dos células de un embrión temprano usando un campo eléctrico. El embrión tetraploide se permite desarrollar a la fase de blastocisto. iPSCs entonces se inyectan en el blastocisto, que luego es trasplantado a un destinatario femenino para la gestación. Las células tetraploides sólo son capaces de formar estructuras extraembrionarias como la placenta, por lo que los animales resultantes de este método se derivan enteramente de iPSCs.

Algunos investigadores modifican el procedimiento de reprogramación para facilitar el proceso de identificar las células reprogramadas con éxito más eficientes. Por ejemplo, en este experimento MEFs con la habilidad de expresar la proteína verde fluorescente bajo la influencia del promotor Oct4 ayudó a los investigadores a identificar fácilmente las células que han adquirido la pluripotencia.

Sólo has visto video de Zeus en la generación de células madre pluripotentes inducidas. Este vídeo repasa los principios detrás de este procedimiento y un protocolo paso a paso para generar iPSCs de células diferenciadas. También repasamos cómo este método podría aplicarse o modificado para experimentos en el laboratorio.

El descubrimiento de iPSCs ha tenido un impacto enorme en el campo de la biología de células madre, ya que tiene un enorme potencial para el desarrollo de terapias que se pueden emplear para tratar los trastornos degenerativos. Aunque se ha progresado mucho con iPSCs, el obstáculo que aún debe ser cruzado es el riesgo asociado de cáncer. Los actuales procedimientos de reprogramación tienen el potencial para resultar en el crecimiento de célula no regulada que puede resultar en cáncer. Por lo tanto, más investigación es necesaria para usar iPSCs clínicamente. ¡Como siempre, gracias por ver!

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